抗人绒毛膜促性腺激素抗体-白介素2融合蛋白的制备及其应用的制作方法

专利名称：抗人绒毛膜促性腺激素抗体-白介素2融合蛋白的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术和药物领域。更具体地，本发明涉及抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)i3亚基单抗与人白细胞介素2 (以下简称IL2)的融合蛋白，编码该融合蛋白的 DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，以及该融合蛋白的制法和在治疗肿瘤等疾病中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤(癌症)是危害人类健康的重大疾病，在临床治疗癌症的过程中，对手术后残留肿瘤细胞的治疗是一个涉及预后情况的关键环节。尽管癌症的治疗技术和方案在不断改进，但癌症的复发仍然是一个棘手和致命的问题。由于各种毒副反应和有限的疗效，使得化疗方法有其局限性。因此，需要有一些更好的治疗方法来控制癌症发展或从根本上消除癌细胞。细胞因子(Cytokine)是一类由机体的活化免疫细胞或其他细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白质的统称，具有调节细胞生理功能、介导炎症反应、参与免疫应答和组织修复等多种生物学效应。根据细胞因子的功能又分为如白细胞介素anterleukin，IL)， 集落刺激因子(Colony-stimulating Factor, CSF)，干扰素Qnterferon)，肿瘤坏死因子 (Tumor Necrosis Factor, TNF)等等。由于细胞因子对免疫功能具有调节作用，局部应用可以增强肿瘤的免疫原性，因而作为药物应用治疗肿瘤疾病。这些细胞因子在市场上都销售多年并显示出独特的治疗效果，其缺点是在体内半衰期短、缺乏特异性。例如，用细胞因子如白介素2 (IL2)、IL12和GM-CSF等，进行全身性治疗，可通过激活机体的保护性免疫反应而杀死残留的肿瘤细胞，目前在临床上已取得了一定的疗效[1. Rosenberg, S.A. , et al,1998.Durability of complete responses in patients with metastatic cancer treated with high-dose interleukin—2 -identification of the antigens mediating response. Ann. Surg. 228 :307 ；2. Ruef, C.，et al，1990. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor :pleiotropic cytokine with potential clinical usefulness. Rev. Infect. Dis. 12 41. ；3. Tsung，K.，et al.，1997. IL-12 induces T helper 1-directed antitumor response· J· Immunol· 158 :3359.]。然而，全身性使用细胞因子，常常会出现系统性问题，即严重的毒副作用，而且在肿瘤部位又达不到有效的治疗剂量[Cohen，J.，1995. Clinical trials-IL-12 deaths-Explanation and a puzzle. Science 270 :908 ；5. Maas, R. Α.，et al, 1993. Interleukin—2 in cancer treatment :disappointing or (still)promising ？ A review.Cancer Immunol. Immunother. 36 :141.]，因此治疗往往达不到理想的效果，该治疗技术正处于两难的境地。如果能研究出一种既能为治疗肿瘤提供有效浓度，又能减少甚至避免全身性的毒性，将极大地推动细胞因子生物治疗技术的发展。将细胞因子直接注射到肿瘤部位是一种解决方法[6. Cortesina,G. , et al, 1988.Treatment of recurrent sequamous cell carcinoma of the head and neck with low doses of interleukin-2 injected penilymphatically. Cancer 62 :2482 ；7. Maas,R. A., et al,1991. Intratumoral low-dose interleukin-2 induces rejection of distant solid tumour. Cancer Immunol. Immunother. 33 :389.],但要直接注射到肿瘤部位是很困难的，因而这一方法只适用于那些特定的、易达部位的肿瘤的治疗。另一种做法是细胞因子的基因治疗，就是将细胞因子转基因癌细胞回输到病人体内，其缺点是在治疗肿瘤的同时，也使机体本身的免疫反应受到抑制[S.Hurford， R. K. J. ,et al,1995. Gene therapy of metastatic cancer by in vivo retroviral gene targeting. Nat. Genet. 10 :430 ；9. Maass, G.，et al, 1995. Priming of tumor-specific T cells in the draining lymph nodes after immunization with interleukin 2—secreting tumor cells three consecutive stages may be required for successful tumor vaccination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5540·]。而且，尽管有一些研究结果表明，这种免疫治疗方法在治疗少量残留肿瘤细胞时具有实际应用价值，但是体外的基因改造以及患者的细胞输入因人而异，因此临床应用受到限制。此外，多次的输入接种不仅费时，而且需要昂贵的医药费[lO.Hrouda，D.，et al, 1999. Gene therapy for prostate cancer. Semin. Oncol. 26 :455 ；11.Simons，J. W.，et al,1999. Induction of immunity to prostate cancer antigens -results of a clinical trial of vaccination with irradiated autologous prostate tumor cells engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor using ex vivo gene transfer. Cancer Res. 59 :5160.]。虽然有人尝试过在体内用过滤性病毒载体导入细胞因子基因，但是由于病毒载体转移效率低以及免疫原性和安全性所限而未得到临床应用。许多病毒载体的表面糖蛋白能与各种细胞受体结合，这种非特异性相互作用直接降低其体内转染效率； 而且有相当一部分人体内存在着对病毒载体的抗体和免疫反应，这种不利免疫反应直接降低了载体的半衰期[12. Smith，R. M.，et al，1999. H印atocyte-directed gene delivery by receptor-mediated endocytosis. Semin. Liver Dis· 19 :83]。 @]ft，胃[JB一禾中能有效地提高细胞因子在肿瘤局部区域的浓度来进行肿瘤治疗的新技术。抗体是能与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白(Ig)。抗体特异性结合抗原的特性是由其可变区(Variable region)的空间构型决定的。可变区主要由轻链(L链)N端1/2处(VL)IOS-Ill个氨基酸残基和重链(H链)N端1/5-1/4处(VH)IlS 个氨基酸残基组成。可变区又可分为超变区(hypervariable region, HVR)和骨架区 (framework region，FR)。其中，超变区是V区中氨基酸的组成和排列顺序变化频率更高的区域，也是抗体与抗原决定簇(表位，epitope)结合的部位，称为决定簇互补区 (complementarity-determining region, CDR)，是Ig分子独特型决定簇主要存在的部位。 因此，对抗体分子结构的认识为人工合成抗体奠定了基础。众所周知，肿瘤细胞往往缺失HLA-I类分子，以及与NK细胞受体相配对的配体， 这是其逃脱肿瘤特异性CTL或NK细胞介导的免疫反应的主要机制。IL2 (也被称为T细胞生长因子)是一种分子量为14. 5kD的糖蛋白，是由T辅助细胞(Th细胞)合成分泌的一种细胞因子。它不仅能刺激T细胞增殖并能诱导其分化为细胞毒性T细胞(CTL) [19. Grimm, Ε. Α.，et al.，1982. Lymphokine-activated killer cell phenomenon.
4Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin
2-activatedautologous human peripheral blood lymphocytes. J. Exp. Med. 155 :1823 ； 20. Hank, J. A. , et al. , Cheung, N. K. , Sondel, P.M. , 1990. Augmentation of antibody dependent cell mediated cytotoxicity following in vivo therapy with recombinant interleukin 2. Cancer Res. 50 :52.]，而且能增强NK细胞的活性[21. Grimm et al.，1982. Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes. J. Exp. Med. 155 :1823.]。特别是，外周血淋巴细胞与IL2共培养，能产生淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)[22. Rosenberg SA, et al, 1985. Observations on the systemic administration of autologous lymphokine-activated killer cells and recombinant interleukin-2 to patients with metastatic cancer. N Engl J Med 313 :1485-1492. ] ο像NK细胞一样，LAK细胞也能杀死肿瘤细胞。临床上IL2已用于许多癌症的治疗，如肾癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤。然而，迄今为止本领域尚没有将抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗与白细胞介素2融合形成高特异性和高肿瘤杀伤力的融合蛋白。因此，为了更有效的治疗肿瘤病人，尤其是治疗那些以传统治疗方式无能为力的病人，本领域迫切需要开发兼具肿瘤特异性抗体和IL2两者生物活性的药物。

发明内容
本发明的一个目的就是提供一种新的具有肿瘤特异性(或靶向性)抗体和IL2两者生物活性的药物。在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，它包括(a)抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基的单抗元件，该单抗元件的结构如下L-H-Cm(式 I)；式中，L为单链形式的抗体轻链或其保留结合活性的片段；H为单链形式的抗体重链或其保留结合活性的片段；C为单链形式的抗体恒定区或其片段；m 为 0 或 1;“_”表示肽键或连接肽；(b)白细胞介素2元件，该元件由全长人白细胞介素2、或保留活性的白细胞介素 2突变蛋白或其活性片段的氨基酸序列构成；以及(c)任选的、位于抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基的单抗元件和白细胞介素2 元件之间的连接肽序列。在另一优选例中，所述的连接肽的长度为1-20个氨基酸，所述的接头肽序列含
3-15个氨基酸。在另一优选例中，单抗元件中连接肽为(Gly Gly Gly Gly kr)^。在另一优选例中，m为1。在另一优选例中，各元件之间(单抗元件与白细胞介素2元件之间)的连接方式为“头一头”、“头一尾”、“尾一头”、或“尾一尾”连接。其中“头”指元件的氨基端，“尾”指元
件的羧基端。在另一优选例中，所述的单抗元件包括由抗体重链在前和抗体轻链通过一接头肽如GGlyIer) 3或ARL等其他类型接头串联起来，或由抗体轻链在前和抗体重链通过一接头肽如GGlyIer) 3或ARL等其他类型接头串联起来，或连接抗体Fc，所形成的完整单链体(scFv)或(scFvFc)ο在另一优选例中，所述的单抗元件是单链抗体。在另一优选例中，所述的白细胞介素2突变蛋白是125位半胱氨酸取代为丝氨酸的重组人白细胞介素-2(125kr)或是125位半胱氨酸取代为丙氨酸的重组人白细胞介素-2(125Ala)。在另一优选例中，所述的抗体重链和抗体轻链为IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4亚类， 且连接肽或位于抗体重链或轻链的羧基端和白细胞介素2元件的氨基酸之间。在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码本发明第一方面中所述融合蛋白。在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明上述的DNA分子。在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的载体或基因组中整合有上述的DNA分子。在本发明的第五方面，提供了一种产生本发明第一方面中所述的融合蛋白的方法，它包括步骤在表达所述融合蛋白的条件下，培养本发明第四方面中所述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离出所述的融合蛋白。在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，包括安全有效量的本发明第一方面中所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。在另一优选例中，所述的药物组合物还含有选自下组的抗肿瘤药物顺钼、5-Fu、 氨甲蝶呤、IFN、TNF、氮芥、环磷酰胺、阿霉素、放线菌素D、长春新碱、喜树碱类或其组合。在本发明的第六方面，提供了本发明所述的融合蛋白的用途，它们被用于制备治疗肿瘤的药物。在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组黑色素瘤、鼻咽癌、肺腺癌、肺鳞癌、小细胞性肺癌、结肠癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、神经系统癌。 在本发明的第七方面，还提供了一种化合物，它由PEG化的本发明上述融合蛋白。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再
--累述。


图1显示了本发明部分融合蛋白实例的结构示意图。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，将抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗的基因和IL2基因融合在一起，产生由合适的氨基酸连接臂连接的hCGbeta-SCFV-IL2或 hCGbeta-scFvFc-IL2的融合蛋白。所述融合蛋白具有两者的生物学功能，既可通过抗hCG 抗体的特异性地达到肿瘤部位，或通过抗体依赖的细胞毒作用和补体介导的细胞溶解作用杀伤肿瘤细胞(仅hCGbeta-SCFvFC-IL2具有)，还可以激发机体局部和全身的抗肿瘤免疫反应，并通过IL2的生物活性提高肿瘤部位毛细血管的通透性，提高肿瘤局部摄取化疗药物的数量，同时由于和大分子抗体蛋白的融合，IL2的半衰期得以延长。因此，本发明所得到的hCGbeta-scFv-IL2或hCGbeta-scFvFc-IL2融合蛋白质可以在两者的协同下增强抗肿瘤的效果，还可减少两者分别给药给患者所带来的麻烦和痛苦，为抗肿瘤等治疗提供新的化合物。在此基础上完成了本发明。如本文所用，术语“抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗和白细胞介素2的融合蛋白”、"hCGbeta-scFv-IL2或hCGbeta-SCFvFC-IL2融合蛋白”等可互换使用，都指由抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗的氨基酸序列和白细胞介素2元件的氨基酸序列融合而成的蛋白质，其中在两者之间可以有或者没有连接肽序列。此外，所述融合蛋白可以具有或没有起始的甲硫氨酸或信号肽。如本文所用，术语“hCG”指人绒毛膜促性腺激素。hCG最初被发现是由人胚胎滋养层细胞特异表达的一种由alpha和beta两个亚基组成的异二聚体糖蛋白。1990年代，人们相继在许多肿瘤细胞膜上也发现有hCG样蛋白分子的表达。Acevedo等人建立了一种高度敏感的定量方法，采用针对hCG不同表位的单抗，对85株不同病理特性和组织来源的肿瘤细胞膜结合型hCG进行检测，所检测的癌细胞包括黑色素瘤、鼻咽癌、肺腺癌、肺鳞癌、小细胞性肺癌、结肠癌、视网膜母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、 子宫内膜癌、神经系统癌等。这些结果证实，hCGi3亚基或其片段在所有癌细胞膜上都有表达，且与癌细胞的型别和组织来源无关。虽然不同的癌细胞都特异表达hCG亚基或片段， 但在性质和数量上存在着差异[30. Acevedo HF，et al. 1992. Flow cytometry method for the analysis of membrane-associated human chorionic gonadotropin,its subunits, and fragments on human cancer cells. Cancer, 69 (7) :1818-1828]。此夕卜，各禾中证据显不， hCG在肿瘤细胞转化、肿瘤血管生成、肿瘤转移和免疫逃逸中起重要作用[31. Triozzi PL, Stevens VC. 1999, Human chorionic gonadotropin as a target for cancer vaccines. Oncol Rep. 6(1) :7-17]。因此，hCG可作为肿瘤细胞表面的靶分子，用于治疗恶性肿瘤。如本文所用，术语“抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗”和“hCGi3亚基单抗”可互换使用，都指针对人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基中任意一表位的单克隆抗体。 这种抗体可特异性结合肿瘤细胞膜具有hCG β亚基表达的肿瘤细胞，肿瘤特异性好。一种优选的抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗是单链抗体。如本文所用，术语融合蛋白中“抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗”指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的全长抗人绒毛膜促性腺激素 (hCG) β亚基单抗或其可变区片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗基本上相同的生物活性。应理解，在本发明中，抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗可以由抗体重链
7和抗体轻链通过接头肽连接形成，并且在轻链或重链的一端(优选羧基端)与IL2连接。 因此，优选的抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)i3亚基单抗是全长的抗人绒毛膜促性腺激素 (hCG) β亚基单抗或其可变区片段。例如，对于重链而言，对于结合特异性起重要作用是区域是重链的⑶R1、⑶R2、和⑶R3的氨基酸序列。对于轻链而言，对于结合特异性起重要作用是区域是轻链的⑶R1、⑶R2、和⑶R3的氨基酸序列。至于重链和轻链的恒定区，可以选用人抗体的重链恒定区和轻链恒定区。也可选用人抗体的骨架区序列(FR)改造小鼠单抗可变区中的骨架区序列(FR)。 如本文所用，术语融合蛋白中“白细胞介素2元件”或“IL2元件”可互换使用，指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的全长白细胞介素2或其活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然白细胞介素2基本上相同的生物活性。优选的IL2元件是人白细胞介素2，更佳地是全长的白细胞介素2或其活性片段。人白细胞介素2(Interlukin-2，IL-2)目前主要用于治疗肿瘤、AIDS和感染性疾病，是一广泛应用临床的细胞因子。天然人白细胞介素2由133个氨基酸组成，第58位和 105位的半胱氨酸(Cys)间形成二硫键，第125位半胱氨酸是游离疏基。与天然人白细胞介素2氨基酸结构组成相同的重组人白细胞介素2 (rIL-2)大多在大肠杆菌中以包含体形式表达。产物需经复性后才能进一步纯化处理。复性时往往会形成部分的58位和125位之间或105位和125位之间二硫键错配的重组人白细胞介素2异构体，或形成分子间的二聚体， 这为纯化带来了许多困难。因此，为了避免这些异构体的干扰，在基因构建时将重组人白细胞介素2的125位半胱氨酸取代为丝氨酸(Ser)或丙氨酸(Ala)。结果表明这不仅大大提高了复性后二硫键的配对正确率，而且不影响rIL-2的生物活性。目前市场上销售的重组人白细胞介素2有两类一类是天然结构的、一类是125位半胱氨酸取代为丝氨酸重组人白细胞介素_2 (125Ser)、或是125位半胱氨酸取代为丙氨酸重组人白细胞介素_2 (125Ale)。抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗和白细胞介素2的序列可以源自人，也可以源自非人的动物。例如，单体的序列可以来自大鼠、小鼠或人。然而，优选的是人的天然序列。如本文所用，术语“连接肽”或“氨基酸连接臂，，可互换使用，指位于抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗的重链和轻链之间的氨基酸序列和IL2元件的氨基酸序列之间的、起连接作用的任选的短肽。连接肽的长度通常为1-20个氨基酸，较佳地为3-15个氨基酸，更佳地为5-10个氨基酸，最佳地为4-6个氨基酸。技术人员可按照本领域常规方法(如参见 PNAS 1998 ；95 5929-5934 ；Protein Eng, 2000 ； 13 (5) 309-312 ；Protein Eng, 2003 ； 15(11) :871-879等文献)设计连接肽。通常，连接肽不影响或不严重影响抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗的氨基酸序列和IL2元件的氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。优选的连接肽例子包括(但并不限于)为了有利于蛋白在空间折叠成相互独立的有充分生物活性的结构域，用GG、AAAGGGS、SGGGSGGG和GGGGSGGGGSGGGGS等序列作为连接臂是合适的；为了有利于纯化，可把Mlis作为连接臂，以用金属亲和层析纯化 hCGbeta-scFv-IL2 或 hCGbeta-scFvFc_IL2 融合蛋白。一种优选的融合蛋白是将单链抗体与IL2融合而形成的。例如，从单克隆抗体细胞株或噬菌体抗体库中，筛选出编码抗hCG beta抗体可变区的cDNA，构建成单链抗体cDNA，再与IL2基因cDNA连接成单链嵌合cDNA，进而在宿主细胞(如CHO细胞)中表达，从而重组表达本发明的融合蛋白。抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守， 不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的⑶R和相应轻链上的⑶R构成了抗体的抗原结合位点。本发明还包括含上述互补决定区(OTR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性，较佳地至少95%同源性。本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。本发明的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。一旦获得了有关的序列，就可以用基因工程的方法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物) 的DNA序列。因此，编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR 扩增或合成的方法获得抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗和或白细胞介素2的编码 DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体、噬菌粒等。代表性的状态包括(但并不限于)能在真核细胞如CHO、COS系列等真核细胞中表达的载体，能在酿酒酵母或毕氏酵母中表达的载体，能在家蚕等昆虫细胞中表达的载体以及原核表达载体、或噬菌体表达。在本发明中，可选用本领域已知的各种哺乳动物表达载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列， 可以形成蛋白表达载体。如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA ；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是哺乳动物细胞。 在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞， 从而表达出融合蛋白。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。本发明的hCGbeta-scFv_IL2或hCGbeta-scFvFc_IL2融合蛋白既具有单抗针对肿瘤细胞的特异亲和力，又具有IL2的增强免疫应答的作用。除了直接使用本发明的融合蛋白之外，本发明的融合蛋白还可与另一个化合物 (比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)偶联，形成融合蛋白-PEG偶联物。可以采用本领域中已知的各种形成PEG化蛋白的方法来制备这些融合蛋白-PEG偶联物。在本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的新型hCGbeta-scFv-IL2或hCGbeta-scFvFc-IL2融合蛋白，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、 葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、皮下、皮内、鞘内(intrathecal)、侧脑室(intracerebroventricular)、腹腔 (intraperitoneal)以Hl中内(intraparenchymal)合使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明融合蛋白或其抗体施用于人，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。此外，本发明的融合蛋白还可与其他治疗药物联用，其中包括(但并不限于)各种细胞因子，如IFN、TNF、IL18等；各种肿瘤化疗药物，如5_Fu、氨甲蝶呤等影响核酸生物合成的药物，氮芥、环磷酰胺等烷化剂类，阿霉素、放线菌素D等干扰转录过程阻止RNA合成的药物，长春新碱、喜树碱类影响蛋白质合成的药物及某些激素等各类药物。本发明的主要优点如下(1)将抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗与IL-2融合表达后，IL_2可以特异性地到达肿瘤部位。因此融合蛋白，既具有针对肿瘤细胞的特异亲和力，又具有IL2的增强在肿瘤细胞周围的免疫应答能力，而对机体无毒副作用，是一种治疗肿瘤的新型药物。(2)增强蛋白的稳定性，延长半衰期。重组IL-2在体内的半衰期短，临床应用病人需要每天注射。本发明的融合蛋白大大延长IL-2的半衰期，使每日注射改为每周或更长时间注射一次，大大方便了病人给药，减少了病人的痛苦和经济负担。(3)本发明融合蛋白采用抗体分子的可变区，它不仅保留了与特异的肿瘤抗原的结合能力，还具有分子小、容易穿透血管到达肿瘤部位的特点(4)本发明融 合蛋白还具有特异抗肿瘤和广谱抗肿瘤的特点。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1融合蛋白的制备从单克隆抗体细胞株或噬菌体抗体库中，筛选出编码抗hCG beta抗体可变区的 cDNA，构建成单链抗体cDNA，再与人IL2cDNA连接成单链嵌合cDNA，进而在CHO细胞中表达，从而制得的本发明的融合蛋白hCGbeta-scFv_IL2或hCGbeta-scFvFc_IL2(结构示意图如图1所示)。实施例2hCGbeta-scFv-IL2 或 hCGbeta-scFvFc_IL2 融合蛋白的检测(a) IL2效价测定用常规的IL2生长依赖的细胞株CTLL-2/MTT比色法进行。方法如下(1)制备细胞悬液取足量CTLL-2细胞(ATCC TIB-214)培养物离心收集，用基础液(RPMI1640+10%小牛血清)洗涤3次，然后重悬于基础培养液，配制成5xl05/ml的细胞悬液，放37 °C保存。(2)制备标准液取1支标准品(2000IU)按说明书要求溶解后，用基础培养液稀释至 200IU/ml。(3)将待检样品(原液，按照IX 106IU/mg计算)用基础培养液稀释至200IU/ml。(4)在96孔细胞培养板中，将配好的标准液(200IU/ml)和样品(200IU/ml)溶液继续以倍比稀释做梯度稀释，标准品和样品同做8个稀释度，每个梯度做3个复孔。(5)加入细胞悬浮液并培养每孔加入50ul细胞悬液，置37°C，5% C02培养19小时。(6)加入MTT并培养每孔加入20ul MTT溶液，37°C，5% C02培养5小时。(7)加入裂解液并保温每孔加入150ul裂解液，37°C保温20小时。(8)在酶标仪上比色，测定波长570nm，记录测定结果。(9)用计算机程序或直线回归计算法进行处理。分别计算各待检样品的半效稀释倍数(即从待检样本溶液至相当于标准品50%最大效应点的稀释倍数)，并按下列公式计算结果待检样品效价=标准品效价X (待检样品预稀释倍数/标准品预稀释倍数)X(待检样品半效稀释倍数/标准品半效稀释倍数)比活性计算所测的活性效价与其蛋白浓度之比即为比活性，其单位为IU/mg(b) hCGbeta-scFv-IL2 或 hCGbeta-scFvFc_IL2 的特异结合活性
采用常规的“固定Raji细胞或其他能与相应单抗结合的细胞流式细胞仪检测”测定。方法如下 (1)固定细胞，如Raji细胞a.将培养的Raji细胞离心IOOOrpm 6分钟；b.用 PBS 清洗 1 次 IOOOrpm 6 分钟；c.将配好含有2%多聚甲醛的PBS加入Raji细胞中固定，室温15分钟，在此其间要不断地轻轻地吹打细胞；d. 15分钟后，离心IOOOrpm 6分钟；e.去上清，加入含有0. 02%叠氮钠的PBS中；f.细胞计数，调节细胞浓度至6xl06/ml(2)吸上述固定细胞，实验细胞所需量为每管2xl06，将细胞放入印pdorf管中，细胞离心IOOOrpm 6分钟，弃上清；(3)加入一抗(即 hCGbeta-scFv_IL2 或 hCGbeta-scFvFc_IL2 融合蛋白浓度为 lmg/ml的样品)，每管5ul，冰箱4°C保存，25分钟；(4)加入PBS清洗2次，离心IOOOrpm 6分钟；(5)离心弃上清，加入二抗(抗人或抗小鼠IgG抗体-FITC偶联物，购自Sigma Co 公司)2ul，避光保存4°C 25分钟；(6)用PBS清洗2次，准备上机作流式细胞仪检测。(C)分子量鉴定用常规的5 %、8 % 和 15 % 的 SDS-PAGE 测定 hCGbeta-scFv_IL2 或 hCGbeta-scFvFc-IL2融合蛋白的分子量。(d)半衰期测定取Wistar 大鼠测定 125I 标记 hCGbeta-scFv_IL2 或 hCGbeta-scFvFc_IL2 的血药浓度时间_曲线。实验动物在受试前3天开始喂食碘溶液，以封闭甲状腺，该处理直至试验结束。试验设高、中、低3个剂量组，氯胺酮浅麻醉，给药体积为0. 5ml。Wistar大鼠给药剂量如下高剂量组5mg/kg，中剂量组0. 5mg/kg，低剂量组0. 05mg/kg在给药后30秒到96小时共设置10个时间点取血测定血药浓度。检测方法将血样在5000rpm下离心10分钟，分离血浆，取10 μ 1，测量沉淀前放射性计数率， 然后以TCA沉淀，弃去上清液，测量沉淀后的放射性计数率，用γ放射免疫计数器测量放射性计数率，计算沉淀后与沉淀前放射性计数率之比为TCA沉淀率，同时以TCA沉淀后的放射性计数率，通过TCA沉淀后的标准曲线，得到受试药物浓度，绘制血药_浓度曲线。结果显示Wistar 大鼠体内的 hCGbeta-scFv_IL2 或 hCGbeta-scFvFc_IL2 平均半衰期明显延长。实施例3药物组合物按制药领域中常用的混合法配制以下药物组合物。单用hCGbeta-scFv_IL2 或 hCGbeta-scFvFc_IL2 的配方
白蛋白lg/100ml甘露醇5% 5g/100ml
土温 80 0. 02% 20mg/100mlhCGbeta-scFv-IL2 lmg/ml缓冲液PBS适应症结直肠癌、非小细胞肺癌或膀胱癌。实施例4用IL2蛋白或scFv蛋白或scFv-IL2融合蛋白对荷瘤小鼠进行体内肿瘤抑制试验，比较三种蛋白对肿瘤的抑制情况。取Balb/C小鼠28只，在每只小鼠的左侧腹股沟处接种2xl06Cells/0. ImL的 SP2/0-hCGbeta细胞(转染了 hCGbeta基因的SP2/0细胞株)。当7-11天时，刚可触及肿块，然后将小鼠随机分成四组。一组为对照组，只接种PBS，另外三组小鼠分别接种等克分子的IL2或scFv或scFv-IL2蛋白。约过三周后，此时对照组小鼠因肿瘤过大而开始死亡，杀死所有对照组和实验组小鼠，取瘤、称重记录。相同实验进行三次，统计所有实验数据。讨论随着生物工程技术的快速发展，已为生物合成肿瘤细胞特异性抗体与细胞因子的融合蛋白提供了一个极其有效的方法。这些抗体融合蛋白具有一种全新的性质，不仅保留了抗体对肿瘤相关抗原的特异性作用，而且又有细胞因子的生物学功能，是一种双功能生物分子。它可以通过肿瘤特异性抗体的靶向作用，在肿瘤组织的局部区域集中了大量的细胞因子，诱导免疫反应，抑制肿瘤活性而又能避免产生全身毒性。事实上，在过去二十年中， 国外研究人员已经利用不同肿瘤表面抗原，针对各种肿瘤制备了多种各具特色的抗体-细胞因子融合蛋白[13. Gafner V, et al, 2006. An engineered antibody-interleukin-12 fusion protein with enhanced tumor vascular targeting properties.Int J Cancer.119(9) 2205-12 ；14.Muller D, et al. ,2008. A novel antibody-4-lBBL fusion protein for targeted costimulation in cancer immunotherapy. J Immunother. 31 (8) 714-722]。临床前的小鼠试验结果表明，这种抗体-细胞因子融合蛋白是非常有效的抗癌药物，抗体-细胞因子融合蛋白不仅可以靶向到肿瘤组织，而且产生了极好的抗肿瘤反应，在某些情况下会导致肿瘤彻底消除[15. Ortiz-ScSnchez E，et al. ,2008. Antibody-cytokine fusion proteins !applications in cancer therapy. Expert Opin Biol Ther. 8 (7) : 1037 ; 16· Halin C，Miiller D，2003· Synergistic therapeutic effects of a tumor targeting antibody fragment， fused to interleukin 12 and to tumor necrosis factor alpha.Cancer Res. 63 (12) :3202_3210 ；17. Heuser C，et al.，2003. Anti-CD30-IL_12 antibody-cytokine fusion protein that induces IFN-gamma secretion of T cells and NK cell-mediated lysis of Hodgkin/r s 1 ymphoma-derived tumor cells. Int J Cancer. 106(4) :545_52.]。由于它的应用价值正日益显现，这些年来抗体-细胞因子融合蛋白的数量和多样性都在不断增加[18. Carter PJ. 2006. Potent antibody therapeutics by design. Nat Rev Immunol. 6(5) :343.]。事实上，在各种抗肿瘤抗体-细胞因子融合蛋白中，使用最广的细胞因子就是IL2，其融合蛋白在抗肿瘤动物模型实验中的结果也是最成功的[23. Helguera G，et al,2005.Antibody-cytokine fusion proteins for the therapy of cancer. Methods Mol Med. 109 347-374 ；24. Heuser C，et al，2004. Anti_CD30-scFv-Fc-IL_2 antibody-cytokine fusion protein that induces resting NK cells to highly efficient cytolysis of Hodgkin “ s lymphoma derived tumour cells.Int J Cancer. 110(3) 386-394 ；25. Ruehlmann JM，et al，200L MIG(CXCL9)chemokine gene therapy combines with antibody-cytokine fusion protein to suppress growth and dissemination of murine colon carcinoma. Cancer Res. 61 (23) :8498_8503 ； 26. Matsumoto H，et al,2002. Targeting of interleukin—2 to human MK—l—expressing carcinoma by fusion with a single-chain Fv of anti-MK-I antibody. Anticancer Res.22(4) 2001-2007 ；27. Marlind, J. et al.2008. Antibody-mediated delivery of interleukin—2 to the stroma of breast cancer strongly enhances the potency of chemotherapy. Clin Cancer Res. 14(20)6515-6524 ；28.Hirsch, B. et al. 2009. Anti_CD30 human IL-2 fusion proteins display strong and specific cytotoxicity in vivo. Curr Drug Targets. 10(2)110-117 ；29.Ronca, R. et al. 2009. Delivering cytokines at tumor site :The immunocytokine-conjugated anti-EDB-fibronectin antibody case. Immunobiology. 214(9-10) :800_810·]。本发明的研究也表明，抗肿瘤抗体-IL2融合蛋白在靶向治疗肿瘤细胞中是有效的。此外，通过与抗人绒毛膜促性腺激素(hCG) β亚基单抗的融合，使得融合蛋白不仅具有优异的针对肿瘤细胞的靶向性，而且具有更长的半衰期，从而使得IL2的治疗效果大幅提
尚O此外，本发明采用抗体分子的可变区，它不仅保留了与特异的肿瘤抗原的结合能力，还具有分子小、容易穿透血管到达肿瘤部位的特点；将它与细胞因子连接成融合蛋白， 既有靶向作用又具细胞免疫反应功能，因而是一种潜在的双功能抗体生物治疗药物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种融合蛋白，其特征在于，它包括(a)抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)β亚基的单抗元件，该单抗元件的结构如下L-H-Cm(式 I)；式中，L为单链形式的抗体轻链或其保留结合活性的片段；H为单链形式的抗体重链或其保留结合活性的片段；C为单链形式的抗体恒定区或其片段；m为 或1 ；“_”表示肽键或连接肽；(b)白细胞介素2元件，该元件由全长人白细胞介素2、或保留活性的白细胞介素2突变蛋白或其活性片段的氨基酸序列构成；以及(c)任选的、位于抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)β亚基的单抗元件和白细胞介素2元件之间的连接肽序列。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的单抗元件是单链抗体。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的接头肽序列含3-15个氨基酸。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的抗体重链和抗体轻链为IgGl、 IgG2、IgG3、或IgG4亚类，且连接肽或位于抗体重链或轻链的羧基端和白细胞介素2元件的氨基酸之间。
5.一种分离的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述融合蛋白。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求5所述的DNA分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体或基因组中整合有权利要求5所述的DNA分子。
8.—种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤在表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，从而表达出权利要求1所述的融合蛋白；和分离出所述的融合蛋白。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括安全有效量的权利要求1所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。
10.权利要求1所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物。
全文摘要
本发明涉及抗人绒毛膜促性腺激素抗体-白介素2融合蛋白的制备及其应用。具体地，本发明提供了重组的抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)β亚基单抗或其活性片段与白细胞介素2(IL2)的融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及含该融合蛋白的药物组合物。本发明的融合蛋白具有广谱抗肿瘤的治疗作用，且特异性好、半衰期长。
文档编号C07K19/00GK102372780SQ201010260240
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月23日 优先权日2010年8月23日
发明者王键, 申庆祥, 蒋俶 申请人:上海市计划生育科学研究所