专利名称：禽流感病毒H5N1亚型Re-5株阳性血清和阴性血清标准物质及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种禽流感病毒H5m亚型Re-5株的阳性血清和阴性血清标准物质及 制备方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
英国药典(BP)的化学对照物质是从1963年才开始提出，由于WHO在英国建立了 国际生物标准物质中心，所以英国一直沿用国际标准物质，而其本国标准物质建立较晚，至 1970年后，欧洲药典问世，英国除引用国际标准物质外，也用欧洲药典标准物质，少量使用 本国的标准物质。即使如此，BP1968年版及其增补本再加英国药典(1968年)收载的数量 已超过260个，1980年版已超过300个，BP1993版收载了 371个。美国药典委员会可提供 约1805多种药品标准物质；欧洲药典委员会有2098种，其中生物制品标准物质有319种。目前，我国已研制出国家一级标准物质1262种，二级标准物质1739种，涉及钢铁、 地质、石油、核材料、环境、食品以及临床检验等领域。兽用生物制品的标准物质研究较滞 后，目前只有192种，而兽用生物制品检验用标准物质几乎为零。兽用生物制品标准物质是控制和确定兽用生物制品产品质量、校准验证检验仪器 和方法是否准确的物质标准，是正确诊断传染病、准确监测免疫情况的物质基础。禽流感(Al)是我国重点防控的重大动物疫病，禽流感病毒(AIV)H5亚型属于高致 病性病毒，AIV H5N1亚型Re-5株是针对我国当前流行的高致病性禽流感病毒而研制的。用 该毒株研制的禽流感灭活疫苗是我国目前禽流感防制中应用最广泛的首选疫苗，这个疫苗 在实际应用中取得了十分显著的免疫效果，因此近年来我国的禽流感防制非常令人满意。 但是目前我国尚无禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验用标准物质及其相关研究的报道，国 外国际动物卫生组织(OIE)等参考实验室也没有，严重影响了前后不同时期检测数据的一 致性和不同实验室数据的可比性。近年各级实验室对禽流感标准物质的需求越来越多，特 别是H5亚型和H9亚型相关的诊断试剂标准物质，因此研制禽流感病毒H5W亚型血凝抑制 抗原标准物质尤为迫切，该标准物质是禽流感H5W亚型准确诊断、对AIV H5N1亚型Re_5 株免疫监测及对其疫苗免疫效果进行正确评价的根本保障，提高禽流感的防控水平。目前我国标准物质的研制主要参考和遵循1987年7月10日国家计量局发布实施 的《标准物质管理办法》以及一级标准物质技术规范(JJG 1006-94)，但是这个技术规范是 适用于化学成分、物理化学特性及工程技术特性一级标准物质的研制，对于生物制品标准 物质，特别是兽用生物制品标准物质研制目前尚无技术规范可循。因此兽用生物制品标准 物质研制是一项无基础的研究，填补了该项研究领域的空白。
发明内容
本方面涉及一种禽流感病毒H5m亚型Re-5株阳性血清和阴性血清标准物质， 阳性血清标准物质有强阳性血清标准物质和弱阳性血清标准物质，此两种阳性血清标准物质只与禽流感病毒H5W亚型Re-5株抗原呈阳性反应，强阳性血清标准物质的HI价为 彡81og2,弱阳性血清标准物质的HI价为< 81og2而彡41og2 ；此两种阳性血清与H7和H9 亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原均应为阴性反应；阴性血清标准物质在同一条 件下，分别与禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验，血清对禽 流感H5、H7、H9亚型、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原均为阴性反应。本发明的技术方案(1)禽流感病毒H5W亚型Re-5株阳性血清和阴性血清标准物质候选物1)按常规方法用禽流感病毒H5W亚型Re-5株病毒制备的油乳剂灭活疫苗。2)阳性血清标准物质候选物系用青年或成年SPF鸡，经肌肉注射禽流感病毒 H5N1亚型R5株油乳剂灭活疫苗，制备强阳性血清候选物，经2次免疫后，选取HI抗体效价 ^ 81og2的免疫鸡只，分别采集鸡血清并进行半成品检验后混合，加入适宜稳定剂后冻干； 制备弱阳性血清候选物仅1次免疫，选取HI抗体效价< 81og2而> 41og2的免疫鸡只，分 别采集鸡血清并进行半成品检验后混合，加入适宜稳定剂后冻干。3)阴性血清系采自SPF鸡血，分离血清并进行半成品检验，冻干。(2)以上制备的强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清标准物质候选物经检验、均一 性检验及稳定性检验及标准物质的标定、定值等一系列的工艺过程而成为强阳性血清、弱 阳性血清和阴性血清标准物质。本发明技术方案的详细阐述一、禽流感病毒H5W亚型Re-5株阳性血清、弱阳性血清和阴性血清标准物质的制 备1免疫用疫苗的制备(1)病毒液的制备及检验按照禽流感病毒H5W亚型Re-5株标准血凝抑制抗原 的制备方法繁殖病毒液，对病毒液进行检验1)无菌检验每瓶鸡胚液分别取样，按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员 会.中华人民共和国兽药典二〇〇五年版(三部).中国农业出版社，2006，本发明简称 《中国兽药典》)规定的方法进行检验，无细菌或霉菌或支原体生长也无外源病毒。2) HA价测定每瓶鸡胚液分别取样，样品对鸡红细胞凝集价不低于91og2。(2)病毒液的灭活及检验1)灭活将上述检验合格的胚液以灭菌多层纱布滤过，混合于一个大容器内，按 最终浓度为0. 03%的量加入β-丙内酯，充分混勻，置于4°C灭活24h后取出再置于37°C水 浴终止灭活lh。灭活后将胚液置于2 8°C条件下保存。2)灭活检验取10 11日龄SPF鸡胚5个，各尿囊腔内接种灭活胚液0. Iml, 37°C孵育72h，收获鸡胚液，测定血凝性(详见本说明书附录，下称《附录》)，为阴性，并盲传 1代，测定血凝性，无血凝现象，判为灭活完全。(3)佐剂的选择选用符合生物制品规定的进口佐剂，如德国产的Marcol52白 油、新加坡产的80和司盘80等为乳化佐剂。(4)保护剂的处理将司盘和白油按6 94的比例混合后加热至130°C30min，无 菌冷却后备用；吐温经高压灭菌后备用。(5)疫苗的制备先将灭菌后的吐温按8%的比例加入灭活检验合格的病毒液中，将其混勻；将冷却的白油佐剂定量加入组织捣碎机内，低速开启组织捣碎机，将混勻吐 温的病毒液按白油佐剂1/2的量缓慢加入组织捣碎机内，然后将组织捣碎机的转速提高至 8000r/min运转lOmin。将制备的油包水型疫苗分装于疫苗瓶内备用。2阳性血清制备(1)免疫选用3 4月龄SPF鸡饲养于负压隔离器内，用制备的禽流感灭活疫苗 以胸部肌肉注射方式2次接种疫苗，第一次接种剂量为1.0ml/只，间隔21日后进行第二次 接种，剂量为1. 5ml/只，且分点注射。(2)试血于第2次免疫接种后观日，用翅下静脉采血方式采集血清，采血同时对 鸡和血清对应编号，分别测定HI抗体效价(按《附录》进行)，挑选HI抗体效价> Qlog2的 SPF鸡备用。(3)血清的分离选HI抗体效价彡Qlog2的SPF鸡用20ml无菌注射器在负压隔 离器内进行心脏采血，血液采集完毕后先置于37°C 4h，然后再置于4°C冰箱内过夜，在无菌 室超净工作台内提取血清，若血清中混有红血球，应对其进行无菌离心后混合于同一灭菌 后的容器内。(4)血清半成品的检验1)无菌检验对混合后的血清取样，按《中国兽药典》规定方法进行检验，应无细 菌或霉菌生长。若有杂菌污染，应用0.22 μ的滤膜对其进行过滤除菌。2) HI抗体价的测定按《中国兽药典》红细胞凝集抑制法进行HI抗体价的测定，结 果应彡91〇由。3)特异性鉴定将待检血清在同一条件下分别与Η5、Η7和Η9亚型禽流感、鸡新城 疫、减蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验(按《附录》进行)，仅与禽流感病毒Η5 亚型抗原呈阳性反应(HI彡71og2)，与H7和H9亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗 原均应为阴性反应(HI ( 41og2)。4)血清的配制经检验合格的血清按总量的3%加入海藻糖(由北京拜尔迪生物 公司生产)和0. 5%的甘氨酸(由天津市科密欧化学试剂有限公司生产)作为冻干保护剂 并充分搅拌均勻，并按照《中国兽药典》无菌检验法进行检验，应无菌生长。5)分装与冻干将配好的抗原液用安瓿进行分装，每瓶1ml，分装后迅速放入冻 干机内进行冷冻真空干燥。冻干后扎铝盖、标号后放置-20°C保存。(5)成品检验1)物理性状呈微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁分离，加稀释液后迅速溶解，溶 解后的外观应与液体血清相同。2)无菌检验按《中国兽药典》无菌检验法进行，应无菌生长。3)效价测定按附录进行，HI抗体效价应彡81og2。4)特异性检验同半成品，应符合规定。
5) PH测定将血清按规格稀释后，用PH仪测定其pH值，应为7. 9 8. 26)剩余水分测定按《中国兽药典》剩余水分测定法进行，应低于3%。7)真空度测定按《中国兽药典》真空度测定法进行，符合规定。8)血清HI抗体效价的定值①定值方法红细胞凝集抑制试验96孔微量板法进行测定。
②定值单位由6 8家具有资质且事先经过比对确认其定值能力相同的试验 室，采用同一方法进行协作标定。③定值要求(a)应对每个被测标准样品分别做6 8次独立的测定，测定分两个单元，每个单 元做三次独立测定；两个单元之间相隔不少于3天。所获得的6个数据应按统计学方法检 验异常值，如发现有异常值，应予标明，并补做一次测定。然后报出全部结果。(b)所有用于定值测量的计量器具/测量仪器需经检定或校准合格，并在有效期 内。④数据处理(a)汇总全部原始数据，考察全部测量数据分布的正态性。(b)在数据服从正态分布或近似正态分布的情况下，将每个实验室的所测数据的 平均值视为单次测量值，构成一组新的测量数据。用统计学方法从统计上剔除可疑值。计 算出总平均值和标准偏差。(c)当全部数据服从正态分布或近似正态分布情况下，也可视其为一组新的测量 数据。用统计学方法从统计上剔除可疑值，再计算全部原始数据的总平均值和标准偏差。9)均一性检验①抽样数量冻干数量在500支以上时取样25支；冻干数量在500只以下时取样 15支。②测量分别称量每支内容物的净重量，用统计学方法分析其均一性。10)稳定性检验血清分别在-20°C、4°C、37°C条件下保存，并定期进行HA价测 定，每一时间均要进行数次重复测量，用统计学方法剔除可疑值，再计算每次的平均值，该 值与定值的偏差应不大于标准偏差。3.弱阳性血清制备(1)免疫选用3 4月龄SPF鸡饲养于负压隔离器内，用制备的禽流感灭活疫苗 以胸部肌肉注射方式接种疫苗，接种剂量为0. 5ml/只。(2)试血于免疫接种后14 21日，用翅下静脉采血方式采集血清，采血同时对 鸡和血清对应编号，分别测定HI抗体效价(按《附录》进行)，选取HI抗体效价< 81og2而 ^ 41og2的免疫鸡只备用。(3)血清的分离选选取HI抗体效价< 81og2而彡41og2的免疫鸡只用20ml无 菌注射器在负压隔离器内进行心脏采血，血液采集完毕后先置于37°C 4h，然后再置于4°C 冰箱内过夜，在无菌室超净工作台内提取血清，若血清中混有红血球，应对其进行无菌离心 后混合于同一灭菌后的容器内。(4)血清半成品的检验1)无菌检验对混合后的血清取样，按《中国兽药典》进行检验，应无细菌或霉菌 生长。若有杂菌污染，应用0.22 μ的滤膜对其进行过滤除菌。2)HI抗体价的测定按附录进行测定，结果应为大于41og2，小于81og2。3)特异性鉴定将待检血清在同一条件下分别与H5、H7和H9亚型禽流感、鸡新城 疫、减蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验(按《附录》进行)，仅与禽流感病毒H9 亚型抗原呈阳性反应(HI抗体效价< 81og2而> 41og2)，与H7和H5亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原均应为阴性反应。(5)血清的配制经检验合格的血清按总量的3%加入海藻糖(由北京拜尔迪生 物公司生产)和0. 5%的甘氨酸(由天津市科密欧化学试剂有限公司生产)作为冻干保护 剂并充分搅拌均勻，并按照《中国兽药典》无菌检验法进行检验，应无菌生长。(6)分装与冻干将配好的抗原液用安瓿进行分装，每瓶1ml，分装后迅速放入冻 干机内进行冷冻真空干燥。冻干后扎铝盖、标号后放置-20°C保存。(7)成品检验1)物理性状同阳性血清。2)无菌检验同阳性血清。3)效价测定按附录进行，HI抗体效价< 81og2而彡41og2。4)pH测定将血清按规格稀释后，用PH仪测定其pH值，应为7. 6 8. 2。5)特异性检验同阳性血清。6)剩余水分测定同阳性血清。7)真空度测定同阳性血清。8)血清HI抗体效价的定值同阳性血清。9)均一性检验同阳性血清。10)稳定性检验同阳性血清。4.阴性血清(1)血清分离青年SPF鸡饲养于生物安全动物实验室内的负压隔离器内，以无 菌注射器在生物安全动物实验室内的负压隔离器内进行心脏采血，血液采集完毕后先置于 370C 4h，然后再置于4°C冰箱内过夜，在无菌室超净工作台内提取血清，然后混合于同一灭 菌后的容器内。(2)血清半成品的检验1)无菌检验对混合后的血清取样，按《中国兽药典》进行检验，应无细菌或霉菌 生长。2)效价测定按附录进行，HI抗体效价应为阴性。3)特异性将血清在同一条件下(按《附录》进行)，分别与禽流感、鸡新城疫、减 蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验，血清对禽流感H5、H7、H9亚型、鸡新城疫、减 蛋综合征病毒抗原均为阴性反应。(3)血清的配制按总量的3%加入海藻糖(由北京拜尔迪生物公司生产)和 0. 5%的甘氨酸(由天津市科密欧化学试剂有限公司生产)作为冻干保护剂并充分搅拌均 勻，并按《中国兽药典》无菌检验法进行检验，应无菌生长。4)分装与冻干按anl/瓶进行定量分装，分装后迅速冷冻真空干燥冻干(按《中 华人民共和国兽用生物制品规程》(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制 品规程二〇〇〇年版.化学工业出版社，2001，本发明简称《规程》)进行。(5)成品检验1)物理性状呈微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁分离，加稀释液后迅速溶解，溶 解后的外观应与液体血清相同。2)无菌检验按《中国兽药典》无菌检验法进行，应无菌生长。
3)效价测定同阳性血清。4)特异性同阳性血清。5)剩余水分测定按《中国兽药典》剩余水分测定法进行，应低于3%。6)真空度测定按《中国兽药典》真空度测定法进行，符合规定。二、H9亚型阳性血清、弱阳性血清和阴性血清标准物质的使用阳性血清和弱阳性血清系用青年SPF鸡，经肌肉注射禽流感病毒H5W亚型(R5 株)油乳剂灭活疫苗后，采集SPF鸡血清并进行半成品检验，加入适宜稳定剂后冻干；阴性 血清系采自SPF鸡血，分离血清并进行半成品检验，冻干而成。主要用于禽流感病毒H5W亚型Re-5株HI试验对照。1.标准抗原的稀释取禽流感H5W亚型Re-5株抗原冻干安瓿1支，启封后加Iml 生理盐水恢复原量；先做10倍、20倍稀释。然后依次进行80、160、240、320、400、480、560倍稀释。2.红细胞凝集试验(1)取96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别取25 μ L加入到孔中，加入生理盐水 25 μ L，再加入1 %鸡红细胞悬液25 μ Lo(2)对照50 μ L生理盐水+25 μ L 1 %鸡红细胞悬液。(3)在微量振荡器振荡Imin ^iin。(4)室温(Μ )放置30min，判定结果。将血凝板倾斜70。且静置10秒左 右开始记录，凡反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面向下呈泪珠状流淌，呈现与红细胞对 照孔一样者为完全不凝集孔(_)；反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面缓慢向下呈泪珠状 流淌者为不完全凝集孔(+)；反应孔底部有红细胞沉积但不沿倾斜面流淌者为50%凝集 孔(++)；除底部有少许红细胞外，反应孔其他部位几乎为完全凝集孔者(+++)；反应孔底部 无红细胞，整个反应孔完全凝集者为完全凝集孔(#)。(5)结论完全凝集孔对应的最高稀释度应为300士60倍。3.微量血凝抑制试验(1)4ΗΑ·抗原的配制与验证1)抗原稀释方法将抗原先进行10倍稀释，再稀释为含4ΗΑ·血凝素。将配制的4ΗΑ·血凝素用生 理盐水进行1 2、1 3、1 4、1 5、1 6和1 7稀释。2)取96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别取25 μ L加入到孔中，加入生理盐水 25 μ L，再加入1 %鸡红细胞悬液25 μ Lo3)对照50 μ L生理盐水+25 μ L 1 %鸡红细胞悬液。4)以上试验做2个平行重复。5)在微量振荡器振荡Imin ^iiin。6)室温04 )放置30min，判定结果。7)判定标准如果配制的抗原液为4HA·，则1 4稀释度将给出100%凝集点，即 反应孔底部无红细胞，整个反应孔完全凝集；如果4HA·高于4个单位，可能1 5或1 6 为100%凝集点；如果较低，则可能1 2或1 3为100%凝集点。应根据测定结果适当 调整，其准确稀释倍数=使100%红细胞凝集终点的稀释倍数XM0/4，使抗原工作液确为碰100。( 血清的稀释1)标准阳性血清的的稀释血清恢复原量后，依次进行10倍、20倍稀释；然后 进行然后进行160、240、320、400、480、560倍稀释。将稀释好的阳性血清每一稀释倍数取 0. 025ml，分别加入到V型微量反应板对应孔中。2)阴性血清的稀释在V型微量反应板中，每孔加0. 025ml生理盐水；第1孔加 入恢复原量后的阴性血清0. 025ml,反复抽打3 5次混勻；从第1孔吸取0. 025ml血清 加入第2孔，混勻后吸取0. 025ml加入第3孔，如此进行对倍稀释至第6孔，从第6孔吸取 0. 025ml 弃去。3)被检血清的稀释血清恢复原量后，依次进行10倍、20倍稀释；然后进行160、 240、320、400、480、560倍…依次递增80倍稀释。将稀释好的阳性血清每一稀释倍数取 0. 025ml，分别加入到V型微量反应板对应孔中。(3) V型微量反应板上所有血清孔加入4HA·的抗原液25 μ L。最后1排设50 μ L 生理盐水和25 μ L生理盐水+25 μ L 4ΗΑ100抗原(各4个孔)做对照。(4)充分振荡后，室温( )下静置30min。每孔再加入鸡红细胞悬液 25 μ L，充分振荡。(5)室温(Μ )放置30min后判定结果。将血凝板倾斜70°且静置10秒 左右开始记录，凡反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面向下呈泪珠状流淌，呈现与红细胞 对照孔一样者为完全不凝集孔(_)；反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面缓慢向下呈泪珠 状流淌者为不完全凝集孔(+)；反应孔底部有红细胞沉积但不沿倾斜面流淌者为50%凝集 孔(++)；除底部有少许红细胞外，反应孔其他部位几乎为完全凝集孔者(+++)；反应孔底部 无红细胞，整个反应孔完全凝集者为完全凝集孔(#)。(6)结论阳性血清为200士40倍，阴性血清稀释孔为(+)、(++)、(+++)或(#) ；50 μ L生理盐 水对照孔为㈠，25 μ L生理盐水+25 μ L 4ΗΑ100抗原孔为(#)，此时试验方可判为成立。被 校定血清的完全不凝集孔对应的最高稀释度即为该血清的红细胞凝集抑制价。本发明的优点本发明涉及禽流感病毒H5W亚型Re-5株阳性血清和阴性血清标准物质及制备 方法。本标准物质阳性血清和弱阳性血清系用青年或成年SPF鸡，经肌肉注射禽流感病毒 H5m亚型(Re-5株)油乳剂灭活疫苗后，采集SPF鸡血清并进行半成品检验，加入适宜稳定 剂后冻干；阴性血清系采自SPF鸡血，分离血清并进行半成品检验，冻干；经成品检验、均一 性检验及稳定性检验及标准物质的标定、定值等一系列的工艺过程而制成。该标准物质是 禽流感H5亚型准确诊断、H5N1亚型(Re-5株)的免疫监测及对其疫苗免疫效果进行正确 评价的根本保障，提高禽流感的防控水平。对禽流感H5亚型进行诊断和相关产品检验工作 进行评价和质量控制的基本保障。实施例1阳性血清制造及半成品检验1.阳性血清制造(1)免疫选用3 4月龄SPF鸡饲养于负压隔离器内，用制备的禽流感灭活疫苗以胸部肌肉注射方式2次接种疫苗，第一次接种剂量为1.0ml/只，间隔21日后进行第二次 接种，剂量为1. 5ml/只，且分点注射。(2)试血于第2次免疫接种后观日，用翅下静脉采血方式采集血清，采血同时对 鸡和血清对应编号，分别测定HI抗体效价(按《附录》进行)，挑选HI抗体效价> 91og2 的SPF鸡备用。(3)血清的分离选HI抗体效价彡91og2的SPF鸡用20ml无菌注射器在负压隔 离器内进行心脏采血，血液采集完毕后先置于37°C 4h，然后再置于4°C冰箱内过夜，在无菌 室超净工作台内提取血清，若血清中混有红血球，应对其进行无菌离心后混合于同一灭菌 后的容器内。2.阳性血清半成品的检验(1)无菌检验对混合后的血清取样，按《中国兽药典》进行检验，应无细菌或霉菌 生长。(2)HI抗体价的测定按附录进行HI抗体价的测定，结果应> 91og2。(3)特异性鉴定将待检血清在同一条件下分别与H5、H7和H9亚型禽流感、鸡新 城疫、减蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验(按《附录》进行)，仅与禽流感病毒H9 亚型抗原呈阳性反应(HI ^ 71og2)，与H7和H9亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗 原均应为阴性反应(HI ( 41og2)。(4)血清的配制经检验合格的血清按总量的3%加入海藻糖(由北京拜尔迪生 物公司生产)和0. 5%的甘氨酸(由天津市科密欧化学试剂有限公司生产)作为冻干保护 剂并充分搅拌均勻，并按《中国兽药典》无菌检验法进行检验，应无菌生长。(5)分装与冻干将配好的抗原液用安瓿进行分装，每瓶lml，分装后迅速放入冻 干机内进行冷冻真空干燥。冻干后扎铝盖、标号后放置-20°C保存。实施例2弱阳性血清制造及半成品检验1.弱阳性血清制造(1)免疫选用3 4月龄SPF鸡饲养于负压隔离器内，用制备的禽流感灭活疫苗 以胸部肌肉注射方式接种疫苗，接种剂量为0. 5ml/只。(2)试血于免疫接种后14 21日，用翅下静脉采血方式采集血清，采血同时对 鸡和血清对应编号，分别测定HI抗体效价(按附录进行)，挑选HI抗体效价为51og2的SPF 鸡备用。(3)血清的分离选HI抗体效价51og2的SPF鸡用20ml无菌注射器在负压隔离 器内进行心脏采血，血液采集完毕后先置于37°C 4h，然后再置于4°C冰箱内过夜，在无菌室 超净工作台内提取血清，若血清中混有红血球，应对其进行无菌离心后混合于同一灭菌后 的容器内。2.弱阳性血清半成品的检验(1)无菌检验对混合后的血清取样，按《中国兽药典》进行检验，应无细菌或霉菌 生长。若有杂菌污染，应用0.22 μ的滤膜对其进行过滤除菌。(2) HI抗体价的测定按附录进行HI抗体价的测定，结果应为HI价< 81og2，而 > 41og2。
(3)特异性鉴定将待检血清在同一条件下分别与H5、H7和H9亚型禽流感、鸡新 城疫、减蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验(按《附录》进行)，仅与禽流感病毒H9 亚型抗原呈阳性反应(HI价< 81og2，而> 41og2)，与H7和H9亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋 综合征病毒抗原均应为阴性反应。(4)血清的配制经检验合格的血清按总量的3%加入海藻糖(由北京拜尔迪生 物公司生产)和0. 5%的甘氨酸(由天津市科密欧化学试剂有限公司生产)作为冻干保护 剂并充分搅拌均勻，并按《中国兽药典》无菌检验法进行检验，应无菌生长。(5)分装与冻干将配好的抗原液用安瓿进行分装，每瓶1ml，分装后迅速放入冻 干机内进行冷冻真空干燥。冻干后扎铝盖、标号后放置-20°C保存。实施例3阴性血清制造及半成品检验1.阴性血清制造青年SPF鸡饲养于生物安全动物实验室内的负压隔离器内，以无菌注射器在生物 安全动物实验室内的负压隔离器内进行心脏采血，血液采集完毕后先置于37°C 4h，然后再 置于4°C冰箱内过夜，在无菌室超净工作台内提取血清，然后混合于同一灭菌后的容器内。2.阴性血清半成品的检验(1)菌检验对混合后的血清取样，按《中国兽药典》进行检验，应无细菌或霉菌生长。(2)效价测定按附录测定HI抗体效价，应为阴性。(3)特异性将血清在同一条件下(按《附录》进行)，分别与禽流感、鸡新城疫、 减蛋综合征病毒抗原进行红细胞凝集抑制试验，血清对禽流感H5、H7、H9亚型、鸡新城疫、 减蛋综合征病毒抗原均为阴性反应。(4)血清的配制按总量的3%加入海藻糖(由北京拜尔迪生物公司生产)和 0.5%的甘氨酸(由天津市科密欧化学试剂有限公司生产)作为冻干保护剂并充分搅拌均 勻，并按《中国兽药典》无菌检验法进行检验，应无菌生长。(5)分装与冻干按aiil/瓶进行定量分装，分装后迅速冷冻真空干燥冻干(按照 《规程》方法进行)。实施例4血清成品检验1.物理性状检验结果均为微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。2.无菌检验结果检验结果见表1，所有冻干制品全部呈阴性。表1无菌检验统计表
权利要求
1.一种禽流感病毒H5m亚型Re-5株阳性血清和阴性血清标准物质，其特征在于(1)阳性血清标准物质有强阳性血清和弱阳性血清标准物质，此两种阳性血清标准物 质只与禽流感病毒H5m亚型Re-5株抗原呈阳性反应，强阳性血清的HI价> 81og2,弱阳性 血清的HI价< 81og2而> 41og2 ；此两种阳性血清与H7和H9亚型禽流感、鸡新城疫、减蛋 综合征病毒抗原均应为阴性反应；(2)阴性血清标准物质在同一条件下，分别与禽流感、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原 进行红细胞凝集抑制试验，血清对禽流感H5、H7和H9亚型、鸡新城疫、减蛋综合征病毒抗原 均为阴性反应。
2.一种禽流感病毒H5W亚型Re-5株阳性血清和阴性血清标准物质的制备方法，其特 征在于(1)按常规方法用禽流感病毒H5W亚型Re-5株病毒制备的油乳剂灭活疫苗；(2)阳性血清标准物质候选物系用青年或成年SPF鸡，经肌肉注射禽流感病毒H5W亚 型Re-5株油乳剂灭活疫苗1)制备强阳性血清候选物，经2次免疫后，选取HI抗体效价>81og2的免疫鸡只，分别 采集鸡血清并进行半成品检验后混合，加入适宜稳定剂后冻干；2)制备弱阳性血清候选物仅1次免疫，选取HI抗体效价<81og2而> 41og2的免疫鸡 只，分别采集鸡血清并进行半成品检验后混合，加入适宜稳定剂后冻干；(3)阴性血清系采自SPF鸡血，分离血清并进行半成品检验，冻干；(4)以上制备的强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清标准物质候选物经检验、均一性检 验及稳定性检验及标准物质的标定、定值等一系列的工艺过程而成为强阳性血清、弱阳性 血清和阴性血清标准物质。
3.如权利要求1-2所述的一种禽流感病毒H5W亚型Re-5株阳性血清和阴性血清标准 物质及制备方法，其特征在于使用的冻干保护剂为按血清总量的3%加入海藻糖和0. 5% 的甘氨酸作为冻干保护剂。
全文摘要
本发明涉及禽流感病毒H5N1亚型Re-5株阳性血清和阴性血清标准物质及制备方法。本标准物质阳性血清(强阳性血清和弱阳性血清)系用青年或成年SPF鸡，经肌肉注射禽流感病毒H5N1亚型Re-5株油乳剂灭活疫苗后，采集SPF鸡血清并进行半成品检验，加入适宜稳定剂后冻干；阴性血清系采自SPF鸡血，分离血清并进行半成品检验，冻干；经成品检验、均一性检验及稳定性检验及标准物质的标定、定值等一系列的工艺过程而制成。该标准物质是禽流感H5N1亚型准确诊断和H5N1亚型Re-5株的免疫监测及对其疫苗免疫效果进行正确评价的根本保障，提高禽流感的防控水平。对禽流感H5N1亚型进行诊断和相关产品检验工作进行评价和质量控制的基本保障。
文档编号C07K16/18GK102050876SQ201010532298
公开日2011年5月11日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者刘景利, 孙建宏, 张从禄, 徐姗姗, 杨帆, 田国彬, 胡井雷, 韩正博 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所