具有抗肿瘤活性的熊果酸二乙醇胺类衍生物及其制备方法

文档序号:3568602阅读:244来源:国知局
专利名称:具有抗肿瘤活性的熊果酸二乙醇胺类衍生物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种熊果酸衍生物及其制备方法,具体说是一种具有抗肿瘤活性的熊 果酸二乙醇胺类衍生物及其制备方法。
背景技术
熊果酸(Ursolic acid,UA),又名乌索酸、乌苏酸,属五环J萜类化合物,化学名
(3 3 ) -3-Hydroxyurs-12-en-28-oic acid,其相对分子量为 456. 68,分子式为 C3(lH4803,它以 游离或糖苷的形式,广泛分布于自然界中。药理学研究发现,熊果酸具有广泛的生物学效 应,熊果酸具有多种生物学活性,如抗癌、抗HIV、抗肝损伤、抗疟、抗炎抑菌等,其中尤以抗 癌活性最为显著,其抗癌谱广,不仅对多种致癌、促癌物有抵抗作用,而且对多种肿瘤细胞 体内、外均有抑制作用。其副作用小,毒性低,显示出较大的临床应用潜力。
熊果酸的化学结构式为
IV。目前,国内外对熊果酸的研究报到多集中在熊果酸的分离提取工艺和药理学研 究方面,而对熊果酸的结构修饰方面研究较少。由于熊果酸的显著抗癌作用使得这一方 面的研究较为深入。如王涛等的“熊果酸抗肿瘤作用及其机制研究进展”(《药物生物技 术》,2008, 15 [2]);刘训华等的“熊果酸的抗肿瘤作用”(《江苏医药》,2007,33 [2]);夏国豪 等的“熊果酸抗肿瘤作用研究进展”(《国外医学肿瘤学分册》,2002,29[6]);等等。多数研 究者认为,熊果酸能通过化学预防、抗突变、细胞毒作用、抗肿瘤血管生成及诱导肿瘤细胞 分化、凋亡等来抑制肿瘤的发生、入侵与转移。国内的白育军等增加熊果酸A环的含氧取代,进行结构修饰,合成6种母核修饰物 (《华西药学杂志》,2003,18 [2]);纵伟等利用环糊精,采用饱和水溶液法包合熊果酸, 解决了熊果酸水溶性差的问题(《熊果酸环糊精包合物制备工艺研究》,2008,29[1]); 孟艳秋等开发了熊果酸修饰含氨基化合物等系列衍生物等多项专利。本发明的立足点在 于研发新型的具抗癌活性的N-[3 0 -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇和Ν-[3 β -羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇及其制备方法,国内外未见其报道。

发明内容
本发明的目的是以熊果酸为先导化合物,合成具有抗癌活性的熊果酸二乙醇胺类 衍生物。本发明的熊果酸二乙醇胺类衍生物,所述熊果酸二乙醇胺类衍生物为Ν-[3β_乙 酰氧基_熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇,结构式如式I所示 制备方法如下
(1)熊果酸与醋酸酐反应,生成3-0-乙酰基熊果酸;3-0-乙酰基熊果酸的结构式如式 II所示;(2)3-0-乙酰基熊果酸与草酰氯反应,再与二乙醇胺反应得N-[3 β -乙酰氧基-熊 果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇,结构式如式I所示。所述制备方法具体步骤如下
(1)1重量份的熊果酸搅拌溶解于40-50重量份的吡啶中,滴加入2-3重量份的醋酸 酐,加入0.001-0. 02重量份的DMAP,室温下搅拌16-18 h,反应结束后,用2 N HCl调节pH 3-4,蒸除溶剂,抽滤,水洗滤饼至中性,干燥,干燥后的产物干法上样,柱层析纯化,无水乙 醇热溶,冷却重结晶,得白色粉末状的3-0-乙酰基熊果酸;
(2)1重量份3-0-乙酰基熊果酸溶解于30-35重量份CH2Cl2中,逐滴加入1_2重量份的 草酰氯,室温下搅拌反应36-48h,蒸除溶剂及反应产生的气体,得3-0-乙酰基UA酰氯中间 体的粗品,直接进入下一步反应;在上述中间体的粗品中加入20-30重量份的CH2Cl2,三乙 胺调节溶液PH 8-9,加入1-2重量份的二乙醇胺,室温下搅拌反应3-5h,反应结束后,反应 液中加5-10重量份的水,以2N HCl调节pH3-4,过滤,水洗滤饼至滤液pH为中性,干燥;干 燥后的产物干法上样,柱层析纯化,无水乙醇热溶,冷却重结晶,得白色粉末状Ν-[3 β -乙 酰氧基_熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇。本发明的另一种熊果酸二乙醇胺类衍生物,所述熊果酸二乙醇胺类衍生物为Ν-[3β-羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇,结构式如式III所示
III。
制备方法如下
(1)熊果酸与醋酸酐反应,生成3-0-乙酰基熊果酸;3-0-乙酰基熊果酸的结构式如式 II所示;
II。 (2)3-0-乙酰基熊果酸与草酰氯反应,再与二乙醇胺反应得Ν_[3 β-乙酰氧基-熊 果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇,结构式如式I所示。(3)Ν-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇与NaOH水解反应, 得到Ν-[3 β -羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇,结构式如式III所示。所述制备方法具体步骤如下
(1)1重量份的熊果酸搅拌溶解于40-50重量份的吡啶中,滴加入2-3重量份的醋酸酐, 加入0. 001-0. 02重量份的DMAP,室温下搅拌16-18 h,反应结束后,用2 N HCl调pH 3-4, 蒸除溶剂,抽滤,水洗滤饼至中性,干燥,干燥后的产物干法上样,柱层析纯化,无水乙醇热 溶,冷却重结晶,得白色粉末状的3-0-乙酰基熊果酸(II)。(2)1重量份3-0-乙酰基熊果酸溶解于30-35重量份CH2Cl2中,分批次、逐滴加 入1-2重量份的草酰氯,室温下搅拌反应36-48 h,蒸除溶剂及反应产生的气体,得3-0-乙 酰基UA酰氯中间体的粗品,直接进入下一步反应。在上述中间体中加入20-30重量份的 CH2Cl2,三乙胺调节溶液pH 8-9,加入1-2重量份的二乙醇胺,室温下搅拌反应3 h,反应 结束后,反应液中加5-10重量份的水,以2N HCl调pH3-4,过滤,水洗滤饼至滤液pH为中 性,干燥。干燥后的产物干法上样,柱层析纯化,无水乙醇热溶,冷却重结晶,得白色粉末状 N-[3 β -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇(I);
(3)称取1-2重量份的N-[3 β -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇,溶 于20-30重量份的CH3OH-THF中,所述CH3OH与THF的体积比为1 1. 5-2. 5 ;加入4-8重量 份的4Ν NaOH,室温下搅拌反应3-5h,向反应液中加入5-10重量份的水,2 N HCl调节pH 3-4,减压蒸除溶剂,水洗沉淀至中性,干燥;干燥后的产物干法上样,柱层析纯化,无水乙醇 热溶,冷却重结晶,得N-[3 β -羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇(III)。
上述制备的熊果酸二乙醇胺类衍生物具有抗肿瘤活性,用于抗肿瘤药物的制备。本发明的优点在于,本发明对天然产物熊果酸进行结构改造,得Ν-[3 β-乙酰氧 基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇(I)和Ν-[3 β-羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨 基二乙醇(III),体外细胞增殖抑制实验表明,化合物I和III对所测肿瘤细胞株H印G2、 BGC823.SH-SY5Y.Hela的增殖抑制作用优于熊果酸,而对人胚肺成纤维细胞HELF的毒性作 用则低于熊果酸。其中化合物I的体外抗肿瘤效果最好。化合物I对小鼠体内的抗Η22实 验表明,其显示出比熊果酸更强的肿瘤抑制作用。


图1为本发明中N-[3 β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇(化合 物I)和N-[3 β -羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇(化合物III)的合成路线;
图2为肿瘤体积观察比较。
具体实施例以下为本发明的具体实施例子以及对比实施例可以进一步清楚地了解本发明,但 是它们不是对本发明的限定
实施例1
3-0乙酰基熊果酸(化合物II)的制备
称取0. 7062 g熊果酸,加入30 ml吡啶,搅拌溶解后滴加入1. 8 ml醋酸酐,加入少量 的DMAP,室温下搅拌16 h,反应结束后,用2 N HCHfpH 3_4,蒸除溶剂,抽滤,水洗滤饼至 中性,常压100°C干燥,干燥后的产物干法上样,柱层析纯化(石油醚(60-90°C)乙酸乙酯 =3 1 ),无水乙醇热溶,冷却重结晶,得3-0乙酰基熊果酸。性状白色粉末;产率86.17% ;mp 286-288°C。IR数据(KBr,cnT1)及其归属υ 3293 (0-Η伸缩振动),2927 (C-H伸缩振动), 1736 (s,C=O伸缩振动),1370 (UA A区特征吸收),1245 (s,C-O-C不对称伸缩振动)cm—1。ESI-MS :m/z 497. 5 [M_H]+,521. 5 [M+Na] +。IH NMR (400MHz, CDCl3) δ :5· 23 (t,lH,H—12,/=2. 8Hz ),4· 49 (t,lH,H_3, /=7. 2Hz),2. 17 (d,lH,H-18,/=10. 8Hz),2. 04 (s,3 H, CH3COO), 1. 06 (s,3 H, CH3), 0. 97 (s,3H,CH3), 0. 94 (s,3 H,CH3), 0.92 (s, 3H, CH3), 0. 82 (d, 3 H, CH3,/=6. 4Hz),0. 78 (s, 3 H, CH3), 0. 76 (s,3 H, CH3实施例2
N-[3 β -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇(化合物I)的制备 称取0.1954 g 3-0乙酰基熊果酸溶解于20 ml CH2Cl2中,分批次、逐滴加入草酰氯 0. 19 ml,室温下搅拌反应36 h,蒸除溶剂及反应产生的气体,得3_0_乙酰基UA酰氯中间体 的粗品,直接进入下一步反应。在上述中间体中加入20 mL CH2Cl2,三乙胺调节溶液pH 8-9, 加入二乙醇胺0. 19 ml,室温下搅拌反应3 h,反应结束后,反应液中加入10 ml蒸馏水,以2N HCl调pH3-4,过滤,水洗滤饼至滤液pH为中性,干燥。柱层析纯化(石油醚(60_90°C )乙酸 乙酯=1:3),无水乙醇热溶,冷却重结晶,得Ν-[3 β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨 基二乙醇。
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性状白色粉末;产率50.37% ;mp 220-222°C。IR数据(KBr,cm—1)及其归属υ 3392 (0_Η伸缩振动),2946 (C-H伸缩振动), 1734 (s,C=0伸缩振动),1595 (s,C=O伸缩振动,酰胺I峰),1371 (UA A区特征吸收),1245 (C-O-C不对称伸缩振动)CnT1。ESI-MS :m/z 586. 9 [M+H] +。IH NMR (400MHz, DMSO) δ :5· 08 (s,lH,Η_12),4·42 (t, 1Η, /=6. 8Ηζ, Η_3), 3.42 3.40 (m,4H,2XCH20H),2. 53 2· 50 (m,4H,N (CH2)2), 2. 00 (s,3 HjCH3CO), 1. 04 (s, 3H,CH3), 0· 91 0· 90 (m,6H,2 X CH3), 0· 83 0· 81 (m, 9H, 3 X CH3), 0. 70 (s,3H,CH3)。实施例3
N-[3 β -羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇(化合物III)的制备 称取Ν-[3 β -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇0. 5859g,溶于 20mlCH3OH-THF (1 1. 5 ν :v)中,加入2. Oml 4N NaOH,室温下搅拌反应3. 5 h,反应完全, 向混合物中加入适量的水,2 N HCl调pH 3-4,减压蒸除溶剂,水洗沉淀至中性,柱层析纯 化(石油醚(60-90°C):乙酸乙酯=1:3),无水乙醇热溶,冷却重结晶,得Ν-[3β-羟基-熊果 烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇。性状白色粉末;产率89.37% ;mp :270_272°C。IR数据(KBr,cnT1)及其归属u 3399 (-0H伸缩振动),2926 (C-H伸缩振动), 1606 (s,C=O伸缩振动,酰胺I峰),1408 (UA A区特征吸收)cm—1。ESI-MS :m/z 544. 9 [M+H] +。IH 匪R (400MHz, DMSO) δ :5· 06 (s,1Η,Η-12),3· 41 3· 39 (m, 4Η, 2 X CH2OH), 2.53 2.50 (m,4H, N(CH2)2), 1. 03 (s,3H, CH3),0. 91 (s,3H, CH3),0. 88 (d, 3 Η,/=6·4Ηζ, CH3), 0. 86 (s,3H, CH3), 0. 82 (d, 3 H,/=6. 4Hz,CH3), 0· 65 0· 69 (m,6H,2 X CH3)。实施例4
熊果酸(UA)及其衍生物(化合物I、II、III)的体外抗癌活性一MTT法检测药物对细胞 的增殖抑制作用
(1)取处于对数生长期状态良好的细胞一瓶,胰蛋白酶消化,制成5 X IO4个/ml的细胞悬液。(2)细胞悬液移入96孔板,每孔100 ul,周围一圈用PBS填充,置37°C,5% CO2 培养箱中培养24 h。(3)移去旧培养基,加入受试衍生物(用培养基将受试衍生物存储液稀释,设定不 同作用浓度),每孔IOOuL,另设空白对照组、UA对照组(UA 60 umol/L或20umol/L)和紫杉 醇对照组(60 umol/L或20umol/L),每组设6个复孔。药物作用24 h后,吸弃含药培养基, 于每孔中加入无血清、无酚红1640培养基100 ul,再加入MTT溶液IOul,继续孵育4 h,终
止培养。(4)小心吸弃96孔板孔内上清液,每孔加入150uL DMS0,振荡10 min,于490 nm 波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值(0D值),计算细胞的增殖抑制率抑制率(%)=(1_用 药组平均OD值+空白对照组平均OD值)X 100%,应用SPSS16. 0软件进行数据处理并计算 癌细胞增殖的半数抑制浓度(IC5tl),结果见表1。如表1结果所示,所合成的UA衍生物对不同的肿瘤细胞均具有一定的增殖抑制作
9
用,其中化合物I和III的抑制作用要优于UA,而且它们对正常细胞的毒副作用也低于UA, 说明化合物I和III具有较好的抗癌活性潜力。其中化合物I的体外抗肿瘤效果尤为突出, 可作为制备抗癌候选药物进行进一步的研究。
表1熊果酸衍生物对不同肿瘤细胞的增值抑制作用
实施例5
N-[3 β -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇(结构式I)的体内抗癌活 性一小鼠实验
(1)动物模型建立
无菌抽5取第8天活化处理的小鼠肝癌Η22腹水瘤株,用无菌生理盐水稀释成2. 0 X IO7 个/mL瘤细胞浓度的稀释液,每只0. 2 mL接种于小鼠右前肢腋部皮下,制作成实体瘤动物模型。(2)动物分组及给药方法
将接种后的昆明小鼠随机分成以下6组空白阴性对照组,环磷酰胺组(CTX)为阳性对 照组,低、中、高剂量组化合物I,熊果酸组(UA),每组9只。空白阴性对照组给予生理盐水, 高、中、低剂量组化合物I (60,40,20 ymol/L),熊果酸组(60 μ mol/L),环磷酰胺组2mg/ mL,于小鼠接种瘤株次日起给药,每日一次,每次20 mL/kg,连续给药7天。如图2所示,对小鼠剥离下来的肿瘤进行观察,可以看出,相较于空白阴性对照组 的肿瘤,各用药组的肿瘤体积大小都有不同程度的缩小,其中化合物I作用后的肿瘤体积 要小于UA作用组,说明化合物I的肿瘤抑制效果优于UA0(3)实体瘤抑瘤率的测定
第8天将各组小鼠颈椎脱白处死,称其体重、用镊子镊住小鼠右腋肿瘤生长部位皮肤 后,用手术剪子剪开皮肤,暴露肿瘤,用手术剪钝性剥离肿瘤,拍照, 天平称量瘤重,按下式计算抑瘤率,以抑瘤率来判断药物抑瘤效果。抑瘤率=[(空白对照组瘤重-用药组瘤重)/空白对照组瘤重]X 100% 其肿瘤体积观察比较见图2,而对肝癌H22小鼠实体瘤抑瘤率的影响见表2。表2 UA和化合物I对H22的体内肿瘤抑制作用(i 士s,n=9)
如表2所示,高、中、低剂量化合物I及UA对肿瘤细胞均有一定的抑制作用,其抑瘤率 分别为43. 0%,45. 6%,36. 6%,36. 2%,化合物I的抑瘤作用强于UA UKQ. 05),其中中剂量的 效果最佳,而且化合物I作用后的小鼠体重增加量要大于其余三组。
权利要求
一种熊果酸二乙醇胺类衍生物,其特征在于所述熊果酸二乙醇胺类衍生物为N [3β 乙酰氧基 熊果烷 12 烯 28 酰] 氨基二乙醇,结构式如式I所示 I。2010102401554100001dest_path_image001.jpg
2. 一种如权利要求1所述的熊果酸二乙醇胺类衍生物的制备方法,其特征在于 (1)熊果酸与醋酸酐反应,生成3-0-乙酰基熊果酸;3-0-乙酰基熊果酸的结构式如式 II所示(2) 3-0-乙酰基熊果酸与草酰氯反应,再与二乙醇胺反应得N-[3 0 -乙酰氧基-熊果 烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇,结构式如式I所示。
3.根据权利要求2所述的熊果酸二乙醇胺类衍生物的制备方法,其特征在于所述制 备方法具体步骤如下(1)1重量份的熊果酸搅拌溶解于40-50重量份的吡啶中,滴加入2-3重量份的醋酸 酐,加入0.001-0. 02重量份的DMAP,室温下搅拌16-18 h,反应结束后,用2 N HC1调节pH 3-4,蒸除溶剂,抽滤,水洗滤饼至中性,干燥,干燥后的产物干法上样,柱层析纯化,无水乙 醇热溶,冷却重结晶,得白色粉末状的3-0-乙酰基熊果酸;(2)1重量份3-0-乙酰基熊果酸溶解于30-35重量份CH2C12中,逐滴加入1_2重量份的 草酰氯,室温下搅拌反应36-48h,蒸除溶剂及反应产生的气体,得3-0-乙酰基UA酰氯中间 体的粗品,直接进入下一步反应;在上述中间体的粗品中加入20-30重量份的CH2C12,三乙 胺调节溶液PH 8-9,加入1-2重量份的二乙醇胺,室温下搅拌反应3-5h,反应结束后,反应 液中加5-10重量份的水,以2N HC1调节pH3-4,过滤,水洗滤饼至滤液pH为中性,干燥;干 燥后的产物干法上样,柱层析纯化,无水乙醇热溶,冷却重结晶,得白色粉末状N-[3 0 -乙 酰氧基_熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇。
4.一种熊果酸二乙醇胺类衍生物,其特征在于所述熊果酸二乙醇胺类衍生物为 N-[3 0 -羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇,结构式如式III所示
5. 一种如权利要求4所述的熊果酸二乙醇胺类衍生物的制备方法,其特征在于 (1)熊果酸与醋酸酐反应,生成3-0-乙酰基熊果酸;3-0-乙酰基熊果酸的结构式如式 II所示 (2)3-0-乙酰基熊果酸与草酰氯反应,再与二乙醇胺反应得N-[3 0 -乙酰氧基-熊果 烧-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇,结构式如式I所示;(3)N-[30 -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇与NaOH水解反应,得到 N-[3 0 -羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇,结构式如式III所示。
6.根据权利要求5所述的熊果酸二乙醇胺类衍生物的制备方法,其特征在于所述制 备方法具体步骤如下(1)1重量份的熊果酸搅拌溶解于40-50重量份的吡啶中,滴加入2-3重量份的醋酸酐, 加入少量的DMAP,室温下搅拌16-18 h,反应结束后,用2 N HC1调pH 3_4,蒸除溶剂,抽滤, 水洗滤饼至中性,干燥,干燥后的产物干法上样,柱层析纯化,无水乙醇热溶,冷却重结晶, 得白色粉末状的3-0-乙酰基熊果酸(II);(2)1重量份3-0-乙酰基熊果酸溶解于30-35重量份CH2C12中,分批次、逐滴加入1_2 重量份的草酰氯,室温下搅拌反应36-48 h,蒸除溶剂及反应产生的气体,得3-0-乙酰基UA 酰氯中间体的粗品,直接进入下一步反应。在上述中间体中加入20-30重量份的CH2C12,三 乙胺调节溶液PH 8-9,加入1-2重量份的二乙醇胺,室温下搅拌反应3 h,反应结束后,反应 液中加5-10重量份的水,以2N HC1调pH3-4,过滤,水洗滤饼至滤液pH为中性,干燥。干燥 后的产物干法上样,柱层析纯化,无水乙醇热溶,冷却重结晶,得白色粉末状N-[3 0 -乙酰 氧基_熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇(I);(3)称取1-2重量份的N-[30 -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇,溶 于20-30重量份的CH30H-THF中,所述CH30H与THF的体积比为1 1. 5-2. 5 ;加入4-8重量 份的4N NaOH,室温下搅拌反应3-5h,向反应液中加入5-10重量份的水,2 N HC1调节pH 3-4,减压蒸除溶剂,水洗沉淀至中性,干燥;干燥后的产物干法上样,柱层析纯化,无水乙醇3热溶,冷却重结晶,得N-[3 0 -羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇(III)。
7. —种如权利要求1或4所述的熊果酸二乙醇胺类衍生物或由权利要求2、3、5或6所 述制备方法制备的熊果酸二乙醇胺类衍生物,用于抗肿瘤药物的制备。
全文摘要
本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的熊果酸二乙醇胺类衍生物及其制备方法。所述熊果酸二乙醇胺类衍生物为N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇(Ⅰ)或N-[3β-羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基二乙醇(Ⅲ)。通过熊果酸与醋酸酐反应,生成3-O-乙酰基熊果酸,3-O-乙酰基熊果酸与草酰氯反应,再与二乙醇胺反应得化合物(Ⅰ),化合物(Ⅰ)与NaOH水解反应,得到化合物(Ⅲ)。制备的熊果酸二乙醇胺类衍生物用于抗肿瘤药物的制备,对肿瘤细胞的增殖抑制作用优于熊果酸,而对人胚肺成纤维细胞HELF的毒性作用则低于熊果酸。
文档编号C07J63/00GK101891795SQ20101024015
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月29日 优先权日2010年7月29日
发明者林凤屏, 邵敬伟 申请人:福州大学
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