专利名称：一种从牛软骨提取水解胶原蛋白的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种水解胶原蛋白的制备方法，具体涉及一 种从牛软骨中提取水解胶原蛋白的方法。
背景技术：
水解胶原蛋白(Collagen hydrolysate)是是哺乳动物体内含量最为丰富的动物 蛋白，主要存在于动物的骨、腱、肌鞘、韧带、肌膜、软骨和皮肤中，是结缔组织中极其重要的 一种结构蛋白，起着支撑器官和保护肌体的功能，也是组成细胞间质的最重要功能蛋白质。 胶原蛋白由三条肽链组成，两条α (I)链、一条α ( II )链，这三条肽链以特有的左旋α链 相互缠绕构成胶原右手复合螺旋，其特征是氨基酸呈现链Gly - χ 一 y周期结构，胶原蛋白 分子间及分子内的广泛交联使胶原具有很强的稳定性。绝大多数蛋白酶只能打断胶原侧 链，只有在胶原酶存在下，胶原肽键才会断裂，肽键一旦断裂，螺旋结构随即破坏，断裂的胶 原多肽即可被蛋白酶水解。胶原蛋白可以应用于医疗、饲料、食品、化妆品工业中主要有以 下几个方面(1)胶原蛋白是一种性能优异、应用广泛的生物材料，可制成止血粉剂、烧伤 敷料、药物载体、心脏辨膜、血管、食管和气管的替代材料、外科用缝线等多种形态。(2)用作 生物发酵的培养基，能够有效的促进菌丝的生长，替代进口鱼粉用于混、配合饲料生产以及 颗粒饲料粘结剂。(3)胶原类功能性食品和保健品。还可以改善肉类的品质、用作食品包装 材料、饮料澄清剂。(4)胶蛋白还可用于生产高级化妆品，可以补充皮肤层所需的养分，补 充17种对人体有益的氨基酸；修复组织；保湿；调节和稳定PH值，稳定泡沫，乳化胶体；通 过物理吸附与皮肤和头发结合，能耐漂洗处理。水解胶原蛋白的制备方法主要分为高温水 解、酸水解、碱水解和酶水解等几种，通常采用高温水解、酸水解、碱水解对蛋白结构破坏比 较多，产物成分复杂，口感和营养价值较低；当前国内外比较先进的工艺都是采用酶水解的 方法制备水解胶原蛋白。目前国内外在生产水解胶原蛋白过程中，通过常规方法水解动物的骨头、皮等组 织得到的水解胶原蛋白大多分子量分步范围广、分子量均一性差；而且水解过程中产生的 大量游离氨基酸使得产品的生物活性大大降低，既影响产品口味，又影响功效。本发明充分利用两种蛋白酶定向酶解，同时加入复合酶解保护剂，有效保证产品 的生物活性，同时综合利用现代生化提取分离方法，有效去除产品中的小分子杂质，同时提 高了料液中有效成分含量，节省干燥过程消耗的能量，最终得到了分子量专一、符合食品和 保健品、化妆品要求的水解胶原蛋白产品。本发明以清真宰牲场的牛软骨为基础原料，整个 工艺过程中不加入其他动物源性酶制剂，保证了产品的清真性，也保证了产品的绿色无污 染性，为穆斯林国家及世界各国食品保健品界领域提供十分需要的制品。
发明内容
本发明提供一种从牛软骨中提取水解胶原蛋白的方法，其特征在于，将从清真宰 牲场获取的新鲜牛软骨原料作预处理后，在复合酶解保护剂条件下经木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的酶解，再依次经灭酶，氧化，脱色，过滤，超滤，收集得到的截留液，经喷雾干燥，得到 水解胶原蛋白。本发明提供一种从牛软骨中提取水解胶原蛋白的方法，其特征在于，具体步骤如 下
(1)以从清真宰牲场获取的新鲜牛软骨为原料，去除其脂肪及杂质，用氢氧化钠溶液浸 泡10-30小时，洗净后取出；
(2 )在盛放牛软骨的反应釜中加水，按8500-9000U/g底物的比例加入自植物提取的木 瓜蛋白酶，再加入复合酶解保护剂，保温搅拌，酶解4-6小时；
(3)用氢氧化钠调节pH至9.0-9. 5，按5000U/g底物的比例加入经微生物发酵制备的 碱性蛋白酶，保温搅拌，酶解4-6小时；
(4)升温至80-85°C，灭酶8-12分钟，冷却后加入过氧化氢，保温至30_4(TC，氧化4_6 小时；
(5)再向经上述氧化后的料液中加入活性炭，搅拌2-5小时；
(6)将上述脱色脱臭后的料液经澄清滤板进行过滤，再经纳滤膜进行超滤，收集截留
液；
(7)将收集的截留液进行喷雾干燥，得到所述水解胶原蛋白。本发明所述步骤(4)、(5)是在近中性条件下进行。所述步骤(6)中所述纳滤膜的 规格为200Da。本发明所述步骤(7)得到的水解胶原蛋白中，其中的胶原蛋白的含量达到 95%以上，分子量均一分布在3000Da至3150Da范围内。本发明的复合酶解保护剂，是指在采用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解反应 过程中加入的复合酶解保护剂。本发明的复合酶解保护剂是指“M0111-9酶解保护剂”， “M0111-9”是该试剂的型号，其主要作用是保护酶解过程中的特定肽链不被破坏，从而得到 分子量均一(即分子量为3000道尔顿至3150道尔顿之间)的产物。普通国家标准规定，水 解胶原蛋白分子量范围为500道尔顿至20000道尔顿之间，而分子量为3000道尔顿的水解 胶原蛋白，其生物活性最强，最适合被人体吸收。本发明的碱性蛋白酶，是指“2709碱性蛋白酶”，即是一种由细菌原生质体诱变选 育出的地衣芽孢杆菌2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分 为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多 肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力，广泛应用于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革 等行业。本发明的目的是从牛软骨中提取分子量专一的水解胶原蛋白。在工艺技术上，改 进了常规技术原料利用不充分、生物活性被破坏、产物中分子量分布范围广、有效成分含量 低、产品有异味等缺陷。本发明利用新鲜牛软骨为原料，采用木瓜蛋白酶和2709碱性蛋白 酶两步定向酶解的工艺，同时在酶解过程中加入M0111-9复合酶解保护剂，综合利用膜分 离和离心喷雾干燥等生化提取分离方法，从牛软骨中制得符合食品和保健品、化妆品要求 的水解胶原蛋白。胶原蛋白是哺乳动物体内含量最为丰富的动物蛋白，可以应用于医疗、食品、化妆 品工业中，可制成止血粉剂、烧伤敷料、药物载体、心脏辨膜、血管、食管和气管的替代材料、 外科用缝线等多种形态，用作生物发酵的培养基，配合饲料生产以及颗粒饲料粘结剂；胶原类功能性食品和保健品；还可以改善肉类的品质、用作食品包装材料、饮料澄清剂和生产高 级化妆品。本发明的优点在于，①在原料选择上及反应过程中，采用来源于清真宰牲场的新 鲜牛软骨为主要原料，采用植物提取的木瓜蛋白酶，采用微生物发酵制备的碱性蛋白酶，不 加入其他动物源性酶制剂，不采用其他非清真原料，保证了产物的清真性，符合向穆斯林国 家供应食品和保健品日化原料的要求；②采用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的两步定向酶解的 工艺，同时在酶解过程中加入酶解保护剂，保证最大程度上实现原料的水解；③采用复合酶 解保护剂，保证了水解酶在进行定向酶解反应的同时不破坏水解产物的生物活性，保证了 产物分子量的均一性，有效保障了产物的生物活性和优良品质；④采用几乎中性条件下用 过氧化氢脱色，然后用活性炭脱臭，充分利用活性炭的吸附作用和助滤作用，提高了产品含 量，同时缩短了工艺时间；⑤采用200Da的纳滤膜进行膜分离，有效去除了小分子杂质，同 时还对料液进行了浓缩，大幅降低了喷雾干燥过程的能耗；⑥有效保证产物的分子量均一 地分布在3000Da至3150Da范围内，蛋白含量达到95%以上。
图1是水解胶原蛋白的电泳检测分子量分布图。
具体实施例方式以下结合具体实施例来进一步说明本发明。本发明的工艺路线
牛软骨一预处理一一次定向保护酶解一二次定向保护酶解一灭酶一氧化一脱色一 过滤一膜分离一喷雾干燥一水解胶原蛋白 本发明的工艺过程(按以下次序进行)
(1)以从清真宰牲场获取的新鲜牛软骨为原料，剪去脂肪等杂物，称重，切成小块，用3% 氢氧化钠溶液浸泡24小时，洗净。(2)在盛放牛软骨的反应釜中加水，按8500_9000U/g底物的比例加入自植物提取 的木瓜蛋白酶，再加入0. 03%M0111-9复合酶解保护剂，保持45-50°C，搅拌，酶解时间5小 时。(3) 一次酶解后，用氢氧化钠调pH至9. 0-9. 5，按5000U/g底物的比例，加入经微 生物发酵制备的碱性蛋白酶，保温40-45。C，搅拌，酶解3小时。本发明“经微生物发酵制备的碱性蛋白酶”，是指本发明用的“2709碱性蛋白酶”， 是来源于微生物发酵的产物。除碱性蛋白酶外，来源于微生物发酵的酶还包括中性蛋白 酶、5’ -磷酸二酯酶、纤维素酶、糖化酶、果胶酶。(4)酶解结束后，升温至80_85°C，灭酶10分钟，冷却至30_40°C，加入料液量1. 2% 的过氧化氢，保温30-40°C，氧化2. 5小时。上述所指料液指经过酶解反应、升温灭酶后冷却 至30-40°C的物料。(5)再向料液中加入2%的活性炭，搅拌2. 5小时。此处料液是指经过上一步中2. 5 小时氧化反应后得到的物料。(6)经脱色后的料液用澄清滤板过滤，得到的滤液经200Da纳滤膜进行超滤，收集 截留液。
(7)在180°C进风温度/85°C出风温度条件下，将截留液进行喷雾干燥后，得到水 解胶原蛋白成品。本发明所述步骤(4)、(5)是在近中性条件下进行。所述步骤(6)中所述纳滤膜的 规格为200Da。本发明所述步骤(7)得到的水解胶原蛋白中，其中的胶原蛋白的含量达到 95%以上，分子量均一分布在3000Da至3150Da范围内。本发明采用定向保护酶解技术制备的水解胶原蛋白，如图1所示，其分子量均一 地分布在3000Da至3150Da范围内。在上述分子量范围的本发明水解胶原蛋白具有更好的 口感、更强的生物活性，更强的保健功效。将本发明方法制备的水解胶原蛋白产品与采用普 通酶解技术制备的水解胶原蛋白进行比较，经电泳法测定其分子量分布如图1所示。本发明采用源于清真宰牲场的新鲜牛软骨为主要原料，在工艺技术上，改进了常 规技术原料利用不充分、生物活性被破坏、产物中分子量分布范围广、有效成分含量低、产 品有异味等缺陷。本发明采用木瓜蛋白酶和2709碱性蛋白酶两步定向酶解的工艺，同时加 入M0111-9复合酶解保护剂，综合利用膜分离和离心喷雾干燥等生化提取分离方法，最大 程度上将原料水解为3100Da的蛋白产品，有效确保其生物活性，并有效去除产品中的小分 子杂质，提高料液中有效成分含量，节省干燥过程消耗的能量，得到分子量专一、符合清真 品质要求、符合食品和保健品及化妆品要求的水解胶原蛋白产品。本发明适合于工业化生 产。实施例1
将清真宰牲场取出的牛软骨剪去脂肪等杂物，称取100kg，切成小块，用3%氢氧化钠浸 泡24小时，洗净。加入200kg的水，加热至45°C，按8500-9000U/g底物的比例加入木瓜蛋 白酶，再加入0. 03%的M0111-9复合酶解保护剂，保持45-50°C，搅拌酶解时间5小时；然后 用氢氧化钠调PH至9. 0-9. 5，按5000U/g底物的比例加入2709碱性蛋白酶，在40-45°C的恒 温下，搅拌酶解3小时，在80-85°C下灭酶10分钟，冷却到30-40°C，加入3600ml (料液量的 1. 2%)的过氧化氢，保温30-40°C氧化2. 5小时；再向料液中加入6kg的活性炭，搅拌2. 5小 时，用澄清滤板过滤，得到的滤液经200Da纳滤膜进行超滤，截留液在180°C进风温度/85°C 出风温度条件下进行喷雾干燥，得水解胶原蛋白32. 5kg。对产品进行测定，水解胶原蛋白中 蛋白含量为96. 7%，其平均分子量为3100Da且全部分布在3000Da至3150Da范围内。实施例2
将清真宰牲场取出的牛软骨剪去脂肪等杂物，称取500kg，切成小块，用3%氢氧化钠浸 泡24小时，洗净。加入IOOOkg的水，加热至45°C，按8500-9000U/g底物的比例加入木瓜 蛋白酶，再加入0. 03%的M0111-9复合酶解保护剂，保持45-50°C，搅拌酶解时间5小时；然 后用氢氧化钠调PH至9. 0-9. 5，按5000U/g底物的比例加入2709碱性蛋白酶，在40-45°C 的恒温下，搅拌酶解3小时，在80-85°C下灭酶10分钟，冷却到30-40°C，加入18000ml (料 液量的1. 2%)的过氧化氢，保温30-40°C氧化2. 5小时；再向料液中加入30kg的活性炭，搅 拌2. 5小时，用澄清滤板过滤，得到的滤液经200Da纳滤膜进行超滤，截留液在180°C进风 温度/85°C出风温度条件下进行喷雾干燥，得水解胶原蛋白164.2kg。对产品进行测定，水 解胶原蛋白中蛋白含量为95.9%，其平均分子量为3 IOODa且全部分布在3000Da至3150Da 范围内。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的保护范围。即凡依本发明的内容所作的等效变化与修饰，都应属于本发明的范畴。
权利要求
一种从牛软骨中提取水解胶原蛋白的方法，其特征在于，将从清真宰牲场获取的新鲜牛软骨原料作预处理后，在复合酶解保护剂条件下经木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的酶解，再依次经灭酶，氧化，脱色，过滤，超滤，收集得到的截留液，经喷雾干燥，得到水解胶原蛋白。
2.如权利要求1所述从牛软骨中提取水解胶原蛋白的方法，其特征在于，具体步骤如下(1)以从清真宰牲场获取的新鲜牛软骨为原料，去除其脂肪及杂质，用氢氧化钠溶液浸 泡10-30小时，洗净后取出；(2 )在盛放牛软骨的反应釜中加水，按8500-9000U/g底物的比例加入自植物提取的木 瓜蛋白酶，再加入复合酶解保护剂，保温搅拌，酶解4-6小时；(3)用氢氧化钠调节pH至9.0-9. 5，按5000U/g底物的比例加入经微生物发酵制备的 碱性蛋白酶，保温搅拌，酶解4-6小时；(4)升温至80-85°C，灭酶8-12分钟，冷却后加入过氧化氢，保温至30_4(TC，氧化4_6 小时；(5)再向经上述氧化后的料液中加入活性炭，搅拌2-5小时；(6)将上述脱色脱臭后的料液经澄清滤板进行过滤，再经纳滤膜进行超滤，收集截留液；(7)将收集的截留液进行喷雾干燥，得到所述水解胶原蛋白。
3.如权利要求1所述从牛软骨中提取水解胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤 (4)、(5)是在近中性条件下进行。
4.如权利要求1所述从牛软骨中提取水解胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(6) 中所述纳滤膜的规格为200Da。
5.如权利要求1所述从牛软骨中提取水解胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(7) 得到的水解胶原蛋白中，其中的胶原蛋白的含量达到95 %以上，分子量均一分布在3000Da 至3150Da范围内。
全文摘要
本发明提供一种从牛软骨中提取水解胶原蛋白的方法，依次包括以下步骤以从清真宰牲场获取的新鲜牛软骨为原料，用氢氧化钠溶液处理后，分阶段加入木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶，同时加入复合酶解保护剂，经两次酶解后再升温灭酶，经氧化脱色，过滤超滤，收集截留液，喷雾干燥后得到水解胶原蛋白。本发明以清真宰牲场的牛软骨为基础原料，整个工艺过程中不加入其他动物源性酶制剂，可以保证产品的清真性，且无污染。
文档编号C07K1/34GK101948900SQ20101050082
公开日2011年1月19日 申请日期2010年10月9日 优先权日2010年10月9日
发明者唐甜, 苏有录, 苏翰 申请人:上海阿敏生物技术有限公司