专利名称：高表达量的溶血素基因及其分泌表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人工改造合成的高表达量的化脓链球菌溶血素基因nslo，属于 医学微生物基因工程领域。本发明还涉及一种依上述基因构建的分泌型表达载体及其应 用，属于基因工程领域。
背景技术：
溶血素主要来自链球菌、金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌等。来自化脓链球菌 (Streptococcuspyogenes)的溶血素(Streptolysin O，SLO)是胆固醇依赖性的，能够与人及
其它动物的细胞膜上的胆固醇相结合，结合到细胞膜上的SLO蛋白分子会形成环状寡聚 体，形成大的孔道，导致细胞膜溶解，而且介导一些大分子(如NADase)通过细胞膜， 所以SLO是链球菌感染宿主过程中的重要毒素蛋白。SLO在医学研究和应用中具有广泛的应用价值，首先在医学与生物学研究中， SLO作为成孔蛋白，被用作打孔工具；其次，在诊断医学中，作为检测试剂，用来检测 被Streptococcuspyogenes感染的患者体内的抗SLO的抗体(anti-SLO)；再其次，可以用 做细胞自杀基因和自杀蛋白，研究其在控制肿瘤细胞繁殖中的应用。从天然链球菌中获得SLO的工艺成本高，得率低，具有不安全性。自1984年 以来，前人一直研究SLO在大肠杆菌原核系统中的表达，至目前，国内外研究人员已经 在原核系统中实现了 SLO与maltose-binding protein、GST-tag和6His_tag等表达标签的 融合表达。但是，在目前SLO的重组表达方法中，存在的显著缺点是表达产量始终比较 低，在0.3mg/mL以下，导致后期纯化应用难度较大。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种人工改造合成的，可在大肠杆菌中 高效表达的新的化脓链球菌溶血素基因nslo及其表达载体，该人工改造合成的nslo基 因，具有SEQ IDN0.1所示核苷酸序列。所述核苷酸序列使用了使用了大肠杆菌偏爱性密码子。使用所述溶血素基因nslo构建的表达载体。所述表达载体为分泌型载体，优选为pET_20b(+)。使用所述溶血素基因nslo或表达载体构建的转基因细胞系或基因工程菌。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种所述溶血素基因nslo或含有溶血 素基因nslo的表达载体在医学研究、疾病诊断和SLO抗体制品生产中的应用。本发明设计并合成了编码化脓链球菌溶血素的新基因nslo，构建了含该nslo基因 的分泌型表达载体和含该分泌型表达质粒的工程菌。表达结果表明，溶血素蛋白产量可 以达到3mg/ml，酶活达到2.4xl06HU/mL，Western和Elisa实验表明其抗原性显著，实 现了 SLO蛋白在原核生物大肠杆菌中高效率分泌性表达，适合工业化生产。
图lnslo/pET_20b (+)酶切鉴定图1 .DNA Marker ； 2.nslo/pET_20b (+) ； 3.nslo/pET_20b (+)双酶切。图2nslo/pET_20b (+)物理图谱图3重组表达SLO摇瓶发酵的SDS-PAGE图谱1.蛋白 Marker ； 2.pET_20b (+) /BL21 (DE3)的胞内上清；3.nslo/pET_20b (+) / BL21(DE3)的胞内上清。
具体实施例方式以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制 本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆 手册所述的条件进行操作。实施例Insl0基因设计以 Streptococcus pyogenes NZ131 菌株 slo 基因序列 232_1673bp 为起始序列(1-231 序列编码的氨基酸序列与SLO的溶血活性与抗原性不相关)，在mRNA的二级结构分析 的基础上，用65个大肠杆菌偏爱密码子替换slo基因内部的大肠杆菌稀有密码子，得到新 的人工改造设计的化脓链球菌溶血素基因nslo，序列见SEQIDN0.1，全长1485个核苷 酸，编码495个氨基酸，替换的碱基和相关的密码子在nslo和NZ131菌株slo基因的比对 图(图1)中进行了标记。实施例2nslo基因合成与克隆由于nslo基因与原slo基因相比，变动较大，不便于使用突变技术，因此使用 化学合成法一步合成nslo基因，将合成的nslo基因与pMD18T (Takara)载体连接，转化 JM109，转化产物涂布含lOOg/mL氨苄青霉素的LB平板，经过37°C培养过夜，得到单克 隆转化子nslO/pMD18T/JM109，经过菌落PCR鉴定，质粒酶切鉴定和测序鉴定，表明新 合成的nslo基因全长为1485bp，编码495氨基酸，测定的序列和设计序列完全相同。实施例3分泌表达SLO蛋白的载体构建用于实现nslo基因在大肠杆菌中分泌性表达的载体是pET_20b⑴，该载体带有 pelB信号肽和His-tag标签，将pET_20b(+)质粒和nslo/pMD18T用NocI和NotI切，酶切 产物切胶回收，再用T4连接酶连接，连接产物转化E.coliJM109感受态细胞，经过37°C 培养过夜，挑选转化子，通过菌落PCR鉴定，质粒酶切鉴定(见图2)和测序鉴定，保存 鉴定的 nslo/pET_20b (+) /E.coli JM109 菌，提取 nslo/pET_20b (+)备用。实施例4分泌表达SLO蛋白的工程菌构建将质粒nslo/pET_20b (+)转化大肠杆菌宿主BL21 (DE3)，再在100g/mL氨苄 青霉素的LB平板，经过37°C培养过夜，经过菌落PCR鉴定，得到单克隆转化子nslo/ pET-20b (+) /BL21 (DE3)。实施例5发酵与SLO蛋白的分离纯化1、摇瓶发酵
将nslo/pET-20b⑴/BL21 (DE3)接种在LB培养基中37 °C液体培养过夜，后接 入 TB (甘油 5g/L，蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，K2HP04 12.54g/L, KH2P04 2.31g/L) 发酵液体培养基，37°C培养到细菌OD_到0.8，用0.5mM IPTG(异丙基硫代β-D半乳 糖苷)诱导，降温至15°C培养，48h时产酶达3mg/mL以上，SDS电泳图谱见图4。2、分离纯化将表达后的培养液离心，得到上清用0.45um膜过滤，过滤后的溶液按照1 1 的比例和 2X Binging buffer (IOmM 咪唑，lMNaCl，40mM Tris-HCL)混勻备用；His-tag 亲和层析柱用5倍柱体积的IX charging buffer(50mM NiS04)处理后，再用倍柱体积IX Binding buffer(2.5mM 咪唑，0.5M NaCl, 20mM Tris-HCL)平衡；上样品后用 10 倍柱体 积 IX Binging buffer 洗柱，再用 5 倍柱体积 IX Washing buffer (60mM 咪唑，0.5M NaCl, 20mM Tris-HCL)洗柱；用 6 倍柱体积 IX Elution buffer(lM 咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)洗脱。实施例6酶活测定、Western、Elisa鉴定重组表达的SLO蛋白抗原性SLO 样品可用溶液 A(溶液 A 36mM H3PO4, 126mM NaCl, lg/L BSA(bovine seramalbumin)，pH 7.0)进行系列梯度稀释。将 0.5ml 的 I5OmM 2-mercaptoethanol 与 Iml
稀释样品混勻，30°C孵育15min，然后每管加0.5ml含绵羊红细胞的A溶液(158X IO8ceIl/ ml)30°C下反应20min，离心后，用541nm检测上清中血红蛋白的浓度。IU定义为在该 实验条件下，引起上述反应体系中50%红细胞溶解的酶量所需要的酶量。经测定，ImL 菌液的酶活为2.4x106HU以上。Western和Elisa实验结果为阳性，表明其具有抗原性。实施例7nsl0基因在医学研究、疾病诊断中的应用用nslo基因构建SLO表达工程菌，通过发酵生产SLO蛋白。SLO蛋白是医 学研究和临床使用的重要生物学试剂。利用SLO蛋白，作为抗原，可以检测患者体内 ASO (抗SLO蛋白的抗体)，以此诊断链球菌感染引起的变态反应和最近是否存在链球菌 感染。实施例Snslo基因SLO抗体制品生产中的应用将纯化得到的SLO蛋白，免疫动物，纯化免疫血清，得到SLO抗体。nslo基因SLO抗体制品生产中的应用可参考下列文献1 .Kimoto H, Fujii Y，Hirano S，Yokota Y，Taketo A.Expression of recombinant StreptolysinO and specific antibody production.J Mol Microbiol Biotechnol.2005 ； 10(1) 64-8.2.Velazquez B, Massaldi H, Battistoni J, Chabalgoity JA.Construction and expression ofrecombinant streptolysin—o and preevaluation of its use in immunoassays.Clin Diagn Lab Immunol.2005 May ； 12(5) 683-4.
权利要求
1.一种人工改造合成的化脓链球菌溶血素基因nslo，具有SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的溶血素基因nslo，其特征在于所述核苷酸序列使用大肠杆菌 的偏爱性密码子。
3.含有权利要求1所述溶血素基因nslo的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为分泌型载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于优选为pET_20b(+)。
6.含有权利要求1所述溶血素基因nslo或权利要求5所述表达载体的转基因细胞系。
7.含有权利要求1所述溶血素基因nslo或权利要求5所述表达载体的基因工程菌，优 选为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.权利要求1所述溶血素基因nslo或权利要求5所述表达载体在医学研究、疾病诊断 和溶血素抗体制品生产中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种高表达量的溶血素基因及其分泌表达载体和应用，属于遗传工程领域。本发明是以来自Streptococcus pyogenes NZ131菌株slo基因序列为模板(Streptococcuspyogenes NZ131，complete genomeNCBI accessionNC_011375.1)，利用大肠杆菌优化密码子替换其56个大肠杆菌稀有密码子，设计并合成了编码化脓链球菌溶血素的新基因nslo，构建了含该nslo基因的分泌型表达载体和含该分泌型表达质粒的工程菌。表达结果表明，蛋白表达产量可以达到3mg/mL以上，酶活可达到2.4×106HU/mL。本发明实现了nslo的高效表达，可广泛引用于与医学研究和疾病诊断，适合工业化生产。
文档编号C07K16/06GK102010870SQ201010211058
公开日2011年4月13日 申请日期2010年6月28日 优先权日2010年6月28日
发明者康贻军, 王欢莉, 赵庆新 申请人:盐城师范学院