专利名称：一种辅酶q10层析硅胶的在线再生方法
技术领域：
本发明涉及一种层析硅胶的再生方法，特别指一种辅酶QlO层析硅胶的在线再生 方法。
背景技术：
辅酶QlO (Ubiquinone, Coenzyme Q10, CoQlO)在氧化呼吸链中起传递电子和质子 的重要作用，是形成ATP的关键，具有保护和恢复生物膜结构的完整性、稳定膜电位和增强 免疫反应等作用，被广泛应用于心力衰竭、冠心病、高血压病、糖尿病、癌症、艾滋病、急慢性 肝炎、帕金森症等疾病的辅助性治疗。目前，辅酶QlO独立成分或复合成分的药品超过100项。辅酶QlO在欧、美、日等国被广泛用于食品、保健品和化妆品行业，由于其在体内 可直接参与代谢，无毒副作用，辅酶QlO的基础研究和临床研究在日本及欧洲国家已广泛 深入地展开。近年研究发现辅酶QlO还可参与调控人类信号转导、代谢以及蛋白转运中相 关基因的表达，辅酶QlO的市场前景十分广阔。国内外传统的辅酶QlO生产方法主要有动植物组织提取法、化学合成法和微生物 发酵法三种。动植物组织提取法受限于原料中辅酶QlO的含量，提取的产量低、成本高；化 学合成法在合成时会发生顺、反异构，得到各类异构体的混合物，需要分离，也增加了合成 成本，在化学合成时会加入一些有毒试剂，对纯化获得适用于临床的产品也提出了更高的 要求；微生物发酵法是近年兴起的新生产方法，由于微生物细胞易于大规模培养生长，产品 完全为天然的全反式构型，生物利用度高，而且相对于化学合成法安全、高效，产品中几乎 无化学毒害物质残留，易于分离纯化，临床疗效较好，是最有开发前景的生产方法。微生物发酵法生产辅酶QlO的提纯过程一般采用如下工艺发酵液经过过滤后， 滤渣干燥制粒，得到辅酶QlO菌粉，菌粉再用有机溶剂浸泡提取。提取液浓缩至一定含量后 上硅胶柱层析，采用石油醚、丙酮混合溶剂进行洗脱，洗脱液经减压浓缩干，加无水乙醇结 晶，过滤烘干得到辅酶QlO结晶粗品。硅胶作为一种吸附剂具有很大的比表面积，它吸附力强，广泛应用于医药、化工等 多种行业的柱层析分离提纯。硅胶在柱层析过程中，会吸附一些强极性的杂质，堵塞颗粒孔 道，使其活性下降。硅胶的生产成本也比较高，且生产过程会污染环境。在辅酶QlO的提纯过程中，柱层析工序所占成本超过50%，其中硅胶消耗及溶剂 损耗更是占据了主要成本，这使得辅酶QlO的生产成本居高不下。中国专利公开号CN 101445435A介绍了一种辅酶QlO清洁纯化工艺将辅酶QlO 用有机溶剂溶解，应用高压液相制备柱或中压硅胶填充柱，以洗脱剂洗脱，分段收集，获得 高纯度的辅酶QlO产品。所述装柱的硅胶经200 300°C高温活化后重复使用10 200 次。其硅胶再生方法采用高温活化方法，该方法能耗大，而且每次柱层析过程完成后均需将 硅胶从柱内拆下来，不但劳动强度大，而且还会造成溶剂挥发、产生静电着火等安全问题， 溶剂损耗也大。高温煅烧的方法虽能将硅胶内的有机杂质去除，但同时也会改变硅胶内部孔径结构，造成硅胶吸附力下降。公开号CN 1110550C(烟草为原料制备辅酶QlO的方法)、CN101314782A (发酵生 产辅酶QlO的方法)、CN 101429108A (分离辅酶QlO的提纯方法)、CN 1762958A (—种提高 辅酶QlO合成收率的方法)、CN 101111465A (制备纯净的或富集的辅酶QlO的方法)等专 利均有介绍辅酶QlO的柱层析工艺，但均未涉及到柱层析硅胶的重复使用方法。美国专利US2007/0025976A1公开了一种辅酶QlO的提纯工艺，提到一种硅胶的再 生方法在室温下用1倍柱体积的乙醇洗脱，然后用4 5倍柱体积的己烷在50°C下洗脱。公开号CN 101249416A(层析中性氧化铝活化再利用方法)涉及一种吸附剂(层 析中性氧化铝)再生(活化)的方法，该方法的再生过程包括热水溶解、碱化洗净、氯化更 新、脱水、熔烧、过滤和还原，步骤繁多，成本也高，因此不适合用在硅胶的活化再生。公开号CN 1724530A(—种连续中压柱层析制备高纯度EGCG的方法)公开一种 硅胶再生方法使用后的层析柱用酯溶剂再生，烃溶剂为平衡剂平衡，平衡后的层析柱可重 复使用，使用次数达30次以上。公开号CN 100552889C(—种连续中压柱层析制备高纯度 异癸十异戊二烯基醇的方法)提到一种硅胶再生方法梯度洗脱过程中烃溶剂和乙酸乙酯 的混合液再生柱子后，通入50 751热队吹干溶剂，层析柱可反复使用。“中压硅胶柱层 析连续纯化茶叶中EGCG及ECG的研究”(林产化学与工业第27卷第2期2007年4月)提 到一种层析柱的再生方法使用后的层析柱用乙酸乙酯再生，石油醚为平衡剂平衡，平衡后 的层析柱可重复使用。“层析用硅胶G再生的可行性及方法研究”(离子交换与吸附2007， 23(1) :82 87)提到一种硅胶的再生方法将使用过的层析用硅胶装入层析柱中，抽实后 用3倍柱体积的甲醇冲洗柱子，然后以3倍柱体积的石油醚冲柱，最后用2倍柱体积的氯仿 洗柱就即可，再生后的硅胶用来分离苦豆子总生物碱，结果证明硅胶是可以经过再生而重 复使用的，可以作为工业分离介质应用于生物活性物质的大规模制备。“硅胶柱层析法纯化 天然维生素E” (中国食品添加剂2008年03期)也介绍了一种层析柱的再生方法层析柱 用2倍床层体积的甲醇洗脱，再用3倍床层体积的流动相洗脱，重复进行5次层析分离，重 复性好，层析再生效果较好。以上专利或文献有过硅胶柱的再生方法相关报道，但都是采用正向洗柱的方法， 硅胶重复使用的次数少。硅胶柱层析本身是一种正相层析，弱极性物质先被洗脱下来，强极 性杂质被吸附在柱头上，若采用正向洗柱，强极性杂质被往下洗脱的过程中会再次污染没 有吸附强极性杂质的硅胶，从而造成硅胶的使用次数大大减少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种辅酶QlO层析硅胶的在线再生方法，此再生 方法可实现层析柱重复使用20次以上。每使用20次后，采用反方向双氧水洗和热水洗一 次，再拆下硅胶烘干活化至水分小于5%，重新装柱即可恢复至新硅胶98%以上的水平。按 此洗柱方法，硅胶使用次数可达100次以上，大大降低层析硅胶的消耗。本发明要解决的技术问题由如下方案来实现一种辅酶QlO层析硅胶的在线再生 方法，其特征是经分离提纯辅酶QlO后的硅胶层析柱，从柱底进乙酸乙酯、丙酮、丁酮、乙 醇几种高极性溶剂中的一种进行反方向洗柱，除去强极性杂质，再从柱顶进石油醚、戊烷、 正己烷、庚烷几种低极性溶剂中的一种进行正向平衡，洗柱及平衡温度为20 50°C，流速为1/2 2倍柱体积/小时，洗柱及平衡后的层析柱再用于分离提纯辅酶Q10，此方法可实 现层析柱重复使用20次以上，每使用20次后，采用反方向双氧水洗和热水洗一次，再拆下 硅胶于100°C 150°C下烘干活化至水分小于5%，重新装柱即可恢复至新硅胶98%以上的 水平。本发明还包括如下方案所述洗柱是采用从柱底进高极性溶剂反方向洗，平衡是 从柱顶进低极性溶剂正向平衡。所述洗柱的高极性溶剂用量为1 5倍柱体积，平衡的低 极性溶剂用量为1 5倍柱体积。所述双氧水浓度为3 20%，双氧水洗和热水洗的温度 为50 100°C，用量为1 5倍柱体积。所述的双氧水可以是酸性、中性或碱洗，调酸可以 采用盐酸、硫酸或磷酸，调碱可以采用氢氧化钾或氢氧化钠。烘干可以是常压烘干和减压烘 干。本方法具体步骤如下(1)将硅胶装入层析柱内，边装边用橡皮锤敲击柱体，使硅胶装的紧密结实，装完 柱后用低极性溶剂平衡2小时；(2)平衡后将辅酶QlO上样液通过硅胶柱进行层析，采用洗脱剂进行洗脱得到辅 酶QlO洗脱液；(3)收集完辅酶QlO洗脱液后，从柱底进高极性溶剂进行反方向洗柱，再从柱顶进 低极性溶剂进行正向平衡；洗柱、平衡后的层析柱直接再用于辅酶QlO上样液的层析；(4)层析柱每使用20次后，通过反方向双氧水洗和热水洗一次，再拆下硅胶于 100 150°C下烘干活化至水分小于5%，重新装柱即可重复用于辅酶QlO的柱层析。步骤(1)所述硅胶层析柱柱内径25 500mm，柱长300 5000mm，硅胶目数60 400目、水分小于5%，柱压0. 1 2MPa ；步骤(2)所述的上样液为用有机溶剂从辅酶QlO菌粉中提取的提取液，所述有机 溶剂可以是石油醚、戊烷、正己烷、庚烷中的一种，优选石油醚和正己烷；步骤(3)所述高极性溶剂可以是A类溶剂(乙酸乙酯、丙酮、丁酮、乙醇)中的单 独一种或A类中的一种与B类(石油醚、戊烷、正己烷、庚烷)中的一种的混合溶剂，其中A 类中的一种比例> 50%，优选> 90%，最优选100% ；所述低极性溶剂可以是B类中的单独 一种或B类中的一种与A类中的一种的混合溶剂，其中B类中的一种的比例大于90%，优选 > 98%，最优选 100% ；步骤(3)所述洗柱的高极性溶剂用量为1 5倍柱体积，优选3倍柱体积；平衡的 低极性溶剂用量为1 5倍柱体积，优选3倍柱体积；洗柱和平衡的温度为20 50°C ；步骤(4)所述双氧水的浓度为3 20 %，优选5%，用量为1 5倍柱体积；所述热 水可以是自来水、软水、去离子水，用量为1 5倍柱体积；双氧水洗和热水洗温度为50 IOO0C ；步骤⑷所述双氧水可以是酸性、中性、碱性，优选pH = 9 11 ；步骤(4)所述硅胶活化温度为100 150°C，可以是常压或减压烘干，优选减压烘 干，烘干后的硅胶水分控制< 5% ；层析收率计算方法分段收集含辅酶QlO的层析液，采用TLC检测，合并合格的层 析液，取样用HPLC检测层析液中的辅酶QlO外标含量及面积归一法含量，层析收率=(合 格的层析液体积X层析液外标含量)/(上样液体积X上样液含量)X 100% ；
硅胶重复使用效果判断对比相同上样量、洗脱剂、洗脱条件下，层析收率的高低， 当层析收率大于90%，则判断为重复使用效果较好，当层析收率小于90%，则判断为重复 使用效果变差。本发明的优点是1、本发明层析硅胶可重复使用100次以上，大大降低层析硅胶的消耗，从而降低 生产成本；2、采用柱内洗柱，实现连续生产，减少拆装柱的次数，整个生产过程做到全封闭体 系，既减轻劳动强度，又减少溶剂挥发，达到清洁生产的目的；3、采用反方向洗柱技术，有效防止正向洗柱时吸附柱头的强极性杂质再次污染其 他硅胶，大大提高了硅胶的使用次数；4、硅胶使用到一定次数后，针对辅酶QlO层析所吸附杂质的特点，采用双氧水洗 和热水洗，可有效清除有机溶剂难以洗脱掉的那部分强极性杂质，使硅胶恢复活性；5、拆柱前先用水洗过，柱内不残留溶剂，防止由于溶剂存在引起拆柱时产生静电 火花的危险，确保了生产的安全；6、采用在线洗柱替代传统的锅内搅拌洗涤，洗涤时溶剂浓度梯度大，大大提高洗 柱的效率。
图1为本方法的工艺流程图
具体实施例方式通过以下实施例来对本发明做进一步具体说明，但并不仅限于以下实施例中的工 艺参数范围。实施例层析柱内径400mm，柱长4000mm，硅胶200Kg(200 300目)，采用湿法装柱，边装 边用橡皮锤敲打柱体，使硅胶装的紧密结实。装完后的层析柱用石油醚平衡2小时。取300L辅酶QlO浸膏(采用石油醚从辅酶QlO菌粉中提取的浓缩物，含量30mg/ ml)，通过柱塞式计量泵上硅胶柱层析，上完样后用石油醚/丙酮(20/1)混合溶剂进行洗 脱，TLC检测收集辅酶QlO层析液，合并合格的层析液，取样用HPLC检测层析液中的辅酶 QlO含量，层析收率为95. 3%，层析液主峰HPLC面积归一法含量为98. 12%。洗脱完辅酶QlO后的层析柱，从柱底泵入1500L的丙酮进行反方向洗柱至柱顶流 出液无色，再从柱顶泵入1500L的石油醚平衡层析柱。平衡后的层析柱重新用来进行辅 酶QlO浸膏的层析，按上述相同的上样量、洗脱方式及收集方法，重复使用的层析收率为 94.8%，层析液主峰HPLC面积归一法含量为98. 10%。按此洗柱方法和层析方法用该硅 胶层析柱连续重复使用，第20次层析收率为93. 8%，层析液主峰HPLC面积归一法含量为 98. 07%。取上述使用过20次的硅胶层析柱，从柱底泵入预先用氢氧化钠调节PH =10，浓度 为5%的双氧水，温度80°C，用量为2倍柱体积，再泵入2倍柱体积80°C热水洗涤，洗完后用 N2将水压干，拆下硅胶，置于150°C干燥器内抽真空烘干至硅胶水分小于5%。烘干后的硅胶呈灰白色，重新装入层析柱进行第21次层析，层析收率为94. 5%，层析液主峰HPLC面积 归一法含量为98. 08%。此后再用丙酮反方向洗柱、石油醚正向平衡后进行重复使用，每隔 20次采用双氧水、热水洗涤一次，使用至100次，按实施例的上样量、洗脱方式及收集方法， 层析收率为92. 1 %，层析液主峰HPLC面积归一法含量为98. 05%。对照例按实施例方法层析一次后的硅胶，从柱顶泵入3倍柱体积的丙酮进行正向洗柱至 柱底流出液无色，再从柱顶泵入3倍柱体积的石油醚平衡。平衡后的层析柱重新用来进行 辅酶QlO浸膏的层析，按同实施例的上样量、洗脱方式及收集方法，层析收率为93. 8%，层 析液主峰HPLC面积归一法含量为98. 10%。按此洗柱方法和层析方法用该硅胶层析柱连续 重复使用，第5次使用层析收率为83.2%，层析液主峰HPLC面积归一法含量为98. 02 %，重 复使用效果变差。
权利要求
一种辅酶Q10层析硅胶的在线再生方法，其特征是经分离提纯辅酶Q10后的硅胶层析柱，从柱底进乙酸乙酯、丙酮、丁酮、乙醇几种高极性溶剂中的一种进行反方向洗柱，除去强极性杂质，再从柱顶进石油醚、戊烷、正己烷、庚烷几种低极性溶剂中的一种进行正向平衡，洗柱及平衡温度为20～50℃，流速为1/2～2倍柱体积/小时，洗柱及平衡后的层析柱再用于分离提纯辅酶Q10，此方法可实现层析柱重复使用20次以上，每使用20次后，采用反方向双氧水洗和热水洗一次，再拆下硅胶于100℃～150℃下烘干活化至水分小于5％，重新装柱即可恢复至新硅胶98％以上的水平。
2.按照权利要求1所述的一种辅酶QlO层析硅胶的在线再生方法，所述洗柱是采用从 柱底进高极性溶剂反方向洗，平衡是从柱顶进低极性溶剂正向平衡。
3.按照权利要求1所述的一种辅酶QlO层析硅胶的在线再生方法，所述洗柱的高极性 溶剂用量为1 5倍柱体积，平衡的低极性溶剂用量为1 5倍柱体积。
4.按照权利要求1所述的一种辅酶QlO层析硅胶的在线再生方法，所述双氧水浓度为 3 20%，双氧水洗和热水洗的温度为50 100°C，用量为1 5倍柱体积。
全文摘要
本发明公开了一种辅酶Q10层析硅胶的在线再生方法，主要步骤是经柱层析分离提纯辅酶Q10后的硅胶柱，从柱底进高极性溶剂进行反方向洗柱，除去强极性杂质，再从柱顶进低极性溶剂进行正向平衡，平衡后的层析柱可再用于分离提纯辅酶Q10，此再生方法可实现层析柱重复使用20次以上。每使用20次后，采用反方向双氧水洗和热水洗一次，再拆下硅胶于100℃～150℃下烘干活化至水分小于5％，重新装柱即可恢复至新硅胶98％以上的水平。按此洗柱方法，硅胶使用次数可达100次以上，重复套用的层析效果良好，能达到安全环保的效果。
文档编号C07C46/10GK101985102SQ20101053164
公开日2011年3月16日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者付志杰, 刘华英, 吴轶, 张斌, 王炳荣, 詹光煌 申请人:内蒙古金达威药业有限公司;厦门金达威集团股份有限公司