专利名称：新型完整蛋白质微捕集器的制备方法和应用的制作方法
新型完整蛋白质微捕集器的制备方法和应用技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种新型完整蛋白质微捕集器的制备及 其应用。
本发明制备的完整蛋白质微捕集器，可作为两维在线液相色谱中完整蛋白质在两 维之间的切换，对一维色谱洗脱下来的蛋白质进行成功地捕集，浓缩及除盐。该微捕集器在 蛋白质组学等领域有良好的实用价值和应用前景。
背景技术：
蛋白质组学研究中通常有两种主要的研究方法来分析复杂的蛋白质，分别是 “bottom-up”和“top-down”。“Bottom-up”指的是“鸟枪法”蛋白质组学研究方法，该方法 在大规模鉴定未知蛋白质方面起着重要的作用。然而，“bottom-up”研究方法提供了完整 蛋白质非常有限的分子信息。
与bottom-up相比，top-down的技术方法能够提供完整蛋白质分子水平上的信 息，使得我们对完整蛋白质的定量研究及后转移修饰研究成为可能。采用top-down的技术 路线来研究完整蛋白质，在质谱鉴定前有效分离捕集全蛋白至关重要。
相对于两维凝胶电泳技术，由于多维色谱具有自动化、多样性、高通量及高灵敏度 的优点，采用多维色谱结合串级质谱来分析复杂的蛋白质混合物具有很强的优势。然而，由 于缺乏在线捕集完整蛋白质的技术，多维液相色谱分离的样品大多采用离线浓缩的方式， 系统难以实现自动化。
目前商品化的捕集柱主要用于对肽段或其它小分子如痕量环境污染物，药物或生 物体液中代谢物等的富集。富集完整蛋白质的捕集柱很少见报道。用捕集肽段的颗粒固定 化整体柱进行蛋白质捕集实验发现部分蛋白质回收率很低，在20%以下。低的回收率是由 于这种捕集柱中颗粒表面涂覆有厚厚的溶胶凝胶涂层造成的。与肽段等小分子相比，捕集 全蛋白存在着许多困难蛋白质比肽段复杂得多，蛋白质带有不同的电荷，存在着各种二级 三级结构折叠，还包括多种后修饰。肽段与小分子相似，它们扩散进出固定相表面的孔隙比 较容易。而这种带有厚厚溶胶凝胶涂层的捕集柱中，固定相表面包覆着多层溶胶凝胶，蛋白 质分子很难自由地扩散进出固定相表面的孔隙中，与固定相进行交换平衡。因此发展一种 简单便捷而又有效的捕集蛋白质的方法成为蛋白质组学研究的一个重要方面。
为了对完整蛋白质进行有效地捕集并获得高的回收率，微型全蛋白捕集器在结 构上应具有以下两个特点首先，捕集器内部固定相颗粒表面的溶胶凝胶涂层一定要薄。包 覆在颗粒表面的膜越薄，蛋白质越容易扩散进出颗粒表面的孔中，传质效率越高。同时，微 捕集器的机械强度不能下降。其次，溶胶凝胶网络骨架上的通孔要足够大以保证蛋白质自 由地通过溶胶凝胶形成的网络。因此，制备一种溶胶凝胶涂层薄，同时机械强度高的全蛋白 微捕集器成为成功捕集蛋白质的关键。
目前，商品化的色谱填料都经过了封端处理，以消除硅羟基的存在，以免造成分 离时碱性化合物的色谱峰拖尾。由于硅羟基大量被封闭掉，在进行溶胶凝胶反应时，填料很难与水解后的前驱体反应形成三维的网状结构，得到的微捕集器机械强度很差，填料非常 容易被冲散。因此在制备前，要对商品化的色谱填料进行活化处理。
本发明制备了新型薄层溶胶凝胶涂覆的整体型C4，C8和C18微捕集器。利用该微 捕集器用于在线多维色谱之间的样品切换，对标准蛋白质及实际蛋白质进行了捕集，浓缩， 除盐，从而避免了在后续质谱鉴定中高盐存在对质谱信号的干扰。该全蛋白微捕集器在蛋 白质组学等领域有良好的实用价值和应用前景
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备简单、溶胶凝胶涂层薄、机械强度高、寿命长、捕集量 高的完整蛋白质微捕集器的制备方法和应用。
本发明提出的完整蛋白质微捕集器的制备方法，首先对商品化的色谱填料进行活 化处理。目前商品化的色谱填料都经过了封端处理，以消除硅羟基的存在，以免造成分离时 碱性化合物的色谱峰拖尾。由于硅羟基大量被封闭掉，在进行溶胶凝胶反应时，填料很难与 水解后的前驱体反应形成三维的网状结构，得到的微捕集器机械强度很差，填料非常容易 被冲散。因此在制备微捕集器前，要对商品化的色谱填料进行活化处理。首先采用氢氧化 钠溶液分别浸泡处理C4，C8和C18反相色谱填料，以活化表面封端的填料，增加固定相表面 裸露的硅羟基数目。将处理后的填料悬浮于以甲基三乙氧基硅烷为前驱体的溶胶溶液中， 由加压装置将悬浮液引入到毛细管中适当长度，经前躯体的水解和缩聚制得具有三维网状 空间结构的完整蛋白质微捕集器。处理后的C4，C8和C18填料都被成功制得了适用于对 完整蛋白质捕集的微捕集器。
本发明提出的完整蛋白质微捕集器的制备方法，具体步骤如下(1)采用氢氧化钠溶液分别浸泡C4，C8和C18反相色谱填料，超声处理，以活化表面 封端的填料，增加固定相表面裸露的硅羟基数目；超声结束后，离心弃去上清液，加入去离 子水洗涤填料，以除去表面的氢氧化钠溶液，离心弃去上清液，重复两次；将处理后的C4， C8和C18反相色谱填料烘干备用；(2)采用溶胶凝胶法制备高通透性，高机械强度的毛细管柱上塞子；(3)采用溶胶凝胶法制备完整蛋白质微捕集器将步骤(1)所得处理后的C4，C8或C18反相色谱填料悬浮于以甲基三乙氧基硅烷为 前驱体的溶胶溶液中，得到悬浮液；所述前驱体溶胶配方如下30 μ 甲基三乙氧基硅烷， 100 μ 二氯甲烷(CH2Cl2), 50 μ 三氟乙酸(TFA)，5 μ H2O ；采用加压装置将所得悬浮液 引入步骤(2)所得带有塞子的毛细管中适当长度后，用硅橡胶垫将毛细管塞子端堵住；悬 浮液在毛细管柱内凝胶化1. 8-2. 2小时后，将凝胶化后的毛细管柱放入烘箱中，95-105°C 老化20-2 ；老化过程中，采用小气流的氮气始终保持通气状态，以吹出多余凝胶，该操作 有利于在填料表面形成较薄的溶胶凝胶涂层；老化后，除去毛细管柱上塞子，所得即为微捕 集器。
利用本发明方法所得完整蛋白质微捕集器在完整蛋白质捕集除盐中的应用。
本发明提出的完整蛋白质微捕集器制备方法简单、颗粒表面的膜薄、机械强度高、 寿命长、捕集量高，且无需柱塞，对标准蛋白质进行捕集除盐后，并成功地应用于实际鼠肝 蛋白质的捕集，蛋白质回收率高。为蛋白质的捕集，浓缩，除盐提供了新的手段，该微捕集器 在生物分析研究等领域有良好的实用价值和应用前景。
图1为溶胶凝胶法制备的C4，C8和C18全蛋白微捕集器横截面的扫描电镜图(a) C4微捕集器；(b) C8微捕集器；(c) C18微捕集器。
图2是完整蛋白质微捕集器的固定装置图。
图3是在线捕集-毛细管反相液相色谱系统的装置图。
图4是完整蛋白质微捕集器用于捕集0. 5 μg四种蛋白质混合物后的毛细管色谱 图。蛋白质(1)核糖核酸酶B; (2)细胞色素c; (3)马肌红蛋白；(4)鸡卵白蛋白； (a)蛋白质直接进样到毛细管分析柱分离；(b)蛋白质经C18微捕集器捕集后反冲到毛 细管分析柱分离；(c)蛋白质经C4微捕集器捕集后反冲到毛细管分析柱分离；(d)蛋白 质经C8微捕集器捕集后反冲到毛细管分析柱分离。
图5是完整蛋白质微捕集器的最大捕集容量图。(a) C18微捕集器；(b) C4微 捕集器；(c) C8微捕集器。
图6是完整蛋白质微捕集器用于捕集15 μg鼠肝全蛋白质后的色谱图。(a)直 接进样到分析柱；(b)经C4微捕集器捕集后反冲到毛细管分析柱分离；(c)经C8微捕 集器捕集后反冲到毛细管分析柱分离；(d)经C18微捕集器捕集后反冲到毛细管分析柱 分离。
图中标号1为完整蛋白质微捕集器，2为不锈钢刃环，3为螺母，4为1/16英寸 外径500微米内径聚醚醚酮(PEEK)管，5为360微米外径75微米内径毛细管，6为环氧树 脂胶，7为进样阀，8为切换阀，9为上样泵，10为分析柱，11为紫外检测器，12为梯度泵。
具体实施方式
实施例是对本发明所提供的完整蛋白质微捕集器的制备及对蛋白质捕集除盐过 程的进一步说明。
实施例1 完整蛋白质微捕集器的制备 完整蛋白质微捕集器的制备共分为三步。
(1)商品化的色谱填料都经过了封端处理，以消除硅羟基的存在以免造成分离时 碱性化合物的色谱峰拖尾。由于硅羟基大量被封闭掉，在进行溶胶凝胶反应时，很难与水解 后的前驱体反应形成三维的网状结构，得到的微捕集器机械强度很差，填料非常容易被冲 散。因此在制备前，要对商品化的色谱填料进行活化处理。采用0.001摩尔每升的氢氧化 钠溶液分别浸泡C4，C8和C18反相色谱填料，超声处理5分钟，以活化表面封端的填料，增 加固定相表面裸露的硅羟基数目。超声结束后，离心弃去上清液，加入去离子水洗涤填料， 以除去表面的氢氧化钠溶液，离心弃去上清液，重复两次。将处理后的填料烘干备用；(2)采用溶胶凝胶法制备毛细管柱上塞子；(3)采用溶胶凝胶法制得完整蛋白质微捕集器。分别将处理后的C4，C8和C18填料 悬浮于以甲基三乙氧基硅烷为前驱体的溶胶溶液中，溶胶配方如下30 μ 甲基三乙氧基 硅烷(MTES)，100 μ 二氯甲烷(CH2Cl2), 50 μ 三氟乙酸(TFA)，5 μ H2O0由加压装置将 悬浮液引入到320 Mffl内径制得塞子后的毛细管中适当长度后，用硅橡胶垫将塞子端柱头堵 住。悬浮液在柱内凝胶化2小时后，将柱子放入烘箱中，100°C老化M h。在老化的过程中，采用小气流的氮气始终保持通气状态，以便吹出多余凝胶，该操作有利于在填料表面形 成较薄的溶胶凝胶涂层。老化后，除去暂时性的塞子，切下5 mm作为微捕集器使用。
由于连接的空间限制，微捕集器在实验上很难和标准的接头连接。将上述所得的 微捕集器进行固定，如图2所示，采用一个特殊的固定装置以确保无漏连接。为了减小微捕 集器和分析柱之间的死体积，微捕集器1和一根75 μ 内径，20 cm长的熔融石英毛细管5 分别从两头插入一根3 cm X 500 Mm内径的PEEK管4。PEEK管4内毛细管5和微捕集 器1头对头。PEEK管4的出口端，使用不锈钢刃环2紧密地将微捕集器1固定在PEEK管4 内。使用一个标准的螺母3以便将微捕集器1固定到切换阀8上。最后，将环氧树脂胶7 涂在PEEK管4的出口和毛细管5的接缝处防止泄露。胶干后，将微捕集器1和分析柱10 连在切换阀8上，使得捕集的分析物能够从微捕集器1上反冲到分析柱10上进行分离。
实施例2 将实施例1所得微捕集器用于在线捕集-毛细管反相液相色谱系统的 装置整个体系包括一个上样泵9，一个梯度泵12，一个80纳升流通池的多波长紫外检测 器11，一个带有2 PL或20 μ 样品环的进样阀7 (六通手动进样阀)，一个切换阀8 (六通 切换阀)，一个完整蛋白微捕集器1，一根毛细管反相色谱分析柱10(ZortaX，SB-C18, 5 Mm, 150X0. 3 mm, Agilent)。
微捕集器1和固定它的PEEK管5直接连接在切换阀8上的第6个位置。进样阀7 和切换阀8之间由一根15 cm X 65 Mm i. d. PEEK管连接。分析柱10连在切换阀8上 的第5个位置，分析柱10出口端与紫外检测器11相连。
使用shimadzu上样泵9以10 μ /πι η的流速输送上样液(纯水)。通过进样阀 7，手动进样，将样品上样到微捕集器1上。上样液冲洗微捕集器1五分钟后，切换切换阀 8，使微捕集器1和毛细管反相分析柱10在线连接，捕集到微捕集器1上的蛋白被洗脱下 来，反冲到分析柱10上色谱分离。
毛细管反相液相色谱分离实验由Agilent 1100 series泵系统完成。使用二元流 动相A (5% ACN/0. 05% TFA)和B (90% ACN/0. 05% TFA)进行梯度洗脱。标准蛋白混合液 的洗脱梯度为10分钟线性上升到25% B, 20分钟内从25%线性上升到45% B, 5分钟内 从45%线性上升到95% B，保持5分钟后回到0% B。健康鼠肝蛋白的洗脱梯度为45分钟 线性上升到80% B, 10分钟内从80%线性上升到95% B,保持10分钟后回到0% B。流速为 4 μ /πι η. Agilent 1200 series多波长紫外检测，检测波长215 nm。色谱数据的采集和 处理由Agilent色谱工作站完成。
实施例3 将实施例1所得完整蛋白质微捕集器用于标准蛋白的捕集 (1)蛋白质溶液制备分别将核糖核酸酶B，细胞色素c，马肌红蛋白和鸡卵白蛋白溶于纯水，制得10 μδ/ μ 的储备液。
(2)标准蛋白质的捕集通过进样0.5 Pg四种标准蛋白的混合物(1核糖核酸酶B，2细胞色素c，3马肌红蛋 白和4鸡卵白蛋白)到完整蛋白微捕集器上来研究该捕集器对完整蛋白质的捕集。经捕集 器捕集后，蛋白质反冲到毛细管反相分析柱上进行洗脱分离，使用多波长紫外检测器检测， 测定波长215 nm。四种蛋白质的回收率都在90%以上。
实施例4 完整蛋白质微捕集器的捕集容量就在线捕集系统来说，捕集器的最大捕集容量是其一个重要的性能参数。最大捕集容 量决定了我们在上样时的上限，以防止样品穿透。分别进样一系列逐渐增加浓度的标准蛋 白混合液(核糖核酸酶B，细胞色素C，马肌红蛋白和鸡卵白蛋白)到5mm长，320 Mm内 径的微捕集器上，来考察其捕集容量。当进样量小于30 Pg时，峰面积总额与进样量线性 关系良好。然而，但进样量从37. 5 μg增加到75 Pg时，峰面积不再增加，趋于稳定。三 种不同填料制备的微捕集器捕集量相当，对于四种标准蛋白混合物的最大捕集量为30 μg!,
实施例5:完整蛋白质微捕集器用于鼠肝实际蛋白捕集健康鼠肝组织被切成小块，用冰生理盐水(0.9% NaCl)清洗三次以除去体液及血液中 一些可能的污染物。接着称重，0.4 g的肝组织中加入10 mL提取液，包括ImM苯甲 磺酰氟，0.2 mM钒酸钠，1 mM氟化钠，和蛋白酶抑制剂。然后对组织样品冰浴勻浆。 勻浆液冰浴混旋30分钟，在4° C条件下16000 g离心15分钟。取上清即为提取蛋白。 Bradford法测定蛋白浓度为4 mg/mL。
应用在线捕集-毛细管反相液相色谱系统对健康鼠肝组织蛋白进行捕集并除盐。 15 μg鼠肝蛋白进样到在线捕集-毛细管反相液相色谱系统，与直接进样到分析柱相比，小 部分亲水性的蛋白略有损失，大部分蛋白质都得到了有效的捕集，回收率高。实验证明了将 自制微捕集器与毛细管反相液相色谱柱相连，对完整蛋白质进行捕集除盐的可行性。
权利要求
1.一种完整蛋白质微捕集器的制备方法，其特征在于具体步骤如下(1)采用氢氧化钠溶液分别浸泡C4，C8和C18反相色谱填料，超声处理，以活化表面 封端的填料，增加固定相表面裸露的硅羟基数目；超声结束后，离心弃去上清液，加入去离 子水洗涤填料，以除去表面的氢氧化钠溶液，离心弃去上清液，重复两次；将处理后的C4， C8和C18反相色谱填料烘干备用；(2)采用溶胶凝胶法制备高通透性，高机械强度的毛细管柱上塞子；(3)采用溶胶凝胶法制备完整蛋白质微捕集器将步骤(1)所得处理后的C4，C8或C18反相色谱填料悬浮于以甲基三乙氧基硅烷为 前驱体的溶胶溶液中，得到悬浮液；所述前驱体溶胶配方如下30 μ 甲基三乙氧基硅烷， 100 μ 二氯甲烷，50 μ 三氟乙酸，5 μ 水；采用加压装置将所得悬浮液引入步骤(2)所 得带有塞子的毛细管中适当长度后，用硅橡胶垫将毛细管塞子端堵住；悬浮液在毛细管柱 内凝胶化1. 8-2. 2小时后，将凝胶化后的毛细管柱放入烘箱中，95-105° C老化20-2 ；老 化过程中，采用小气流的氮气始终保持通气状态，以吹出多余凝胶，老化后，除去毛细管柱 上塞子，所得即为微捕集器。
2.一种如权利要求1所述方法所得完整蛋白质微捕集器在完整蛋白质捕集除盐中的 应用。
全文摘要
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种新型完整蛋白质微捕集器的制备方法和应用。本发明先采用氢氧化钠溶液处理商品化的反相色谱填料，将处理后的填料悬浮于以甲基三乙氧基硅烷为前驱体的溶胶溶液中，由加压装置将悬浮液引入到毛细管中适当长度，经前躯体的水解和缩聚制得具有三维网状空间结构的完整蛋白质微捕集器。将该微捕集器用于液相色谱中完整蛋白质样品的捕集，浓缩，除盐，蛋白质回收率高，捕集器捕集容量大，且无需柱塞，制备方法简单有效。该微捕集器在蛋白质组学等领域有良好的实用价值和应用前景。
文档编号C07K1/16GK102030816SQ201010535540
公开日2011年4月27日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者关霞, 张祥民 申请人:复旦大学