专利名称：一种用于孔雀石绿检测的完全抗原及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于孔雀石绿检测的完全抗原，特别是涉及一种用于孔雀石绿检 测的完全抗原的制备方法。
背景技术：
由于孔雀石绿独特的苯环结构，其自身不含氨基和羧基，不能为偶联提供位点，给 半抗原的偶联改造增加了一定的难度，添加氨基时会产生临位、对位、间位不同产物，从而 导致改造后的产物不均一。难以用于孔雀石绿残留检测。
发明内容
本发明首次找到了孔雀石绿的结构类似物，从而合成完全抗原。它不但能有效的 制得用于孔雀石绿残留检测的免疫原。而且操作简单，生产效率高。为了达到上述目的本发明是这样实现的本发明提供一种用于孔雀石绿检测的完全抗原，所述的完全抗原是用副品红制备 的。本发明还提供一种用于孔雀石绿检测的完全抗原的制备方法，操作如下先将先将牛血清白蛋白、副品红、1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐以 摩尔比1 129 5216的比例一一加入到磷酸盐缓冲液中，在室温下反应2个小时，接着 将反应后的液体装入透析袋中，再放入自来水中透析48小时，每12小时换液一次，最后收 集透析袋内的液体，在-20°C中预冷冻2个小时，然后在-50°C下冷冻干燥，制成完全抗原粉 红色固体粉末。所述的磷酸盐缓冲液是PH为7. 4，含量为0. 01mol/L的磷酸缓冲液。所述的透析袋是半周长为22mm，截留分子量为14000的透析袋。由于孔雀石绿独特的苯环结构，其自身不含氨基和羧基，不能为偶联提供位点，给 半抗原的偶联改造增加了一定的难度，添加氨基时会产生临位、对位、间位不同产物，从而 导致改造后的产物不均一。本发明首次找到了孔雀石绿的结构类似物副品红，可以生产均 一的产物用于孔雀石绿检测。另外，由于本发明采用了改进的碳二亚胺法，本发明的完全抗 原的合成过程只需要50个小时左右，这样使制备过程得到了简化，大大节约了制备完全抗 原的时间，提高了生产效率，其效率可提高49%左右。与此同时采用了自来水作为透析液， 该方法也降低了生产成本。另外，本发明制备的完全抗原的比例在20-37之间，由此，为对 提高孔雀石绿药物残留酶联免疫检测方法的准确度和灵敏度有了可靠的保证；并且，还有 利于普及推广应用。
具体实施例方式应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员 常规采用方法如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。常用试剂为市售分析纯试剂。实施例一以下将对本发明的一种用于孔雀石绿检测的完全抗原的制备方法作进一步的详 细描述。具体步骤如下1、称取9. 6g的氯化钠、3. 58g十二水磷酸氢二钠、0. 4g氯化钾、0. 7g磷酸二氢钾加 入950ml的蒸馏水，调节PH至7. 4，再加入50ml的蒸馏水，配置成1000ml，浓度为0. Olmol/ L的磷酸缓冲液。2、在15ml的离心管中依次加入牛血清白蛋白32mg (0. 48u mol)、副品红 20mg(61.8u mol)、1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐480mg (2503. 8u mol)，再 加入8ml的磷酸缓冲液(PH为7. 4，含量为0. Olmol/L)，在室温下反应2小时。3、将反应好的液体装入透析袋(半周长22mm，截留分子量14000)内，再放入装有 自来水的烧杯中，透析48小时，每12小时换自来水一次。4、将透析好的液体，在_20°C中预冷冻2个小时，然后在_50°C下冷冻干燥，制成完 全抗原粉红色固体粉末。实施例二用于孔雀石绿检测的完全抗原的使用及效果(1)采用此合成的完全抗原用于免疫小鼠，免疫剂量为0.25mg/次，免疫四次后进 行眼眶取血，利用间接ELISA法，测得的小鼠血清效价可达6. 25X 105，远远高于其他抗原免 疫小鼠获得血清效价，为后续的单克隆抗体的制备奠定了基础。(2)孔雀石绿进入鱼体后，24h之内98%代谢为无色孔雀石绿，利用合成的完全抗 原，通过竞争性ELISA检查，可直接检测无色孔雀石绿，避免了其他检测方法需将无色孔雀 石绿重新转化为孔雀石绿，节省了成本和时间。(3)采用此合成的完全抗原免疫小鼠，获得的抗体能有效的检测水产品中孔雀石 绿及无色孔雀石绿的残留，检出限200ng/kg，远低于国家标准《水产品中孔雀石绿和结晶紫 残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》中0. 5ug/kg的检出限。
权利要求
一种用于孔雀石绿检测的完全抗原，其特征在于，所述的完全抗原是用副品红制备的。
2.一种用于孔雀石绿检测的完全抗原的制备方法，其特征在于，通过下列方法制 得先将牛血清白蛋白、副品红、I-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐以摩尔比 1 129 5216的比例一一加入到磷酸盐缓冲液中，在室温下反应2个小时；接着将反应 后的液体装入透析袋中，再放入自来水中透析48小时；每12小时换液一次，最后收集透析 袋内的液体；在-20°C中预冷冻2个小时，然后在-50°C下冷冻干燥，制成完全抗原粉红色固 体粉末。
3.根据权利要求2所述的一种用于孔雀石绿检测的完全抗原的制备方法，其特征在于 所述的磷酸盐缓冲液是PH为7. 4，含量为0. 01mol/L的磷酸缓冲液。
4.根据权利要求2所述的一种用于孔雀石绿检测的完全抗原的制备方法，其特征在于 所述的透析袋是半周长为22mm，截留分子量为14000的透析袋。
全文摘要
本发明公开了一种用于孔雀石绿检测的完全抗原及其制备方法。本发明首次利用孔雀石绿的结构类似物副品红，进行了用于孔雀石绿检测的完全抗原的合成。免疫原是由副品红和牛血清蛋白在室温条件下，通过碳二亚胺法进行偶联反应，用磷酸缓冲液(pH为7.4，浓度为0.01mol/L)透析后，经过冷冻干燥获得的。研究表明，该方法不仅成功地合成了可用于制备检测孔雀石绿特异抗体的免疫原，同时采用了新的偶联方法、缩短了制备时间，提高了偶联比率。本发明为开发孔雀石绿药物残留酶联免疫检测方法奠定了基础。
文档编号C07K14/765GK101948531SQ20101026039
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月23日 优先权日2010年8月23日
发明者付乔芳, 姜有声, 杨先乐, 符贵红, 胡鲲, 陈力, 黄宣运 申请人:上海海洋大学