甘蓝型油菜抗病相关基因BnERF56及其应用的制作方法

专利名称：甘蓝型油菜抗病相关基因BnERF56及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程和生物技术领域。具体涉及一种增强植物对菌核病抗性 的BnERF56基因，同时还涉及一种增强植物对菌核病抗性的BnERF56基因的制备方法，还涉 及BnERF56基因在增强植物对核盘菌抗性、对灰霉菌抗性中的应用。
背景技术：
植物通过激活一系列抗性响应来抑制病原侵染，达到自我保护的目的(Feys， B. J. , and Parker, J. E. Interplay of signal ing pathways in plant disease resistance. Trends Genet. 2000. 16 :449_455.Glazebrook，J.Genes controlling expression of defense responses in Arabidopsis-2001 status. Curr. Opin. Plant Biol. 2001. 4 :301-308.)对特异病原的识别启动了这些快速的细胞反应，激活了一个或者 多个抗性信号传导途径，导致了一系列抗性基因的快速诱导表达(Bostock，R. M-Signal crosstalk and induced resistance :Straddling the line between cost and benefit. Annu. Rev. Phytopathol. 2005. 43 :545_580 Rojo, E.，Solano，R.，and Sanchez—Serrano， J. J. Interactions between signaling compounds involved in plant defense. J. Plant Growth Regul. 2003. 22 :82_98)。这些抗性途径主要被水杨酸，茉莉酸，乙烯，和他们的衍生 物所调节(Thatcher LF, Anderson JP, Singh KB Plant defense responses :What have we learnt from Arabidopsis ？ Funct Plant Biol 2005，31 :1—19)。他们与不同的病源 抗性相关，大量研究表明，水杨酸在植物抵抗活体营养型病源的局部和系统获得性抗性中 发挥着关键作用(Durrant W. Ε. , and Dong，X. Systemic acquired resistance. Annu. Rev. Phytopathol. 2004. 42 185-209. Gaffney T.，Friedrich, L，Vernooij, B.，Negrotto, D.， Nye，G.，Uknes，S.，Ward，Ε·，Kessmann，H.，and Ryals,J. Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance. Science 1993. 261 :754_756)； 而诱导系统性抗性依赖于茉莉酸和乙烯信号途径，这两种激素信号途径对于植物抵抗腐生 型病源，如灰毒等，是很重要的(Thomma B.，Eggermont, K.，Penninckx, I.，Mauch-Mani, B.，Vogelsang, R.，Cammue, B.，and Broekaert, W. Separate jasmonate—dependent and salicylate-dependent defense-response pathways in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998. 95 15107-15111. Thomma B.，Eggermont，K.，Tierens，K.，and Broekaert，W. Requirement of functional ethylene-insensitive 2 gene for efficient resistance of Arabidopsis to infection by Botrytis cinerea. Plant Physiol. 1999. 121 :1093_1102·)。然而，这 种简单的二分法，把SA和MJ/ET信号割裂幵来，即认为他们分别针对于活体营养型和腐 生营养型病源的看法，可能过于简单；最近，水杨酸信号也被发现参与了对腐生营养型病 源灰霉的局部抗性，用水杨酸处理后显著的抑制了灰霉的侵染(Ferrari S.，Plotnikova, J. M. ,De, L. G. , and Ausubel, F. Μ. Arabidopsis local resistance to Botrytis cinerea involves salicylic acid and camalexin and requires EDS4 and PAD2,but not SID2,EDS5 or PAD4. Plant J. 2003. 35 193-205.)。病源的侵染激活的不是一个单一的信号途 径，而是一个复杂的相互作用的信号网络。 植物的抗性调节是复杂的，牵涉进大量的转录因子家族(Singh KB, Foley RC, Ori ate-Sa ‘ nchez L(2002)Transcription factors in plant defense and stress responses. Curr Opin Plant Biol 5 :430_436)，鉴定和利用关键的转录因子，对于改 造农作物，提高抗性是非常重要的，其中一个被利用的转录因子家族就是乙烯响应因子 (ERF)家族，它属于AP2/ERF超家族的一部分。在拟南芥中，AP2/ERF超家族大约有147 个成员，他们编码的蛋白有不同的功能，相关于植物的整个生命过程，包括调节发育(van der Graaff E，Dulk-Ras AD, Hooykaas PJ, Keller B(2000)Activation tagging of the LEAFY PETIOLE gene affects leaf petiole development in Arabidopsis thaliana. Development 127 4971-4980 Banno H， Ikeda Y， Niu QW, Chua NH(2001)Overexpression of Arabidopsis ESRl induces initiation of shoot regeneration. Plant Cell 13 2609-2618)，响应于非生物压力，如干旱，寒冷等(Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，Abe H， Miura S， Yamaguchi-Shinozaki K， Shinozaki K(1998)Two transcription factors， DREBl and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought—and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell 10 1391-1406 Stockinger EJ, Gilmour SJ, Thomashow MF(1997) Arabidopsis thaliana CBFl encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/ DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit. Proc Natl Acad Sci USA 94: 1035-1040)，生物压力，如真菌侵染(Berrocal-Lobo MiMolina AiSolano R Constitutive expression of ETHYLENE-RESP0NSE-FACT0R1 in Arabidopsis confers resistance to several necrotrophic fungi. Plant J, 200229 23~32 Luis Onate-Sanchez, Jonathan P. Anderson, Jodi Young，and Karam B· Singh氺 AtERF14，aMember of the ERF Family of Transcription Factors， Plays a Nonredundant Role in PlantDefense Plant Physiology,2007,143 ；400-409, Martial Pre 丨,Mirna Atallah, Antony Champion, Martin De Vos2, Corne r M.J. Pieterse, and Johan Memelink* The AP2/ERF Domain Transcription Factor 0RA59Integrates Jasmonic Acid and Ethylene Signals in Plant Defense Plant Physiology，2008，147 ;1347_1357)。AP2/ERF 超家族都含有一个 AP2/ERF保守结构域，它由60-70个氨基酸组成，与DNA结合相关；AP2/ERF超家族被分成 ERF，AP2，和RAV三个亚家族。ERF亚家族包含了所有的抗病相关的AP2/ERF基因(Gutterson N，Reuber TL，Regulation of disease resistance pathways by AP2/ERF transcription factors. Curr Opin Plant Biol，2004，7 :465_471)。ERFl 和 0RA59 被证明是拟南芥中茉 莉酸和乙烯信号的节点，组成型表达ERFl激活了一系列抗性相关基因的表达，包括PDF1. 2 and ChiB，显著增强了对灰霉等真菌的抗性(Solano，R.，Stepanova, A.，Chao, Q. M. and Ecker,J. R. (1998)Nuclear events in ethylene signaling :a transcriptional cascade mediated by ETHYLENE-INSENSITIVE3 and ETHYLENERESP0NSE-FACT0R1. Genes Dev， 12，3703—3714. Berrocal-Lobo M，Molina A，Solano R(2002)Constitutive expressionof ETHYLENE-RESP0NSE-FACT0R1 in Arabidopsis confers resistance to several necrotrophic fungi. Plant J 29 :23_32 Lorenzo O, Piqueras R, Sanchez-Serrano JJ, Solano R(2003)ETHYLENE RESPONSE FACT0R1 integrates signals from ethylene and jasmonate pathways in plant defense. Plant Cell 15:165-178 Martial Pre', Mirna Atallah, Antony Champion, Martin De Vos2, Corne' M. J. Pieterse, and Johan Memelink* The AP2/ERF Domain Transcription Factor 0RA59Integrates Jasmonic Acid and Ethylene Signals in Plant Defense Plant Physiology,July 2008,Vol. 147, pp. 1347-1357)。在拟南芥中组成型表达 AtERF2 (McGrath KC, Dombrecht B, Manners JM, Schenk PM, Edgar Cl, Maclean DJ, Scheible WR, Udvardi MK, Kazan K(2005)Repressor-and activatortype ethylene response factors functioning in jasmonate signaling and disease resistance identified via a genome-wide screen of Arabidopsis transcription factor gene expression. Plant Physiol 139 :949_959)禾口 AtERF14 (Luis Onate-Sanchez, Jonathan P. Anderson, Jodi Young, and Karam B.Singh* AtERF14, aMember of the ERF Family of Transcription Factors, Plays a Nonredundant Role in Plant Defense Plant Physiology, January 2007，Vol. 143，pp. 400—409)也被 艮道 引起高水平的抗性相关基因PDF1. 2和ChiB的表达；然而，AtERF4却抑制抗性相关基因 PDFL 2 的表达(McGrath KC,Dombrecht B,Manners JM, Schenk PM,Edgar CI,Maclean DJ, Scheible WR, Udvardi MK, Kazan K Repressor—and activatortype ethylene response factors functioning in jasmonate signaling and disease resistance identified via a genome-wide screen of Arabidopsis transcription factor gene expression. Plant Physiol. 2005. 139 949-959)，暗示ERF家族的成员对抗性相关基因的调节作用是 多样的，由正调控，也有负调控。菌核病是一种类似于灰霉的腐生营养型真菌，这种破坏性病源侵染超过400种植 物，分布广泛。油菜是最世界上重要的油料作物之一，菌核病造成油菜的根，茎和角果的 腐烂，导致了巨大的产量损失。尽管菌核病严重威胁了农业生产，植物对核盘菌的寄主抗 性的分子机制，我们依然知之甚少。暨今为止还没有发现完全免疫或者高抗的油菜栽培 品禾中(Liu, S.，Wang, H.，Zhang，J.，Fitt, B. D.，Xu, Z.，Evans, N.，Liu, Y.，Yang，W.，and Guo, X. 2005. In vitro mutation and selection of doubled—haploid Brassica napus lines with improved resistance to Sclerotinia sclerotiorum. Plant Cell Rep. 24 133-144.)，因此，探究植物对这种病源的抗性机制，发现新的抗性基因具有深远意义。因此，本发明开发了一个增强植物对腐生营养型真菌抗性的BnERF56基因。通过 荧光定量PCR检测该基因在主要在根，茎，叶中表达；核盘菌侵染后显著诱导该基因的表 达；该基因的超表达显著提高了病源相关基因PDF1. 2，ChiB, PR-I and PR-2的表达，增强 了对腐生营养型真菌核盘菌和灰霉的抗性。预示着该基因在油菜抗性育种中具有相当的应 用前景。

发明内容
本发明的目的是在于提供了一种增强植物对腐生营养型真菌抗性的BnERF56基 因，该基因在核盘菌侵染过程中被诱导表达，该基因的组成型表达可以增强植物对腐生营养型真菌核盘菌和灰霉的抗性，应用于抗性育种。本发明的另一个目的是在于提供了一种油菜BnERF56基因的制备方法，根据本实 验室进行甘蓝、甘蓝型油菜和白菜型油菜基因组测序结果提供的基因片段序列信息，通过 BLAST比对油菜的EST数据库，获得油菜全长序列的电子克隆后，应用简单的PCR方法即可 以获得该基因的序列。本发明的再一个目的是在于提供了一种油菜BnERF56基因在增强植物对腐生营 养型真菌核盘菌的抗性中的应用。BnERF56基因的超表达显著增强了植物对核盘菌的抗性。本发明的再一个目的是在于提供了一种油菜BnERF56基因在增强植物对腐生营 养型灰霉菌的抗性中的应用。BnERF56基因的超表达显著增强了植物对灰霉菌的抗性。为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案为了获得本发明，申请人对油菜菌核病抗性相关基因进行了深入和全面的研究， 结果发现了一个新基因，该基因在核盘菌侵染后被显著诱导表达，该基因超表达显著提高 了病源相关基因PDF1. 2，ChiB, PR-I and PR-2的表达，增强了对腐生营养型真菌核盘菌和 灰霉的抗性。根据本发明的一个方面，上述目的可以通过提供植物核盘菌响应基因来实现，所 述基因含有SEQ ID No. 1核苷酸序列或与SEQ ID No. 1实质上同源的核苷酸序列。根据本发明的一个方面，上述目的可以通过提供植物核盘菌响应蛋白来实现，所 述的蛋白含有SEQ ID No. 2核苷酸序列或与SEQ ID No. 2实质上同源的氨基酸序列。根据本发明的另一个方面，上述目的通过提供含有BnERF56基因超表达重组载体 0X-BnERF56 (申请人构建)来实现对植物体中BnERF56基因表达量的抑制。根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述重组载体0X_BnERF56 转化的微生物(根癌农杆菌EHA105，购自大连宝生物生物制品有限公司，以下相同)来实现 对拟南芥以及其他植物的转化，从而增强拟南芥以及其他植物中BnERF56基因的表达量。根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述微生物(包含有 0X-BnERF56重组载体的根癌农杆菌EHA105)转化的转基因植物来实现对核盘菌抗性的调 控，获得抗性转基因植株。一种增强植物对菌核病抗性的BnERF56基因在增强植物对核盘菌抗性、对灰霉菌 抗性中的应用，其步骤是1、油菜BnERF56基因的克隆在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨至粉状，利用Trirol提取试剂盒(购自 Invitrogen公司，以下相同)的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于无RNase的双蒸 水中。DNase I (购自Promega公司，以下相同)去除可能残留的DNA。用蛋白检测仪(DU 650BECKMAN,USA)分别检测RNA在260纳米和280纳米光吸收值，结合(质量体积比) 琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以获得的RNA为模板进行逆转录，得到的cDNA分 装后于-20°C保存备用。根据GenBank中拟南芥AtERF56基因序列(at5g61600)，在NCBI网站上用 BLASTN(http://www, ncbi. nlm. nih. rov/BLAST)与本实验室测序获得的甘蓝、甘蓝型油菜 和白菜型油菜基因片段序列进行比对，获得与拟南芥AtERF56基因序列5'端同源的甘蓝 型油菜的CDS (Coding sequence，编码序列，以下相同)序列以及和拟南芥AtFRF56基因序列3'端同源的甘蓝型油菜的CDS序列。然后根据获得的甘蓝型油菜BnERF56基因的CDS 序列与拟南芥AtERF56基因起始密码子和终止密码子同源区域设计引物，从而确保扩增 产物为全长序列。以甘蓝型油菜的根、茎、叶、花、角果的cDNA为模版，进行PCR扩增。回 收并纯化扩增的PCR产物，连接到pMDIS-T载体上(购自Promega公司，以下相同)，用冻 融法转化大肠杆菌(J.萨姆布鲁克.D. W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三 版)科学出版社，96-99)，涂布于含有氨苄青霉素50yg/mL的LB固体(配方如下分别称 取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于 1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121°C，6. 859X104Pa下高压消毒15分钟。4°C冷 藏备用)平板上，37°C培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测所用引物序列为M13F 5' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 ；M13R 5，-GTAAAACGACGGCCAGT-3，以下相同)，反应体 系为10XTaq 酶反应缓冲液 2ul、25mM MgCL2 1. 2ul、2mM dNTP 1. 5ul、IOuM 引物 0. 2ul、 0.3单位Taq酶，加无菌水至20 μ 1。反应程序为94°C变性5min，94°C 45s、55°C 45s,72°C 2min 32循环，72°C延伸5min (以下相同)。以M13F/M13R为引物(前面已述)，将连接过的 PMD18T载体进行序列测定，分析结果，获得了一种分离的基因，其序列为SEQ ID No. 1所示 的核苷酸序列。利用NCBI的开放阅读框，寻找程序(ORF founder)确定BnERF56基因的开 放阅读框，推导出核苷酸序列编码的多肽，一种分离的多肽，其序列为SEQ ID No. 2所示的 氨基酸序列。根据获得的上述核苷酸序列(SEQ ID No. 1)，通过构建BnERF56超表达植物重组载 体(0X-BnERF56)，转化拟南芥，申请人获得23株转基因拟南芥，分别接种腐生真菌核盘菌 和灰霉菌进行抗病鉴定，结果显示BnERF56超表达显著增强了转基因拟南芥对核盘菌和灰 霉菌的抗性。对蛋白质的分子量和理论等电点进行在线计算(http://us. expasyorg/tools/ pi tool.htm)。 用 NCBI 的 Conserved Domains 工具(http://wwwncb.inlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb. cgi)在线进行保守区域分析结果表明该基因属于乙烯响应因子 (ERF)家族；通过Blastx程序对NCBI的NR数据库进行同源性比对，并对具有同源性、不同 物种来源的抗病相关的ERF蛋白DNAMAN进行多序列比对；用Prosite软件在线分析该蛋白 质的基本结构域。结果如图1，2，3。2、油菜BnERF56基因的表达模式本发明所用油菜为甘蓝型油菜(Brassica napus L. ) zhongshuang 9。供试材料播 种于大田，正常田间管理。从同一大田生长条件相同的可育植株上取根、茎、叶、花、角果，每种材料至少取三 个重复，每个重复至少一株，取样后用锡箔纸包裹，迅速放置于液氮中，-80°C保存。利用 Trirol提取试剂盒(前面已述)的要求进行RNA的提取。PCR仪为DNA-Engine (BIO-RAD)，采用油菜Actin作为内标基因(登 录号 AFl 11812)，Actin 基因引物为 5 ‘ -CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3 ‘和 5' -ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG-3‘。BnERF56 基因引物为 5‘ -TGAAGATAGATGGCAACTAAGCA AGAAG-3'和 5 ‘ -AATTCAGAAGTTTCAAGTAGCGGAGC-3‘。半定量PCR反应每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技 术重复。分别检测BnERF56在油菜组织(根、茎、叶、花、角果)中的表达。结果如图4所示，
7BnERF56主要在根种表达，其次是茎和叶，花和角果中基本不表达。3、BnERF56基因的表达受核盘菌侵染诱导。对菌核病不同抗性的甘蓝型油菜品种M083(高抗)和84039 (高感)由中国农业 科学院油料作物研究所生物技术育种课题组提供，核盘菌菌核培养采用PDA培养基。PDA培 养基(1L)配方马铃薯200g，蔗糖10-20g，琼脂粉17-20g，双蒸水1000g ；将去皮马铃薯切 成小块，加水800ml，煮沸0. 5h，用纱布滤去残渣，加水补足1000ml，然后加入糖和琼脂，加 热使琼脂完全融化，趁热分装，高压灭菌后备用。菌核病不同抗性的油菜品种M083和84039种子采用土壤盆栽，严格控制其生长 条件，油菜生长至四叶一心期时进行菌丝块活体接种处理。分别在接种后0、6、24、72h等 不同时间点取局部叶，每种材料至少取三个重复，取样后用锡箔纸包裹，迅速放置于液氮 中，-80°C保存。利用Trirol提取试剂盒(前面已述)的要求进行RNA的提取。DNasel消 化后进行逆转录反应，得到的cDNA分装后于-80°C保存备用。荧光定量PCR仪为RTTM-Cycler(博奥)，采用油菜Actin作为内标基 因(登录号 AF111812)，Actin 基因引物为 5 ‘ -CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3 ‘ 禾口 5 ‘ -ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG-3 ‘ 。 BnERF56 基因 引物为 5 ‘ -GGAGGAAGAGACGGTGCCGGTTAGG-3 '和 5 ‘ -GCGGAGCTGGGAGACGTCGGAGTTA-3 ‘。焚光定 量PCR反应每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。分别 检测BnERF56基因在不同抗性品种中，侵染后不同时间点的表达。用比较Ct法(A A Ct)计算基因的相对表达量。通过2_A ACt估算目的基因的相对 表达量禾口系统误差(Kenneth J Livak. Thomas D Schmittgen. 2001,Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the AcT Method. METHODS 25,402-408.)。在计算相对表达量时，以未接种的样本为参照，即将其值转换成 1(标准值)，其它样品再与其比较，获得相对表达值。结果如图5所示，BnERF56是一个在 受核盘菌侵染诱导的基因，在抗性品种中的表达高于感性品种中的表达，表明BnERF56是 一个抗性相关基因。4、BnERF56基因超表达载体(0X_BnERF56)的构建和根癌农杆菌菌株EHA105转化 (购于上海沪尚生物科技有限公司)构建的重组载体是将实验室构建的质粒PG4A (Zheng Wang，Han Mao，Caihua Dong, Ruiqin Ji, Li Cai,Hao Fu,and Shengyi Liu Overexpression of Brassica napus MPK4 Enhances Resistance to Sclerotinia sclerotiorum in Oilseed Rape MPMI, 22 (3)，2009，235-244.)上的目的基因用前期克隆得到的BnERF56基因替换而来。为完成此 目的，首先用Pstl/Xhol双酶切克隆的BnERF56基因片段，同时用Pstl/Xhol酶切PG4A质 粒(前面已述)。酶切反应在37度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用琼脂糖胶电泳 检测。将酶切后的BnERF56基因片段和PG4A质粒(前面已述)上切下的大片段用DNA凝 胶回收试剂盒(前面已述)回收。把BnERF56基因片段比PG4A质粒(前面已述)载体片 段按3 1(摩尔浓度比)的比例混合样品，加入T4DNA连接酶5单位，10X反应缓冲液，无 菌水补充体积至20i!L，16°C连接过夜。转化后，在含有卡那霉素(50i!g/mL)固体LB平板 上筛选，挑斑做菌落PCR，以及提质粒，酶切验证正确的重组质粒命名为0X-BnERF56，并对 获得的载体进行测序以验证准确性。载体结构如图6。
然后利用冻融法(前面已述)将0X-BnERF56转入根癌农杆菌EHA105(购自大连宝 生物生物制品有限公司，以下相同)，涂布于含有50 u g/mL卡那霉素和利福平(50 u g/mL) 的LB固体(配方如下分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂 依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121 °C，6. 859X104Pa 下高压消毒15分钟。4°C冷藏备用)平板上，37°C培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR 检测(前面已述)。本发明所使用的研究BnERF56基因功能的重组植物表达载体，含有所述BnERF56 基因的编码区核苷酸序列，组成型35S启动子可以增强BnERF56基因的表达水平。该载体 大小适合，在植物中易与转化，所带有的除草剂标记基因Bar表达强度高，容易检测。通过 这个载体转化拟南芥可以获得菌核病抗性增强的拟南芥转基因植株。5、BnERF56基因超表达载体(0X-BnERF56)的遗传转化参照文献中的方法进行拟南芥转化(Zhang X. R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature,2006, 1 1-6)。制备含有构建好载体的根癌农杆菌EHA105(前面已述)菌液，在转化前一天转 入含有卡那霉素50 u g/ml、利福平50 u g/ml的LB液体培养基中，28°C过夜培养。第二天， 用紫外分光光度计(SPEK0L 1300)于276nm纳米波长下检测的吸光值，当菌液的吸光值达 到在1.6-2.0之间时取出。室温(20-25 °C，以下相同)以4000g离心lOmin，弃上清，将沉 淀悬浮于等体积的5%蔗糖(质量体积比)中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化 前加入终浓度为0.02% (体积比)的Silwet L-77(购自北京五洲元业科贸中心，以下相 同)。混勻后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15s，取出植株。转化 后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方 培养。隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5 天。将转化收获的T0代种子播在混有PNS营养液的蛭石中，(PNS营养液成份为每升含 5ml 1M KN03，2ml 1M Ca(N03)2 4H20,2ml 1M MgS04 7H20，2. 5ml 20mM Fe. EDTA,2. 5ml 1M磷酸缓冲液(pH5.5)，lml MS微量元素)；4°C春化一星期，在21_22°C的生长间中自然生 长两星期左右，待到达四叶期的早期进行除草剂草胺磷(30mg/L)的喷洒第一次，一星期之 后进行第二次喷洒。两次喷洒后对存活的绿苗进行PCR阳性检测，获得拟南芥转基因阳性
田o6、BnERF56基因超表达载体(0X_BnERF56)转化苗的筛选及PCR鉴定根据本实 验室进行的除草剂草胺磷浓度梯度筛选实验，确定除草剂(草胺磷，购自拜尔公司，以下相 同)筛选浓度为30mg/L。T1代植株在苗期(播种后10天)喷施30mg/L除草剂，得到成活 植株°米用 CTAB法(M. G. Murray and ff. F. Thompson, Rapid isolation of high molecular weight plant DNA, _Nucleic Acids Research, 1980, Vol. 8, No. 194321-4326，以下相同) 提取筛选后存活的拟南芥以及野生型拟南芥叶片DNA。根据表达载体上外源BnERF56基因 序列，设计引物进行 PCR 检测(序列为 F-5 ‘ TGAAGATAGATGGCAACTAAGCAAGAAG3 ‘ R-5 ‘ MTT CAGAAGTTTCAAGTAGCGGAGC‘)，预期扩增长度为680bp。将经过PCR检测的阳性植株编号并 标记。7、BnERF56基因的超表达增强了病源相关蛋白表达通过荧光定量PCR验证干扰效率并观察转基因拟南芥T1代表型。观察结果显示，在正常生长状况下，各BnERF56基因超表达转基因植株与野生型植株并无明显差异；PCR鉴 定后获得转基因T2代超表达(0X-BnERF56)各个株系的幼苗。摘取这些幼苗的叶片，速冻于 液氮中，用Q-PCR对目标基因BnERF56的表达水平进行分析。具体方法如下取经过PCR检 测后获得的T2代阳性植株的叶片，在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨至粉状，利用Trirol 提取试剂盒的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于无RNase的双蒸水中。DNase I去 除可能残留的DNA。用蛋白检测仪(DU 650 BECKMAN,USA)分别检测RNA在260纳米和280 纳米光吸收值，结合(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以获得的 RNA为模板进行逆转录(前面已述)，得到的cDNA分装后于_20°C保存备用。荧光定量PCR仪为RTTM-Cycler (博奥)，采用拟南芥Act in作为内标基因。BnERF56 引物为 5 ‘ -GGAGGAAGAGACGGTGCCGGTTAGG-3 '和 5 ‘ -GCGGAGCTGGGAGACGTCGGAGTTA-3 ‘； 拟南芥 PDF1. 2 引物为 5 ‘ -TGTTCTCTTTGCTGCTTTCGACG-3 ‘ 禾P 5' -GCATGATCCATGTTTGGCTCCT-3‘；拟南芥ChiB 引物为 5‘ -ATCAGCGCTGCAAAGTCCTTC-3‘ 和 5 ‘ -GTGCTGTAGCCCATCCACCTG-3 ‘；拟南芥冊_1 引物为 5 ‘ -TTCTCCCTCGAAAGCTCAA-3 ‘ 和 5 ‘ -AAGGCCCACCAGAGTGTATG-3 ‘；拟南芥冊_2 引物为 5 ‘ -AAGGAGCTTAGCCTCACCAC-3 ‘ 和 5 ‘ -CCCGTAGCATACTCCGATTT-3‘；荧光定量PCR反应体系为20iiL:含有SYBR Mix 10 y L，正反向引物(10 ii mol/L) 各0. 8 ii L，模板2 u L，DEPC处理过的无菌水补足至20 u L。扩增条件为94°C，5min ；94°C 15s,60°C 20s,72°C 30s，40个循环；每个循环于72°C复性末端进行荧光检测。反应结束后 先加热到95°C，然后降至72°C，再缓慢升温至95°C，记录荧光信号的变化，得出扩增产物的 熔解曲线。每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。用比较Ct法(A ACt)计算基因的相对表达量。利用仪器所带软件，首先优化内 标基因和目的基因扩增条件，分别测定Actin和目的基因的Ct值，选取九次实验测定值中 最为接近的三次结果(Ct值系统误差小于0. 3)取平均值，然后通过内标基因对目的基因 进行校正得到A ACt，最后通过2_AAet估算目的基因的相对表达量和系统误差(前面已 述)。在计算相对表达量时，以野生型拟南芥叶片的样本为参照，即将其值转换成1，其它样 品再与其比较，获得相对表达值。结果显示BnERF56超表达效率非常明显，如图7所示而 BnERF56基因超表达转基因植株中，BnERF56的表达被显著上调17-30倍，相应的，病源相关 蛋白PDF1. 2，ChiB, PR-1和PR-2的表达也显著上调；表明BnERF56基因的超表达增强了病 源相关蛋白表达8、BnERF56基因超表达显著增强植株对腐生型真菌核盘菌和灰霉菌的抗性核盘菌(Scleortinia sclerotiorum)菌核采自武汉大田油菜茎杆；选完好菌核， 先用75%酒精(体积比)泡1分钟，再用0. 1% HgC12消毒8-10分钟，无菌水冲洗3-5次。 把灭菌菌核切去两端，中间部分切成绿豆大小，切面朝下，接种于Minimal平板。通常每粒 菌核接一板，一次接种8-9板。于22°C静置培养3-4天，当菌核即将铺满平板时，用cj^mm 打孔器沿菌丝外缘打孔，取菌丝块，用于接种。Minimal培养基(1L)配方NaOH lg，DL_苹 果酸3g，NH4N03 2g，MgS04 7H20 0. lg，细菌琼脂粉39g ；按顺序将上面药品溶于盛有800ml 的蒸馏水中，在加药品时，加入的药品充分溶解后再加入下一种药品，药品加完后加水补足 lOOOmL，然后加入细菌琼脂粉，于117°C灭菌15min。灰霉菌(B.cinerea)由华中农业大学李国庆教授提供，来源于武汉大田油菜叶片。菌株培养在PDA培养基上(前面已述)，28°C培养8d。用无菌水从培养基上洗脱灰霉 病原孢子，配制成含5X105 and 1X106 spores mL—1的孢子悬浮液待用。拟南芥0X_BnERF56超表达株和野生型WT播种于23°C光照培养室内保湿培养(每 天16h光照，8h黑暗)；选取4周龄的拟南芥苗(包括0X-BnERF56超表达株和野生型WT)用 于核盘菌和灰霉的接种实验，每种基因型至少接种12株，每株接种两片叶，试验重复三次。 对于核盘菌接种，菌丝生长在mini培养基上，直径约2mm的含有核盘菌菌丝的琼脂块被接 种到叶的近轴表面；对于灰霉接种，菌丝生长在PDA培养基上，PDA培养基上收集的孢子用 水稀释到5X105 and 1X106 spores mL—1，接种时先将叶用细针刺伤，然后每个接种点滴加 3ul的灰霉孢子的悬浮液。核盘菌和灰霉菌接种植物都需要保持高湿，温度和光照与接种前 保持一致。发病后不同时间统计病斑面积，结果如图8和图9，与野生型相比，0X-BnERF56 超表达株显著增强了对核盘菌和灰霉的抗性，表明BnERF56是腐生型真菌核盘菌和灰霉的 抗性相关基因。本发明的优点1通过克隆该基因，研究该基因在植物抗病中的作用，明确了该基因具有增强植株 对腐生型真菌的抗性的功能。通过该基因的过表达，申请人可以人工创造抗性增强材料，为 实现抗性分子育种提供新的抗性基因。2通过克隆该基因，研究该基因对核盘菌侵染的响应，以及在抗性品种和感性品种 中受核盘菌侵染得诱导表达水平。即研究其在植物抗病响应中的表达，从而在植物抗腐生 病害中应用。3通过构建该基因的超表达载体(0X_BnERF56)，转化拟南芥，获得有效的的超表 达(0X-BnERF56)转基因植株，为研究基因功能提供了一个有效的方法。4、通过对转基因拟南芥进行的核盘菌和灰霉的抗病接种鉴定，得到了该基因的超 表达显著增强植物对腐生真菌核盘菌和灰霉抗性的结果。说明该基因是植物的抗性相关基 因。


图1为一种BnERF56与其它ERF基因的氨基酸保守区的比对图，表明BNERF56基 因与其它ERF基因在ERF保守结构域上高度相似。图2为一种BnERF56与其它ERF基因的蛋白质全序列的比对图，表明BNERF56基 因与其它ERF基因在蛋白序列上由差异。图3BnERF56与其它ERF基因的蛋白质序列系统进化树分析图，表明BNERF56基因 与其它ERF基因在蛋白序列上由差异。图4为一种甘蓝型油菜BnERF56基因的组织特异性表达电泳图。泳道根，茎，叶， 花，角果分别代表经根，茎，叶，花，角果组织的cDNA的PCR扩增结果；图5为一种BnERF56的表达对和核盘菌侵染的响应图。Y轴表示BnERF56基因的 相对表达量，X轴核盘菌侵染的后不同时间点。图6为一种BnERF56基因超表达载体0X_BnERF56的构建示意7为一种BnERF56超表达转化株中，BnERF56基因和病源相关蛋白基因的相对 表达水平图。Y轴表示BnERF56基因的相对表达量，X轴表示不同株系。A图是BnERF56基因的相对表达水平图，B图是PDF1. 2基因的相对表达水平图，C图是ChiB基因的相对表达 水平图，D图是PR-1基因的相对表达水平图，E图是PR-2基因的相对表达水平图。图8为一种BnERF56基因超表达和干扰转化株的核盘菌的抗病鉴定图。Y轴表示 病斑面积，X轴接种后不同时间。图9为一种BnERF56基因超表达和干扰转化株的灰霉菌的抗病鉴定。Y轴表示病 斑面积，X轴接种后不同时间。
具体实施例方式根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本 发明，而不是对本发明的限制。实施例1.一种油菜抗性相关基因BnERF56的克隆和表达模式分析1、一种油菜抗性相关基因BnERF56的克隆根据Trirol提取试剂盒(前面已述)的要求进行RNA的提取，具体方法如下分 别取0. 05-0. lg的根、茎、叶、花、角果样品，在液氮中研磨至粉状，根据Trirol提取试剂盒 的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于60uL的无RNase的双蒸水中。DNase I去除可 能残留的DNA。用蛋白检测仪(DU 650 BECKMAN,USA)分别检测RNA在260纳米和280纳米 下的光吸收值，结合(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以上述获 得的RNA为模板按下列方案进行逆转录2 ii g RNA中加1 y L Oligo (dT)，70°C温育5min， 立即置于冰上 5min，短暂离心，加入 5XM-MLV Buffer 4u L, dNTP (lOmmol/L) 1 u L, RNase Inhibitor 20单位，M-MLV逆转录酶(购自Promega公司)200单位，用DEPC处理过的无菌 水补至总体积20 u L，混勻，42°C温育lh，70°C水浴15min，得到的cDNA分装后于_20°C保存 根据GenBank中拟南芥AtERF56基因序列(at5g61600)，在NCBI网站上用 BLASTN(http://www. ncbi. nlm. nih. rov/BLAST)与本实验室测序获得的甘蓝、甘蓝型油菜 和白菜型油菜基因片段序列进行比对，获得与拟南芥AtBNERF56基因序列5'端同源的甘 蓝型油菜的CDS (Coding sequence，编码序列，以下相同)序列以及和拟南芥AtERF56基因 序列3'端同源的甘蓝型油菜的CDS序列。然后根据获得的甘蓝型油菜BNERF56基因的CDS 序列与拟南芥BNERF56基因起始密码子和终止密码子同源区域设计引物，从而确保扩增产 物为全长序列。油菜BnERF56扩增引物序列分别为5‘ -TGAAGATAGATGGCAACTAAGCAAGAAG-3' (5'端引物)；5' -AATTCAGMGTTTCAAGTAGCGGAGC-3‘ (3'端引物)。PCR程序为94°C， 5min ；94°C，45s，55°C，45s，72°C，lmin，33 个循环；72°C，10min。结果如图 1 所示。PCR 反应 产物在的(质量体积比)低熔点琼脂糖上电泳，把扩增产物条带从胶上切下放入1. 5ml Eppendoff离心管中，65°C水浴15min，加入等体积苯酚(PH7. 9)，颠倒摇勻5min，13000转/ 分钟离心8分钟，取上清，加入等体积氯仿异戊醇(体积比24 1)颠倒摇勻5min，13000 转/分钟离心8分钟，取上清，加入1/10体积的3摩尔/升醋酸钠(PH5. 2)溶液，2倍体积预 冷的95% (质量体积比，以下相同)乙醇，混勻后置-20°C冰箱中20min以上，13000转/分 钟离心15分钟，倒掉95% (前面已述)乙醇后再用75% (质量体积比，以下相同)乙醇浸洗 沉淀，自然风干，DNA沉淀溶于20 ill无菌去离子水。按pMD18-T(购自TaKaRa公司)载体说明书，连接到PMD18-T载体上，转化大肠杆菌(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译 分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，96-99)。方法如下通过菌落PCR挑选阳性克隆， 引物序列为M13F 5' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 ；M13R 5’ -GTAAAACGACGGCCAGT-3)， 反应体系为10XTaq 酶反应缓冲液 2ul、25mM MgCL2 1. 2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM 引物 0.2111、0.3单位1&卩酶，加无菌水至20111。反应程序为94°C变性5min，94°C 45s、55°C 45s、72°C 2min 32循环，72°C延伸5min。每个PCR产物分别挑选3个克隆摇菌并提取质粒， 测序，获得BnERF56基因全长序列，一种分离的基因，其序列为SEQ ID No. 1所示核苷酸序 列。利用NCBI的开放阅读框，寻找程序(ORF founder)确定BnERF56基因的开放阅读框，推 导出核苷酸序列编码的多肽，一种分离的多肽，其序列为SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。根据获得的上述核苷酸序列(SEQ ID No. 1)，通过构建BnERF56超表达植物重组载 体(0X-BnERF56)，转化拟南芥，申请人获得23株转基因拟南芥，分别接种腐生真菌核盘菌 和灰霉菌进行抗病鉴定，结果显示显著增强了转基因拟南芥对核盘菌和灰霉菌的抗性。对蛋白质的分子量和理论等电点进行在线计算(http://us. expasyorg/tools/ pi tool.htm)。 用 NCBI 的 Conserved Domains 工具(http://wwwncb.inlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb. cgi)在线进行保守区域分析结果表明该基因含有一个保守的ERF 结构域，属于乙烯响应转录因子(ERF)家族；通过Blastx程序对NCBI的NR数据库进行同 源性比对，并对具有同源性、不同物种来源的ERF蛋白用ClustalXl. 83进行多序列比对； 用Prosite软件在线分析该蛋白质的基本结构域。根据上述方法分析结果显示该基因 的开放读码框所推导的蛋白质序列编码218个氨基酸。在线计算蛋白质的分子量大约为 24155Da，理论等电点约为10. 08。BLASTp在线分析软件将推导的编码蛋白与Genebank中 的序列进行同源性比较，发现该序列与AtBNERF56、ERFl、0RA59、AtERF4、AtERF5、AtERF14、 Pti4和Tsil的蛋白质氨基酸序列在ERF保守结构域上的同源性分别达到91. 4%,68. 9%, 70. 7%,74. 1%,84. 5%,75. 9%,74. 和63. 8%，见图1 ；但是在蛋白全序列上相似性较 低，分别为 68. 2%,25. 7%,24. 8%,23. 4%,21. 5%,28. 4%,23. 2%和 26. 2%，见图 2 ；表明 BnERF56是一个新的未知功能的ERF转录因子。对已克隆的BnERF56蛋白进行系统树分析 表明BnERF56与拟南芥AtPABP5具有高度的同源性，BnERF56和AtPABP5可能有相似的功 能，见图3。实施例2.一种油菜抗性相关基因BnERF56的表达模式和病菌侵染响应模式分析1、一种油菜抗性相关基因BNERF56的表达模式分析本发明所用油菜(Brassica napus L.)为甘蓝性油菜中双9号。供试材料播种于
大田，正常田间管理。从同一大田生长条件相同的可育植株上取根、茎、叶、花、角果，每种材料至少取三 个重复，每个重复至少一株，取样后用锡箔纸包裹，迅速放置于液氮中，-80°C保存。提取 RNA(方法前面已述)。PCR仪为DNA-Engine (BI0-RAD)，采用油菜Actin作为内标基因(登 录号 AF111812)，Actin 基因引物为 5 ‘ -CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3 ‘和 5' -ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG-3‘。BnERF56 基因引物为 5‘ -TGAAGATAGATGGCAACTAAGCA AGAAG-3'和 5 ‘ -AATTCAGAAGTTTCAAGTAGCGGAGC-3‘。
PCR反应体系为10iiL，正反向引物(10umol/L)各0. 4 ii L，模板1 ii L，加无菌水 补足至 10iiL。扩增条件为:94°0，51^11:941，308，551，308，721，508，25个循环。分别检 测BNERF56在油菜组织(根、茎、叶、花、角果)中的表达。半定量PCR反应每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技 术重复。分别检测BnERF56在油菜组织(根、茎、叶、花、角果)中的表达。结果如图4所示， BnERF56主要在根种表达，其次是茎和叶，花和角果中基本不表达。2、BnERF56基因的表达受核盘菌侵染诱导。对菌核病不同抗性的甘蓝型油菜品种M083(高抗)和84039 (高感)由中国农业 科学院油料作物研究所生物技术育种课题组提供，核盘菌菌核培养采用PDA培养基(前面 已述)。菌核病不同抗性的油菜品种M083和84039种子采用土壤盆栽，严格控制其生长 条件，油菜生长至四叶一心期时进行菌丝块活体接种处理。分别在接种后0、6、24、72h等 不同时间点取局部叶，每种材料至少取三个重复，取样后用锡箔纸包裹，迅速放置于液氮 中，-80°C保存。利用Trirol提取试剂盒(前面已述)的要求进行RNA的提取。DNase I消 化后进行逆转录反应，得到的cDNA分装后于-80°C保存备用。荧光定量PCR仪为RTTM-Cycler (博奥)，采用油菜Actin作为内标基 因(登录号 AF111812)，Actin 基因引物为 5 ‘ -CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3 ‘ 禾口 5 ‘ -ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG-3 ‘ 。 BnERF56 基因 引物为 5 ‘ -GGAGGAAGAGACGGTGCCGGTTAGG-3 '和 5 ‘ -GCGGAGCTGGGAGACGTCGGAGTTA-3 ‘。焚光定 量PCR反应体系为20ii L 含有SYBR Mix 10yL，正反向引物(10iimol/L)各0. 8yL，模板 2iiL，DEPC处理过的无菌水补足至20iiL。扩增条件为94°C，5min ;94°C 15s，60°C 20s， 72°C 30s，40个循环；每个循环于72°C复性末端进行荧光检测。反应结束后先加热到95°C， 然后降至72°C，再缓慢升温至95°C，记录荧光信号的变化，得出扩增产物的熔解曲线。每组 实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。分别检测BnERF56基 因在不同抗性品种中，侵染后不同时间点的表达。用比较Ct法(A ACt)计算基因的相对表达量。利用仪器所带软件，首先优化内 标基因和目的基因扩增条件，分别测定Actin和目的基因的Ct值，选取九次实验测定值中 最为接近的三次结果(Ct值系统误差小于0. 3)取平均值，然后通过内标基因对目的基因进 行校正得到A ACt，最后通过2_AAet估算目的基因的相对表达量和系统误差(前面已述)。 在计算相对表达量时，以水处理的拟南芥叶片样本为参照，即将其值转换成1，其它处理样 品再与其比较，获得相对表达值。结果如图5所示，BnERF56是一个在受核盘菌侵染诱导的 基因，在抗性品种中的表达高于感性品种中的表达，表明BnERF56是一个抗性相关基因。实施例3 一种抗性相关的BnERF56基因在增强植物对核盘菌抗性、对灰霉菌抗性中的应 用，其步骤是l、BnERF56基因超表达载体(0X_BnERF56)的构建和根癌农杆菌菌株EHA105转化 (购于上海沪尚生物科技有限公司)构建的重组载体是将实验室构建的质粒PG4A (Zheng Wang，Han Mao，Caihua Dong,Ruiqin Ji,Li Cai,Hao Fu,and Shengyi Liu Overexpression of Brassica napusMPK4 Enhances Resistance to Sclerotinia sclerotiorum in Oilseed Rape MPMI, 22 (3)，2009，235-244.)上的目的基因用前期克隆得到的BnERF56基因替换而来。为完成此 目的，首先用Pstl/Xhol双酶切克隆的BnERF56基因片段，同时用Pstl/Xhol酶切PG4A质 粒(前面已述)。酶切反应在37度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用琼脂糖胶电泳 检测。将酶切后的BnERF56基因片段和PG4A质粒(前面已述)上切下的大片段用DNA凝 胶回收试剂盒(前面已述)回收。把BnERF56基因片段比PG4A质粒(前面已述)载体片 段按3 1(摩尔浓度比)的比例混合样品，加入T4 DNA连接酶5单位，10X反应缓冲液， 无菌水补充体积至20iiL，16°C连接过夜。转化后，在含有卡那霉素(50iig/mL)固体LB平 板上筛选，挑斑做菌落PCR，以及提质粒，酶切验证正确的重组质粒命名为0X-BnERF56，并 对获得的载体进行测序以验证准确性。载体结构如图6。然后利用冻融法(前面已述)将0X_BnERF56转入根癌农杆菌EHA105(购自大连宝 生物生物制品有限公司，以下相同)，涂布于含有50 u g/mL卡那霉素和利福平(50 u g/mL) 的LB固体(配方如下分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂 依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121 °C，6. 859X104Pa 下高压消毒15分钟。4°C冷藏备用)平板上，37°C培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR 检测(前面已述)。本发明所使用的研究BnERF56基因功能的重组植物表达载体，含有所述BnERF56 基因的编码区核苷酸序列，组成型35S启动子可以增强BnERF56基因的表达水平。该载体 大小适合，在植物中易与转化，所带有的除草剂标记基因Bar表达强度高，容易检测。通过 这个载体转化拟南芥可以获得菌核病抗性增强的拟南芥转基因植株。2、BnERF56基因超表达载体(0X-BnERF56)的遗传转化参照文献中的方法进行拟南芥转化(Zhang X. R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature,2006, 1 1-6)。制备含有构建好载体的根癌农杆菌EHA105(前面已述)菌液，在转化前一天转 入含有卡那霉素50 u g/ml、利福平50 u g/ml的LB液体培养基中，28°C过夜培养。第二天， 用紫外分光光度计(SPEK0L 1300)于276nm纳米波长下检测的吸光值，当菌液的吸光值达 到在1.6-2.0之间时取出。室温(20-25°C，以下相同)以4000g离心lOmin，弃上清，将沉 淀悬浮于等体积的5%蔗糖(质量体积比)中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转 化前加入终浓度为0.02% (体积比)的Silwet L-77(购自北京五洲元业科贸中心，以下 相同)。混勻后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15s，取出植株。转 化后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地 方培养。隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥 3-5天。具体流程如下①把利福平配制成为50Mg/ml的浓缩液，放于4度保存，使用前要吹打均勻，稀释 100倍使用。②在5ml的LB液体培养基中加入5微升利福平浓缩液，摇勻，挑入单菌落，活化过夜。③看到活化的菌液很混浊时，吸出不少于2ml活化的菌液，加入在200ml的LB液 体培养基中，28度200转培养过夜至0D值1. 6-2. 0。
④4000g室温离心10分钟(台式离心机SIGMA2-16K)，4500转，弃上清，在滤纸上 扣干。⑤配制好5% (质量体积比)蔗糖溶液200毫升，将上一部收集获得的沉淀溶解， 用枪吹打均勻。⑥将溶解好的菌液加到平皿中，50毫升溶液/平皿，然后加入40微升的 SiLwet-L-77 (前面已述)混勻。⑦将拟南芥的植株的花序浸入平皿中，用手将分枝的花拢在一起，轻轻浸入其中 15秒。⑧用不透明的袋子将每一个质粒转化的拟南芥植株套好，避光保湿一天即可。⑨一个星期后再重复转化一次。将转化收获的TO代种子播在混有PNS营养液的蛭石中，(PNS营养液成份为每升 含 5ml 1M KN03，2ml 1M Ca(N03) 2 .4H20，2ml 1M MgS04 .7H20，2. 5ml20mM Fe. EDTA, 2. 5ml 1M磷酸缓冲液(pH5.5)，lml MS微量元素)；4°C春化一星期，在21_22°C的生长间中自然生 长两星期左右，待到达四叶期的早期进行除草剂草胺磷(30mg/L)的喷洒第一次，一星期之 后进行第二次喷洒。两次喷洒后对存活的绿苗进行PCR阳性检测，获得拟南芥转基因阳性
田o转化苗的筛选及PCR鉴定根据本实验室进行的除草剂草胺磷浓度梯度筛选实 验，确定除草剂(草胺磷，购自拜尔公司，以下相同)筛选浓度为30mg/L。T1代植株在苗期 (播种后10天)喷施30mg/L除草剂，得到成活植株。PCR检测筛选苗待四叶苗时期，取一 片真叶(播种时期大约为四星期)用CTAB法(前面已述)提取基因组DNA，根据表达载体 上外源BnERF56基因序列，设计引物进行PCR检测(序列为F-5 ‘ TGAAGATAGATGGCAACTA AGCMGAAG3 ‘ R-5 ‘ AATTCAGAAGTTTCAAGTAGCGGAGC ‘ ) ；PCR 反应体系如下基因组 DNA 模板 liiL(约 50ng)、10XTaq 酶反应缓冲液 2ul、25mM MgCL2 1. 2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM 引物 各0.2111、0.3单位1&9酶，加无菌水至20111。反应程序为941变性51^11，941 45s、55°C 45s、72°C 2min 32循环，72°C延伸5min。用(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳检测PCR 反应产物，结果表明该超表达(0X-BnERF56)载体已经成功转入拟南芥。实施例4:一种抗性相关的BnERF56基因在增强植物对核盘菌抗性、对灰霉菌抗性中的应 用，。其步骤是l、BnERF56基因的超表达增强了病源相关蛋白表达通过荧光定量PCR验证干扰效率并观察转基因拟南芥T1代表型。观察结果显示， 在正常生长状况下，各BnERF56基因超表达转基因植株与野生型植株并无明显差异；PCR鉴 定后获得转基因T2代超表达(0X-BnERF56)各个株系的幼苗。摘取这些幼苗的叶片，速冻于 液氮中，用Q-PCR对目标基因BnERF56的表达水平进行分析。具体方法如下取经过PCR检 测后获得的T2代阳性植株的叶片，在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨至粉状，利用Trirol 提取试剂盒的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于无RNase的双蒸水中。DNase I去 除可能残留的DNA。用蛋白检测仪(DU 650 BECKMAN,USA)分别检测RNA在260纳米和280 纳米光吸收值，结合(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以获得的 RNA为模板进行逆转录(前面已述)，得到的cDNA分装后于_20°C保存备用。
荧光定量PCR仪为RTTM-Cycler (博奥)，采用拟南芥Act in作为内标基因。BnERF56 引物为 5 ‘ -GGAGGAAGAGACGGTGCCGGTTAGG-3 '和 5 ‘ -GCGGAGCTGGGAGACGTCGGAGTTA-3 ‘； 拟南芥 PDF1. 2 引物为 5 ‘ -TGTTCTCTTTGCTGCTTTCGACG-3 ‘ 禾P 5' -GCATGATCCATGTTTGGCTCCT-3‘；拟南芥ChiB 引物为 5‘ -ATCAGCGCTGCAAAGTCCTTC-3‘ 和 5 ‘ -GTGCTGTAGCCCATCCACCTG-3 ‘；拟南芥冊_1 引物为 5 ‘ -TTCTCCCTCGAAAGCTCAA-3 ‘ 和 5 ‘ -AAGGCCCACCAGAGTGTATG-3 ‘；拟南芥冊_2 引物为 5 ‘ -AAGGAGCTTAGCCTCACCAC-3 ‘ 和 5 ‘ -CCCGTAGCATACTCCGATTT-3‘；荧光定量PCR反应体系为20iiL:含有SYBR Mix 10 y L，正反向引物(10 y mol/L) 各0. 8 ii L，模板2 u L，DEPC处理过的无菌水补足至20 u L。扩增条件为94°C，5min ；94°C 15s,60°C 20s,72°C 30s，40个循环；每个循环于72°C复性末端进行荧光检测。反应结束后 先加热到95°C，然后降至72°C，再缓慢升温至95°C，记录荧光信号的变化，得出扩增产物的 熔解曲线。每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。用比较Ct法(A ACt)计算基因的相对表达量。利用仪器所带软件，首先优化内 标基因和目的基因扩增条件，分别测定Actin和目的基因的Ct值，选取九次实验测定值中 最为接近的三次结果(Ct值系统误差小于0. 3)取平均值，然后通过内标基因对目的基因 进行校正得到A ACt，最后通过2_AAet估算目的基因的相对表达量和系统误差(前面已 述)。在计算相对表达量时，以野生型拟南芥叶片的样本为参照，即将其值转换成1，其它样 品再与其比较，获得相对表达值。结果显示BnERF56超表达效率非常明显，如图7所示而 BnERF56基因超表达转基因植株中，BnERF56的表达被显著上调17-30倍，相应的，病源相关 蛋白PDF1. 2, ChiB, PR-1和PR-2的表达也显著上调；表明BnERF56基因的超表达升高了病 源相关蛋白表达，增强了植物的抗病能力。实施例5:一种抗性相关的BnERF56基因在增强植物对核盘菌抗性、对灰霉菌抗性中的应 用，其步骤是l、BnERF56基因超表达显著增强植株对腐生型真菌核盘菌和灰霉菌的抗性核盘菌(Scleortinia sclerotiorum)菌核采自武汉大田油菜茎杆；选完好菌核， 先用75%酒精(体积比)泡1分钟，再用0. 1 % HgCl2消毒8-10分钟，无菌水冲洗3-5次。 把灭菌菌核切去两端，中间部分切成绿豆大小，切面朝下，接种于Minimal平板。通常每粒 菌核接一板，一次接种8-9板。于22°C静置培养3-4天，当菌核即将铺满平板时，用cj^mm 打孔器沿菌丝外缘打孔，取菌丝块，用于接种。Minimal培养基(1L)配方NaOH lg，DL_苹 果酸3g，NH4N03 2g，MgS04 -7H20 0. lg，细菌琼脂粉39g ；按顺序将上面药品溶于盛有800ml 的蒸馏水中，在加药品时，加入的药品充分溶解后再加入下一种药品，药品加完后加水补足 lOOOmL，然后加入细菌琼脂粉，于117°C灭菌15min。灰霉菌(B.cinerea)由华中农业大学李国庆教授提供，来源于武汉大田油菜叶 片。菌株培养在PDA培养基上(前面已述)，28°C培养8d。用无菌水从培养基上洗脱灰霉 病原孢子，配制成含5X105 and 1X106 spores mL—1的孢子悬浮液待用。拟南芥0X-BnERF56超表达株和野生型WT播种于23 °C光照培养室内保湿培养(每 天16h光照，8h黑暗)；选取4周龄的拟南芥苗(包括0X-BnERF56超表达株和野生型WT)用 于核盘菌和灰霉的接种实验，每种基因型至少接种12株，每株接种两片叶，试验重复三次。
17对于核盘菌接种，菌丝生长在mini培养基上，直径约2mm的含有核盘菌菌丝的琼脂块被接 种到叶的近轴表面；对于灰霉接种，菌丝生长在PDA培养基上，PDA培养基上收集的孢子用 水稀释到5X105 and 1X106 spores mL—1，接种时先将叶用细针刺伤，然后每个接种点滴加 3ul的灰霉孢子的悬浮液。核盘菌和灰霉菌接种植物都需要保持高湿，温度和光照与接种前 保持一致。发病后不同时间统计病斑面积，结果如图8和图9，与野生型相比，0X-BnERF56 超表达株显著增强了对核盘菌和灰霉的抗性，表明BnERF56是腐生型真菌核盘菌和灰霉的 抗性相关基因。
权利要求
一种分离的基因，其序列为SEQ ID No.1所示核苷酸序列。
2.一种分离的多肽，其序列为SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.权利要求2所述的一种油菜BnERF56基因在增强植物对腐生营养型真菌核盘菌抗性 中的应用。
4.权利要求2所述的一种油菜BnERF56基因在增强植物对腐生营养型灰霉菌抗性中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种增强植物对腐生营养型真菌抗性的BnERF56基因及制备方法和用途，一种分离的基因，其序列为SEQ ID No.1所示核苷酸序列。一种分离的多肽，其序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。一种BnERF56基因在增强植物对腐生营养型真菌核盘菌和灰霉菌抗性中的应用。该基因在病源侵染后显著诱导表达。涉及抗病相关基因BnERF56的分离克隆、表达调控和应用。BnERF56基因可以增强植物对腐生营养型真菌核盘菌和灰霉菌的抗性。通过基因工程技术升高BnERF56基因的表达能够增强植物对腐生营养型真菌核盘菌和灰霉菌的抗性，可作为抗性标记用于油菜抗病品种的选育，或者作为基因工程的候选基因用于分子育种。
文档编号C07K14/415GK101921776SQ201010230380
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者刘胜毅, 刘越英, 汪承刚, 董彩华, 黄军艳 申请人:中国农业科学院油料作物研究所