专利名称：一种高效纯化金属离子结合蛋白的离子交换层析分离纯化方法
技术领域：
本发明属于蛋白质的分离纯化方法，特别是涉及一种使用新型离子交换层析纯化金属离子结合蛋白的分离纯化方法。
背景技术：
许多蛋白质中含有金属离子辅基，这些金属离子对蛋白质的结构和性质具有重要的意义。金属离子结合蛋白质的纯化过程存在一些困难，在纯化过程中金属离子的丧失会导致蛋白质丧失天然结构，并进一步影响该蛋白质在离子交换层析过程中同其它杂蛋白的分辨率。
发明内容
本发明的目的是提供一种纯化金属离子结合蛋白的新型离子交换层析纯化方法。本发明采用的技术方案步骤如下1)选取含有金属离子结合蛋白的待分离原料，沉淀离心去除脂类等杂质后收集上清液获得蛋白混合物；2)在所得蛋白混合物中添加适量的蛋白结合金属离子；3)选择不与蛋白结合金属离子沉淀的缓冲液作为离子交换层析缓冲液；4)在离子交换层析缓冲液中添加适量的蛋白结合金属离子；5)将蛋白混合物经过离子交换层析和凝胶过滤层析联用的组合层析，分离得到金属离子结合蛋白。本发明所述的待分离原料为转基因动物乳液、转基因工程菌的发酵液、转基因动物细胞的发酵液等，优选为转基因哺乳动物乳液，所述的金属离子结合蛋白优选为转基因人源α-乳清白蛋白、乳转铁蛋白等；以下仅以一种蛋白的分离来加以说明，但本发明的保护不局限与此；牛乳中总蛋白浓度为30-38g/L，重组人源乳清蛋白浓度0. 5-4. Og/L，优选蛋白浓度为1.0-3. 5g/L。本发明所述的沉淀方法可采用酸性沉淀、凝乳酶沉淀或硫酸铵沉淀的方法。在采用酸性沉淀时，需在室温下将待分离原料调节PH到3. 5-5. 5，优选的PH值为4. 0-5. 0，静置 15分钟，离心收集上清液。在采用凝乳酶法时，向待分离原料中加入浓度为5%的凝乳酶溶液，牛乳与凝乳酶溶液体积比例为20-500 1，优选的比例为50-200 1，室温下反应10 分钟，离心收集上清液。在采用硫酸铵沉淀方法时，调节待分离原料的PH到5. 0-10.0，优选的PH值为6. 0-8.0，并通过加入硫酸铵粉末使得乳清中硫酸铵饱和度为20%-60%，以摩尔数计为0. 86-2. 95M，优选的硫酸铵饱和度为30% -60%，以摩尔数计为1. 33-2. 37M，振荡2 小时，离心收集上清液或收集沉淀并使用20mM磷酸盐缓冲液复溶后备用。本发明所述的蛋白结合金属离子为钙离子、三价铁离子等，在蛋白混合物和离子交换缓冲液中的添加浓度优选为l_50mM。蛋白结合金属离子有利于保持金属离子结合蛋白的空间结构，有效地提高其在离子交换层析分离纯化中的分辨率。本发明所述的离子交换层析中，离子交换层析介质采用琼脂糖材料为基质，所述的配基可为DEAE、Q、SP等，优选为DEAE。本发明所述的离子交换层析中，可用的缓冲体系为Tris-HCl缓冲液，甘氨酸-HCl 缓冲液和甘氨酸-NaOH缓冲液，优选的缓冲体系为Tris-HCl缓冲液；低盐缓冲液优选为 20-100mM,pH6. 0-8. 0的Tris-HCl缓冲液，添加蛋白结合金属离子浓度优选为l_50mM ；高盐缓冲液优选为20-100mM，pH6. 0-8. 0的磷酸盐缓冲液，洗脱盐浓度为0. 5-2. 0M，优选浓度为 0. 6-1. 2M，添加蛋白结合金属离子浓度优选为l-50mM。本发明所述的离子交换层析中，将处理得到的蛋白混合物溶液调节pH到 5. 0-10. 0，优选的 pH 值为 6. 0-8. 0。本发明所述的离子交换层析中，本领域技术人员可根据金属离子结合蛋白的种类选择合适的离子交换层析介质、层析柱和进样速度将经预处理后的蛋白混合物溶液进样到用低盐缓冲液平衡好的离子交换层析柱中，层析过程使用^Onm紫外吸收波长进行蛋白质的检测，进样的蛋白混合物溶液体积为0. 5-5. 0倍层析柱体积，优选为1. 0-3. 0倍层析柱体积。本领域技术人员可调节工艺参数以得到不同的金属离子结合蛋白的初步纯化产品或纯品；由于本发明的离子交换层析过程中添加适量的蛋白结合金属离子，从而有效的保持金属离子结合蛋白的天然结构，通过本步骤可以有效地纯化金属离子结合蛋白。本发明所述的凝胶过滤层析中，将金属离子结合蛋白的初步纯化产品再经凝胶过滤层析除去剩余杂质以得到纯品，凝胶过滤层析介质为琼脂糖介质，优选为Superdex 75。本发明相对于现有技术，由于采用了在离子交换层析过程中添加蛋白结合金属离子的方法，可有效地提高金属离子结合蛋白与杂蛋白之间的性质差异，实现金属离子结合蛋白的高效纯化，得到不同的金属离子结合蛋白初步纯化产品或纯品；采用了凝胶过滤层析对初步纯化产品进行了进一步的精制纯化，得到了高纯度的金属离子结合蛋白的纯品； 采用以离子交换层析为核心的复合工艺方法，生产工艺稳定，适于进行金属离子结合蛋白的规模化生产，产品纯度高，工艺回收率高。
图1为分离纯化工艺流程图。图2为离子交换层析分离纯化人源α-乳清白蛋白和牛源α-乳清白蛋白。图3为凝胶过滤I分离纯化人源α -乳清白蛋白。图4为凝胶过滤II分离纯化牛源α -乳清白蛋白。实施例1取25mL转基因人源α-乳清白蛋白牛乳，牛乳总蛋白浓度为33g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为1.4g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为1.0g/L。乳液调节pH4. 6，静置15分钟后使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，调离心力为IOOOOg离心30分钟去除脂类和酪蛋白后收集上清液获得乳清80mL，总蛋白浓度为9. 5g/L，人源α -乳清白蛋白浓度为1. 6g/L，牛源α -乳清白蛋白浓度为1. 2g/L。向乳清中添加氯化钙粉末使得氯化钙浓度为50mM。使用IM的盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清pH到8. 0，进样到用20mM，pH8. 0，含50mM氯化钙的Tris-HCl缓冲液预平衡好的DEAE Sepharose FF离子交换层析柱中，柱内径1. 5 厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波长吸收检测，流速 10ml/min,上样完毕后用20mM，pH8. 0，50M氯化钙的Tris-HCl缓冲液继续冲洗至^Onm紫外吸收信号回到基线。使用20mM，含IM NaCl的pH8. 0的Tris-HCl缓冲液进行线形洗脱， 收集人源α-乳清白蛋白活性峰18mL，总蛋白浓度为3.8g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为 1.2g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0. 2g/L;收集牛源α-乳清白蛋白活性峰18mL，总蛋白浓度为1.5g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为0.2g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为1. Og/L。取离子交换层析人源α -乳清白蛋白活性峰18mL进样到用20mM，pH7. 0含0. IM 硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3. 5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100,紫外280nm波长吸收检测，流速2mL/min， 上样完毕后继续用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集230mL处的蛋白峰共30mL，总蛋白浓度为0. 9g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为0. 7g/L，工艺回收率60%，纯度78%，牛源α-乳清白蛋白浓度为0. lg/L。取离子交换层析牛源α -乳清白蛋白活性峰ISmL进样到用20mM，pH7. 0含0. IM 硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3. 5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100,紫外280nm波长吸收检测，流速2mL/min， 上样完毕后继续用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集230mL处的蛋白峰共30mL，总蛋白浓度为0. 6g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0. 5g/L，工艺回收率60%，纯度83%，人源α-乳清白蛋白浓度为0.05g/L。实施例2取25mL转基因人源α-乳清白蛋白牛乳，牛乳总蛋白浓度为33g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为1.4g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为1.0g/L。乳液调节pH4. 7，静置15分钟后使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，调离心力为IOOOOg离心15分钟去除脂类和酪蛋白后收集上清液获得乳清20mL，总蛋白浓度为9. 5g/L，人源α -乳清白蛋白浓度为1. 6g/L，牛源α -乳清白蛋白浓度为1. 2g/L。向乳清中添加硝酸钙粉末使得硝酸钙浓度为30mM。使用IM的盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清pH到9. 0，进样到用20mM，pH9. 0，30mM硝酸钙的Tris-HCl缓冲液预平衡好的Q Sepharose FF离子交换层析柱中，柱内径1. 5厘米， 柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波长吸收检测，流速IOml/ min，上样完毕后用20mM，pH9. 0含0. M硫酸铵，30M硝酸钾的Tris-HCl缓冲液继续冲洗至 ^Onm紫外吸收信号回到基线。使用20mM，含IM NaCl的Tris-HCl缓冲液进行线形洗脱， 收集人源α-乳清白蛋白活性峰18mL，总蛋白浓度为3. 7g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为 1. lg/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0. 3g/L;收集牛源α -乳清白蛋白活性峰18mL，总蛋白浓度为1.6g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为0.3g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0. 9g/L。取离子交换层析洗脱峰ISmL进样到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3. 5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用 20mM，pH7. 0含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集230mL处的蛋白峰共30mL，总蛋白浓度为0. 8g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为0. 65g/L，工艺回收率56%，纯度81%，牛源α-乳清白蛋白浓度为0. lg/L。
取离子交换层析穿透峰ISmL进样到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3. 5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用 20mM，pH7. 0含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集230mL处的蛋白峰共30mL，总蛋白浓度为0. 6g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0. 48g/L，工艺回收率58%，纯度80%，人源α-乳清白蛋白浓度为0. 06g/L。实施例3取25mL含有转基因人源α -乳清白蛋白的CHO细胞分泌液，总蛋白浓度为IOg/ L，人源α-乳清白蛋白浓度为1.4g/L。使用IM的盐酸或氢氧化钠溶液调节分泌液pH到 9. 0，缓慢加入硫酸铵粉末到硫酸铵饱和度为50%，以摩尔记数为2. 37M，在室温下振荡2小时后，将沉淀样品使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，调离心力为IOOOOg离心30分钟并收集上清液20mL，上清液总蛋白浓度9.5g/L，人源α -乳清白蛋白浓度为1. 6g/L。向处理所得蛋白混合物中添加氯化钙粉末使得氯化钙浓度为40mM。使用IM的盐酸或氢氧化钠溶液调节蛋白溶液pH到6. 0，进样到用20mM，pH6. 0， 40mM氯化钙的Tris-HCl缓冲液预平衡好的DEAE Sepharose FF离子交换层析柱中，柱内径1. 5厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波长吸收检测，流速lOml/min，上样完毕后用20mM，pH6. 0，40M氯化钙的1Tris-HCl缓冲液继续冲洗至 ^Onm紫外吸收信号回到基线。再用20mM，含IM NaCl,pH6. 0的Tris-HCl缓冲液进行阶梯式洗脱并收集洗脱峰18mL，总蛋白浓度为4.0g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为1. 4g/L。取离子交换层析洗脱峰ISmL进样到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3. 5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用 20mM，pH7. 0含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集230mL处的蛋白峰共30mL，总蛋白浓度为0. 9g/L，人源α -乳清白蛋白浓度为0. 8g/L，工艺回收率69 %，纯度89 %。实施例4取25mL转基因人源乳转铁蛋白牛乳，牛乳总蛋白浓度为33g/L，人源乳转铁蛋白浓度为1.7g/L，牛源乳转铁蛋白浓度为0. lg/L。向牛乳中加入浓度为5%的凝乳酶溶液，牛乳与凝乳酶溶液体积比例为50 1，室温下反应10分钟，使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，调离心力为IOOOOg离心10分钟去除脂类和酪蛋白后收集上清液获得乳清20mL，总蛋白浓度为9. 5g/L，人源乳转铁蛋白浓度为2. Og/L，牛源乳转铁蛋白浓度为0. 12g/L。向乳清中添加硝酸铁粉末使得硝酸铁浓度为50mM。使用IM的盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清pH到8. 0，进样到用20mM，pH8. 0，50mM 硝酸铁的Tris-HCl缓冲液预平衡好的SP Sepharose FF离子交换层析柱中，柱内径1. 5 厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波长吸收检测，流速 10ml/min,上样完毕后用20mM，pH8. 0，50M硝酸铁的Tris-HCl缓冲液继续冲洗至^Onm紫外吸收信号回到基线。使用20mM，含IM NaCl的Tris-HCl缓冲液进行线形洗脱，收集人源乳铁蛋白活性峰18mL，总蛋白浓度为3. 8g/L，人源乳铁蛋白浓度为1. 2g/L，牛源乳铁蛋白浓度为0. 05g/L ；收集牛源乳铁蛋白活性峰18mL，总蛋白浓度为1. 5g/L，人源乳铁蛋白浓度为0.9g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0.01g/L。
取离子交换层析洗脱峰ISmL进样到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3. 5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用 20mM，pH7. 0含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集170mL处的蛋白峰共30mL，总蛋白浓度为0. 35g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0. 3g/L，工艺回收率21 %，纯度86 %，牛源乳转铁蛋白浓度为0. 002g/L。取离子交换层析穿透峰ISmL进样到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3. 5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用 20mM，pH7. 0含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集170mL处的蛋白峰共30mL，总蛋白浓度为0. lg/L，牛源乳转铁蛋白浓度为0. 02g/L,工艺回收率，纯度20 %，人源乳转铁蛋白浓度为0. 06g/L。实施例5取IOOmL含有转基因人源乳转铁蛋白的E. Coli发酵液，总蛋白浓度为20g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0.6g/L。使用IM的盐酸或氢氧化钠溶液调节蛋白溶液pH到7.0，缓慢加入硫酸铵粉末到蛋白溶液硫酸铵饱和度为40%，以摩尔记数为1. 84M，在室温下振荡2小时后，将沉淀样品使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，调离心力为IOOOOg离心30分钟收集沉淀，并使用85mL pH7. 0的20mM磷酸盐缓冲液复溶，上清液总蛋白浓度10g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0. 5g/L。向蛋白溶液中添加氯化铁粉末使得氯化铁浓度为30mM。使用IM的盐酸或氢氧化钠溶液调节蛋白溶液pH到7. 0，进样到用20mM，pH7. 0， 30mM氯化铁的Tris-HCl缓冲液预平衡好的CM Sepharose FF离子交换层析柱中，柱内径 1.5厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波长吸收检测，流速10ml/min，上样完毕后用20mM，pH7. 0，30mM氯化铁的Tris-HCl缓冲液继续冲洗至^Onm 紫外吸收信号回到基线。再用20mM，含lMNaCl，pH7. 0的Tris-HCl缓冲液一步洗脱并收集洗脱峰18mL，总蛋白浓度为4g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0. 5g/L。取离子交换层析洗脱峰ISmL进样到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3. 5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外^Onm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用 20mM，pH7. 0含0. IM硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集170mL处的蛋白峰共30mL，总蛋白浓度为0. 4g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0. 3g/L，工艺回收率60%，纯度75%。
权利要求
1.高效纯化金属离子结合蛋白的离子交换层析分离纯化方法，其步骤包括1)选取含有金属离子结合蛋白的待分离原料，沉淀离心去除脂类等杂质后收集上清液获得蛋白混合物；2)在所得蛋白混合物中添加适量的蛋白结合金属离子；3)选择不与蛋白结合金属离子沉淀的缓冲液作为离子交换层析缓冲液；4)在离子交换层析缓冲液中添加适量的蛋白结合金属离子；5)将蛋白混合物经过离子交换层析和凝胶过滤层析联用的组合层析，分离得到金属离子结合蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其中的待分离原料为转基因动物乳液、转基因工程菌的发酵液、转基因动物细胞的发酵液。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白质是有金属离子结合能力的蛋白，如重组人源α-乳清白蛋白，牛源α-乳清白蛋白，重组人乳转铁蛋白等。
4.如权利要求1所述的方法，蛋白结合金属离子为钙离子、三价铁离子等。
5.如权利要求1所述的方法，离子交换层析所用的缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
6.如权利要求1所述的方法，离子交换层析介质为常用的蛋白质层析介质，如琼脂糖基质的DEAE、Q、SP离子交换层析介质等。
全文摘要
本发明一种高效纯化金属离子结合蛋白的离子交换层析分离纯化方法，其步骤为选取含有金属离子结合蛋白的待分离物料，添加沉淀剂进行沉淀粗分离获得蛋白混合物。在蛋白混合物中添加适量的蛋白结合金属离子，以保持目标蛋白的三级结构。将处理所得蛋白混合物进行离子交换层析分离操作，并在层析缓冲液中添加适量的蛋白结合金属离子，由于该金属离子辅基可以有效地保持目标蛋白的天然结构，因此可以有效地提高目标蛋白与杂蛋白在离子交换层析中的分辨率。进一步通过凝胶过滤层析可以得到高纯度、高回收率的金属离子结合蛋白的纯品，生产工艺稳定，适于规模化生产。
文档编号C07K1/36GK102382168SQ20101027146
公开日2012年3月21日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者张焱, 罗坚, 苏志国, 马光辉 申请人:中国科学院过程工程研究所