专利名称：一种从鼓槌石斛中提取毛兰素的工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于天然植物提取领域，涉及一种从鼓槌石斛中提取毛兰素的工艺。
背景技术：
毛兰素(Erianin)，中文系统名3_羟基_4，3’，4’，5’ -四甲氧基联苄；分子式 C18H22O5 ；分子结构式如下毛兰素为联苄类化合物，易溶于乙醇、氯仿、丙酮、甲醇等有机溶剂，极微溶于水。洪卫等(毛兰素对胃癌细胞SGC-7901端粒酶活性的影响.洪卫，郭勇，马胜林， 等.浙江实用医学，2009，14(3) 181-182.)通过实验发现毛兰素能明显抑制胃癌细胞 SGC-7901增殖，表现为浓度依赖性，48小时IC5tl为0. 056 μ g/ml，研究发现，毛兰素可以快 速抑制胃癌细胞SGC-7901的端粒酶活性，8小时就可见端粒酶活性抑制，48小时就可以抑 制端粒酶活性的80%，初步观察表明对端粒酶活性的抑制与药物浓度相关。由于实验研究 在24小时这个时间点才见到毛兰素诱导的胃癌细胞SGC-7901细胞凋亡明显增加，因此， 推断这种毛兰素对胃癌细胞SGC-7901端粒酶活性的抑制，可能参与了毛兰素诱导胃癌细 胞SGC-7901凋亡的作用机制，但尚需进一步研究来证实。王天山等的研究结果(鼓槌石斛 中化学成分对K562中瘤细胞株生长抑制作用体外试验，天然产物研究与开发，1997，9 (2) 1-3)表明，联苄类和菲类化合物对体外培养的鼠类L121tl微管蛋白的聚集及有丝分裂、P388 细胞株、多种人体肿瘤细胞株如A-549、MCF-7、HT-29、SKMEL-5、MLM、SK-0V-3、HL-60均有 抑制作用。鼓槌石斛中的二氢联苄类和菲类化合物对肿瘤细胞株K526的生长具有不同程度 的抑制作用，尤以毛兰素(Erianin、DihydroCombretastatin A-4)的活性最强。李运曼等 (毛兰素诱导人白血病HL-60细胞的凋亡.李运曼，王海燕，刘国卿.中国药理学报，2001， 22(11) :1022.)研究表明毛兰素显著抑制HL-60细胞的生长，该抑制作用可能是通过诱导 细胞凋亡和改变HL-60细胞bcl-2和bax基因的表达而实现的。二十世纪九十年代我国学者从石斛中分离提取出毛兰素，其提取方法是用氯仿或 苯为提取溶媒并用超声处理30分钟进行提取，提取物再经硅胶柱柱层析分离得白色不定 形的毛兰素结晶粉末；该方法的缺点是有机溶媒用量大(是石斛原料的10倍多)，成本 高，时间长，而且对环境污染严重。中国专利申请03115752. 1公开了从石斛中提取毛兰素 的方法，包括应用超临界CO2萃取和柱层析法以无水乙醇、甲醇、丙酮等为夹带剂，以CO2等 位提取介质从兰科植物石斛中提取抗肿瘤成分毛兰素，对所得的粗提物再以石油醚醋酸乙酯溶液为洗脱剂进行硅胶柱柱层析分离及重结晶等步骤获得精提物；由于上述提取方法 对技术要求较高，不利于大规模生产。
发明内容
针对现有技术的小足，本发明要解决的问题是提供一种从鼓槌石斛中提取毛兰素 的工艺。本发明从鼓槌石斛中提取毛兰素的工艺，其特征在于包括以下步骤(1)制备乙酸乙酯总提取物取鼓槌石斛药材粉碎，用3-8倍药材质量的乙酸乙酯 室温浸泡2-7天，常压过滤，收集乙酸乙酯提取液A ；将提取后的药渣用其2-6倍质量的乙 醇微波提取5-30分钟，收集乙醇提取液，合并得乙醇提取液，浓缩得浸膏，用2-3倍体积的 乙酸乙酯萃取浸膏3-6次，收集、合并乙酸乙酯萃取液B ；将上述A、B两部分乙酸乙酯液合 并，于85-90°C条件下蒸馏至流浸膏，自然挥干，得乙酸乙酯总提物；(2)柱层析分离将上述乙酸乙酯总提物用其2-5倍量的150-300目氧化铝拌样， 进行氧化铝柱层析，先以水洗至洗出液近无色，再以石油醚、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇中的一 种或两种以上组合的混合溶液系统梯度洗脱，收集流分，同时用硅胶薄层层析检识，合并收 集Rf = 0. 2-0. 6相同流分，浓缩析晶，甲醇或丙酮重结晶，干燥得毛兰素。步骤⑴所述提取过程中所用乙醇为体积百分比为70-99%的乙醇溶液。步骤(1)所述微波辅助提取过程中微波功率为200-500W。步骤⑴所述乙醇提取液浓缩过程中浓缩条件为温度60_65°C，真空度为 0.06-0. IMpa0步骤(2)所述氧化铝为中性氧化铝，柱径高比为1 5-10。步骤(2)所述洗脱溶剂为丙酮、甲醇或乙醇中的一种，或石油醚-丙酮(98 90 2 10)、石油醚-氯仿(98 80 2 20)、石油醚-氯仿-甲醇(98 85 2 10 2 8)、石油醚-氯仿-丙酮(98 85 2 10 2 8)。本发明从鼓槌石斛中提取毛兰素的工艺，提取方法简单、提取率高，氧化铝柱分离 效果好，产品纯度高，可达97%以上。本发明提取的毛兰素可为开发应用新一代天然来源的抗肿瘤药物开拓了新径。下面将结合具体实施方式
进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限 于下列实施方式。
具体实施例方式实施例1 将从云南采购的鼓槌石斛干燥品粉碎，取Ikg用6倍鼓槌石斛质量的乙酸乙酯室 温浸泡4天，常压过滤，收集乙酸乙酯提取液A，重复2次，合并提取液A。将第二次提取后 的药渣用3倍量90 %乙醇于400W微波提取10分钟，提取3次，常压过滤，收集乙醇提取液， 合并，于65°C条件下减压(真空度为0. 09Mpa)浓缩得乙醇浸膏，用相当于浸膏2倍量的乙 酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B两部分乙酸乙酯萃取液，于80°C条件下 真空(真空度为0. 095Mpa)浓缩得浸膏，自然挥干，得乙酸乙酯总提物。将上述乙酸乙酯总提物用其3倍量的150-300目的氧化铝拌样，进行氧化铝柱层
4析(径高比为1 7)，石油醚-氯仿-丙酮系统梯度洗脱，硅胶薄层层析检识，收集Rf = 0. 2-0. 6相同流分，回收试剂，浓缩析晶，甲醇反复重结晶得毛兰素15g，纯度为98. 57%。实施例2 将从云南采购的鼓槌石斛干燥品粉碎，取2. 5kg用7倍鼓槌石斛质量的乙酸乙酯 室温浸泡6天，常压过滤，收集乙酸乙酯提取液A，重复3次，合并提取液A。将第三次提取 后的药渣用4倍量95%乙醇于350W微波提取15分钟，提取3次，常压过滤，收集乙醇提取 液，合并，于62°C条件下减压(真空度为0.085Mpa)浓缩得乙醇浸膏，用相当于浸膏3倍量 的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B两部分乙酸乙酯萃取液，于85°C条 件下真空(真空度为0. 095Mpa)浓缩得浸膏，自然挥干，得乙酸乙酯总提物。将上述乙酸乙酯总提物用其4倍量的150-300目的氧化铝拌样，进行氧化铝柱层 析(径高比为1 6)，石油醚-氯仿系统梯度洗脱，硅胶薄层层析检识，收集Rf = 0.2-0.6 相同流分，回收试剂，浓缩析晶，乙醇反复重结晶得毛兰素37. lg，纯度为98. 35%。实施例3 将从云南采购的鼓槌石斛干燥品粉碎，取5kg用8倍鼓槌石斛质量的乙酸乙酯室 温浸泡5天，常压过滤，收集乙酸乙酯提取液A，重复2次，合并提取液A。将第二次提取后 的药渣用4倍量90 %乙醇于350W微波提取20分钟，提取2次，常压过滤，收集乙醇提取液， 合并，于60°C条件下减压(真空度为0. 090Mpa)浓缩得乙醇浸膏，用相当于浸膏3倍量的乙 酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B两部分乙酸乙酯萃取液，于90°C条件下 真空(真空度为0.095Mpa)浓缩得浸膏，自然挥干，得乙酸乙酯总提物。将上述乙酸乙酯总提物用其4倍量的150-300目的氧化铝拌样，进行氧化铝柱层 析(径高比为1 5)，石油醚-丙酮系统梯度洗脱，硅胶薄层层析检识，收集Rf = 0.2-0.6 相同流分，回收试剂，浓缩析晶，乙醇反复重结晶得毛兰素72g，纯度为97. 83%。实施例4 将从云南采购的鼓槌石斛干燥品粉碎，取8kg用6倍鼓槌石斛质量的乙酸乙酯室 温浸泡5天，常压过滤，收集乙酸乙酯提取液A，重复2次，合并提取液A。将第二次提取后 的药渣用3倍量85 %乙醇于350W微波提取12分钟，提取3次，常压过滤，收集乙醇提取液， 合并，于65°C条件下减压(真空度为0. 078Mpa)浓缩得乙醇浸膏，用相当于浸膏2倍量的乙 酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B两部分乙酸乙酯萃取液，于85°C条件下 真空(真空度为0.095Mpa)浓缩得浸膏，自然挥干，得乙酸乙酯总提物。将上述乙酸乙酯总提物用其5倍量的150-300目的氧化铝拌样，进行氧化铝柱层 析(径高比为1 10)，石油醚-氯仿-甲醇系统梯度洗脱，硅胶薄层层析检识，收集Rf = 0. 2-0. 6相同流分，回收试剂，浓缩析晶，甲醇反复重结晶得毛兰素120g，纯度为98. 47%。实施例5:将从云南采购的鼓槌石斛干燥品粉碎，取12. 5kg用5倍鼓槌石斛质量的乙酸乙酯 室温浸泡5天，常压过滤，收集乙酸乙酯提取液A，重复3次，合并提取液A。将第三次提取 后的药渣用4倍量95%乙醇于280W微波提取23分钟，提取2次，常压过滤，收集乙醇提取 液，合并，于63°C条件下减压(真空度为0. 086Mpa)浓缩得乙醇浸膏，用相当于浸膏3倍量 的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B两部分乙酸乙酯萃取液，于90°C条 件下真空(真空度为0.095Mpa)浓缩得浸膏，自然挥干，得乙酸乙酯总提物。
将上述乙酸乙酯总提物用其4倍量的150-300目的氧化铝拌样，进行氧化铝柱层 析(径高比为1 9)，石油醚-氯仿-丙酮系统梯度洗脱，硅胶薄层层析检识，收集Rf = 0. 2-0. 6相同流分，回收试剂，浓缩析晶，甲醇反复重结晶得毛兰素181g，纯度为98. 24%。
权利要求
一种从鼓槌石斛中提取毛兰素的工艺，其工艺包括以下步骤(1)制备乙酸乙酯总提取物取鼓槌石斛药材粉碎，用3 8倍药材质量的乙酸乙酯室温浸泡2 7天，常压过滤，收集乙酸乙酯提取液A；将提取后的药渣用其2 6倍质量的乙醇微波提取5 30分钟，收集乙醇提取液，合并得乙醇提取液，浓缩得浸膏，用2 3倍体积的乙酸乙酯萃取浸膏3 6次，收集、合并乙酸乙酯萃取液B；将上述A、B两部分乙酸乙酯液合并，于85 90℃条件下蒸馏至流浸膏，自然挥干，得乙酸乙酯总提物；(2)柱层析分离将上述乙酸乙酯总提物用其2 5倍量的150 300目氧化铝拌样，进行氧化铝柱层析，先以水洗至洗出液近无色，再以石油醚、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇中的一种或两种以上组合的混合溶液系统梯度洗脱，收集流分，同时用硅胶薄层层析检识，合并收集Rf＝0.2 0.6相同流分，浓缩析晶，甲醇或丙酮重结晶，干燥得毛兰素。
2.根据权利要求1所述的一种从鼓槌石斛中提取毛兰素的工艺，其特征在于步骤(1) 所述提取过程中所用乙醇为体积百分比为70-99%的乙醇溶液。
3.根据权利要求1所述的一种从鼓槌石斛中提取毛兰素的工艺，其特征在于步骤(1) 所述微波辅助提取过程中微波功率为200-500W。
4.根据权利要求1所述的一种从鼓槌石斛中提取毛兰素的工艺，其特征在于步骤(1) 所述乙醇提取液浓缩过程中浓缩条件为温度60-65°C，真空度为0. 06-0. IMpa0
5.根据权利要求1所述的一种从鼓槌石斛中提取毛兰素的工艺，其特征在于步骤(2) 所述氧化铝为中性氧化铝，柱径高比为1 5-10。
6.根据权利要求1所述的一种从鼓槌石斛中提取毛兰素的工艺，其特征在于步骤(2) 所述洗脱溶剂为丙酮、甲醇或乙醇中的一种，或石油醚-丙酮(98 90 2 10)、石油 醚-氯仿(98 80 2 20)、石油醚-氯仿-甲醇(98 85 2 10 2 8)、石油 醚_氯仿_丙酮(98 85 2 10 2 8)。
全文摘要
本发明涉及一种从鼓槌石斛中提取毛兰素的工艺，其特征在于通过浸渍提取和微波辅助提取的方法制备鼓槌石斛乙酸乙酯提取物；再经与氧化铝拌样上柱层析，有机溶剂洗脱，硅胶薄层层析检识，收集Rf＝0.2-0.6相同流分，回收试剂，浓缩析晶，甲醇或丙酮重结晶，干燥即得毛兰素。本发明提取的化合物为开发应用新一代天然来源的抗肿瘤药物开拓了新途径。
文档编号C07C41/36GK101973857SQ20101023581
公开日2011年2月16日 申请日期2010年7月26日 优先权日2010年7月26日
发明者刘东锋, 杨成东, 郭琴 申请人:南京泽朗医药科技有限公司