专利名称：虎纹捕鸟蛛蛋白酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶抑制剂，具体涉及一种虎纹捕鸟蛛蛋白酶抑制剂。
背景技术：
蛋白酶抑制剂广泛存在于动物毒液、植物和微生物中，具有能被开发成有利于人类 健康的新药应用前景。如，Kimitz型(一种结构模体的名称)丝氨酸蛋白酶抑制剂BPTI (牛 胰蛋白酶抑制剂)，它是到目前为止发现的世界上活性最强的蛋白酶抑制剂之一，它通过与酶 的活性位点结合而抑制蛋白酶的活性，因而在治疗胰腺炎、烧伤后休克、产后大出血、急性循 环衰竭、出血性脑水肿、手术中及创伤后出现的纤溶亢进性出血的防治等领域都表现出很好 的疗效，在爱滋病的治疗方面也有一定的临床应用。中国专利ZL200310110608. 1公开的虎纹 捕鸟蛛毒素-XI也是一种抑制作用较强的胰蛋白酶抑制剂。但是这种抑制剂在后面的实验中 发现还同时具有一定的钾离子通道阻断活性，这个活性对开发成为蛋白酶抑制剂方面的药物 是没有意义的，甚至还可能存在某些未知的副作用。因此如何获得抑制专一性强并且副作用 小的蛋白酶抑制剂，来满足新药开发和人类健康的需要，是值得研究的问题。
发明内容
本发明旨在于提供一种抑制专一性强、没有神经毒性的虎纹捕鸟蛛蛋白酶抑制剂
ο本发明提供的这种虎纹捕鸟蛛蛋白酶抑制剂是将虎纹捕鸟蛛毒素-XI的第5位精 氨酸突变为亮氨酸、第6位亮氨酸突变成谷氨酸、第10位精氨酸突变为苏氨酸，得到虎纹捕 鸟蛛毒素-XI的突变体，该突变体的氨基酸序列为
lie Asp Thr Cys Leu Glu Pro Ser Asp Thr Gly Arg Cys Lys Ala Ser Phe Glu Arg Trp Tyr Phe Asn Gly Arg Thr Cys Ala Lys Phe lie Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gly Asn Lys Phe Pro Thr Gln Glu Ala Cys Met Lys Arg Cys Ala Lys Ala
虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体，对钾通道抑制作用很弱，没有神经毒性。虎纹捕鸟蛛毒 素-XI突变体与天然虎纹捕鸟蛛毒素-XI相比是一种抑制专一性强、更具有特异性的蛋白 酶抑制剂，能满足新药开发的要求。
图1是虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体的反向高效液相色谱纯化图谱。图2是虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体的质谱鉴定图。图3是虎纹捕鸟蛛毒素-XI抑制钾离子通道的图谱。图4是虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体抑制钾离子通道的图谱。
具体实施例方式虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体(mHWTX-XI)通过基因表达的途径获得，具体操作如
3下
将虎纹捕鸟蛛毒素-XI (见中国专利ZL200310110608. 1)第5位精氨酸突变为亮氨酸、 第6位亮氨酸突变成谷氨酸、第10位精氨酸突变为苏氨酸，根据虎纹捕鸟蛛毒素-XI的成 熟蛋白序列结合突变位点情况设计弓I物
pa: 5’- CGTCTAGATAAGAGAATAGATACATGCCTTGAACCCTCTGACACTGGGAG -3，和 pd :5’-CCGAAGCTTATGCTTTTGCACATCTTTTCATG -3，，以虎纹捕鸟蛛毒素-XI的cDNA为模板(见中国 专利ZL200310110608. 1)进行基因扩增，扩增反应体系为
Α.IOxPCR缓冲液5. 0μ 1B.25mM MgCl23. 0μ 1C.IOmM dNTP Mix0. 6μ 1D.10 μ M pa1. 0μ 1Ε.10 μ M pd1. 0μ 1F.HWTX-XI的cDNA合成液1. 0μ 1G.Taa酶0. 4μ 1H.ddH20 至总体积50. 0μ 1扩增条件
94°C预变性5min
94°C变性 lmin，63°C退火 lmin, 72°C延伸 Imin (30 个 circle) 72°C 延伸 5min
扩增反应完毕后纯化目的DNA片段，连接到pVT102U载体(中科院上海生物化学与细 胞生物学研究所戚正武院士赠送)并转化大肠杆菌T0P10，提取质粒转入宿主细胞S-78酵 母中进行分泌表达。将表达上清用抽滤瓶抽滤，过0.45 μ M滤膜，用2个柱体积的平衡液 (0. IM NaAc ρΗ4· 2)平衡CM — Sepharose阳离子交换柱(3cmX30cm)，所得到的滤液直接 上CM-wpharose阳离子交换柱进行分离，分级洗脱，取目标峰进一步反相高效液相色谱纯 化(见图1)。然后用MALDI-T0F质谱鉴定(见图2)。用这种方法可得到表达产量为6. 7mg/L。为了更好地说明和揭示该毒素分子的作用，我们利用分光光度计测定了虎纹捕 鸟蛛毒素-XI突变体对胰蛋白酶的抑制活性。我们通过膜片钳技术分析了虎纹捕鸟蛛毒 素-XI及其突变体对于大鼠背根神经节细胞(DRG)电压门控钾离子通道的抑制活性。进一 步采用小鼠脑室注射的方法检测虎纹捕鸟蛛毒素-χι的神经毒性。主要材料和仪器
虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体按上述方法得到，同时通过高效液相色谱和MALDI-T0F 质谱仪鉴定了其纯度在99%以上；胰蛋白酶(TPCK处理)为Sigma产品，其他化学试剂均达 到分析纯。1.实验仪器ProFLEX III型 MALDI-TOF (Matrix-assisted Laser desorption/ ionization-time-of-flight)质谱仪，Waters650E 型 HPLC 系统(486UV 检测器， millennium 色谱工作站)，Waters HPLC workstation (515pump，2487UV 检测器)。U-2000型紫外-可见分光光度计(日本HITACHI产品)，等温滴定热分析仪VP-ITC (Microcal Inc. , Northampton, ΜΑ),双电极电压钳(TURBO TEC-03X)。
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2.实验方法和结果
2. 1用分光光度计测定虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体对胰蛋白酶抑制活性 以N-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基苯胺(5X 10 — 4M)为底物，加入一定量的胰蛋白酶， 取不同量的虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体与之反应，整个反应在PH 8.0、浓度为0.05 mol/ L的Tris-盐酸缓冲体系中进行，反应温度为25°C。在405nm测定光吸收值，并用双倒数法 得到了虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体与胰蛋白酶抑制的平衡常数。结果表明虎纹捕鸟蛛毒 素-XI突变体对trypsin的抑制常数与野生型的在同一数量级。2. 2虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体对钾通道的作用
在大鼠背根神经节细胞上表达钾通道。通过膜片钳检测表明，虎纹捕鸟蛛毒素-XI突 变体对大鼠DRG细胞上钾通道电流抑制作用较弱，其IC5tl值超过了 ΙΟΟμΜ (见图4)，而虎 纹捕鸟蛛毒素-XI对钾通道在10 μ M浓度下能抑制60%的电流(见图3)。2. 3虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体神经毒性的检测
脑室注射(intracerbroventricular，icv)给药用去头皮法。昆明种小鼠雌雄 各半，体重18 22g。实验前对小鼠实施乙醚麻醉，以两耳连线的中点为中心剪去皮肤约 5 X 5mm，实验时在矢状缝和人字缝交点一侧1 2mm间用微量注射器注入药液15μ L，注射 完后立即观察动物反应，观察48小时。结果表明小鼠脑室注射虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变 体反应与生理盐水组相同，剂量达到25 mg/kg时未见明显毒性反应，小鼠可存活，而注射虎 纹捕鸟蛛毒素-XI后，表现出极度兴奋，剧烈奔跑、翻滚等现象，严重的全身抽搐，最后衰竭 而死，半数致死剂量LD50值为247. 34 μ g/kg。上述实验结果表明虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体是一种很强的胰蛋白酶抑制剂。膜 片钳实验证明虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体对钾通道抑制作用很弱，脑室注射实验证明虎纹 捕鸟蛛毒素-XI突变体没有神经毒性，该结果与膜片钳实验结果相吻合。虎纹捕鸟蛛毒 素-XI突变体与天然虎纹捕鸟蛛毒素-XI相比是一种更具有特异性的蛋白酶抑制剂。本发明的虎纹捕鸟蛛蛋白抑制剂即可克隆获得，而且抑制活性高于BPIT，是一种 很强的胰蛋白酶抑制剂。虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体的氨基酸序列为
lie Asp Thr Cys Leu Glu Pro Ser Asp Thr Gly Arg Cys Lys Ala Ser Phe Glu Arg Trp Tyr Phe Asn Gly Arg Thr Cys Ala Lys Phe lie Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gly Asn Lys Phe Pro Thr Gln Glu Ala Cys Met Lys Arg Cys Ala Lys Ala
权利要求
一种虎纹捕鸟蛛蛋白酶抑制剂，其特征在于对虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化的虎纹捕鸟蛛毒素 XI进行分子改造并应用酵母表达的方法得到的虎纹捕鸟蛛毒素 XI突变体，该虎纹捕鸟蛛毒素 XI突变体的氨基酸序列为Ile Asp Thr Cys Leu Glu Pro Ser Asp Thr Gly Arg Cys Lys Ala Ser Phe Glu Arg Trp Tyr Phe Asn Gly Arg Thr Cys Ala Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gly Asn Lys Phe Pro Thr Gln Glu Ala Cys Met Lys Arg Cys Ala Lys Ala。
全文摘要
本发明公开了一种蛋白酶抑制剂是将虎纹捕鸟蛛毒素-XI的第5位精氨酸突变为亮氨酸、第6位亮氨酸突变成谷氨酸、第10位精氨酸突变为苏氨酸，得到虎纹捕鸟蛛毒素-XI的突变体，虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体，对钾通道抑制作用很弱，没有神经毒性。虎纹捕鸟蛛毒素-XI突变体与天然虎纹捕鸟蛛毒素-XI相比是一种抑制专一性强、更具有特异性的蛋白酶抑制剂，能满足新药开发的要求。
文档编号C07K14/81GK101979411SQ20101051361
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月21日 优先权日2010年10月21日
发明者刘中华, 曾雄智, 梁宋平, 王凡, 王贤纯, 霍林巨 申请人:湖南师范大学