专利名称：组织因子途径抑制物及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor, TFPI)及其制备和应用。
背景技术：
组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor, TFPI)是一种天然抗 凝蛋白，能够抑制组织因子(tissue factor, TF)介导的凝血激活。TFPI的作用机制在于 它能与)(a因子形成一个稳定的复合物TFPI-Xa，从而使失活。TFPI-Xa还能够抑制TF 与VIIa因子的复合物，从而阻碍)(a的产生。TFPI包括两种类型，即TFPI-I和TFPI-2，二 者均有抑制凝血作用。研究表明，人类TFPI-I参与天然免疫以及炎症反应过程，TFPI-2则 具有丝氨酸蛋白酶抑制因子活性并且在肿瘤细胞生长和转移过程中起重要作用。最近动物 模型研究发现，纯化的重组人类TFPI-I能够缓解人工感染引起的败血症症状，但其具体机 制尚不清楚。
发明内容
本发明目的在于提供组织因子途径抑制物TFPI及其制备和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种组织因子途径抑制物组织因子途径抑制物TFPI-I如序列表SEQID No. 1中 氨基酸序列所示；组织因子途径抑制物TFPI-2如序列表SEQ IDNo. 2中氨基酸序列所示。组织因子途径抑制物的构建方法1)质粒 pE15TFPIl 的构建以美国红鱼cDNA为模板，用引物TPlFl和TPlRl进行PCR扩增，扩增产物纯化后 与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为 质粒 pBSTPl ；将上述质粒pBSTPl和质粒pET259分别用限制性内切酶EcoRV和SwaI酶切后回 收0. 78kb和5. 4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转 化子提取质粒，即为PE15TFPI1 ；2)质粒 PE15TFPI2 的构建以美国红鱼cDNA为模板，用引物TP2F1和TP2R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后 与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为 质粒 pBSTP2 ；将上述质粒pBSTP2和质粒pET259分别用限制性内切酶EcoRV和SwaI酶切后回 收0. 6kb和5. 4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转 化子提取质粒，即为质粒PE15TFPI2 ；3)组织因子途径抑制物TFPI-I和TFPI-2的制备将上述步骤1)和2~)的质粒pE15TFPIl和pE15TFPI2分别转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选转化子即为 BL21/pE15TFPIl 和 BL21/pE15TFPI2。将 BL21/pE15TFPIl 和BL21/pE15TFPI分别于含有卡那霉素的LB培养基中于37 °C培养0D600为0. 6，并加 入终浓度为ImM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷，再以37°C继续培养4_5小时，而后用 nickel-nitrilotriaceticacid亲和层析柱纯化重组蛋白，即分别为序列表SEQ ID No. 1中 氨基酸序列所示的组织因子途径抑制物TFPI-1，序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列所示的 组织因子途径抑制物TFPI-2。所述步骤1)中弓I 物TPlFl和TPlRl分另Ij % TPlFl 5，-GATATCAGAAGAGACAGACAAGCA-3’ 和 TP1R15，-GATATCGATGGAGCGATGAAGAAT-3，。所述步骤2)中引物 TP2F1 和 TP2R1 分别为 TP2F15，-GATATCTTGTCACCTAAAGGCGTG T-3，和 TP2R1 5， -GATATCAGCCTGCAAGAAAGTGATG-3，。组织因子途径抑制物的应用所述序列表SEQ ID No. 1中氨基酸序列组织因子途 径抑制物TFPI-I和序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列组织因子途径抑制物TFPI-2可作为 鱼类细菌的杀菌剂。本发明具有如下优点1.稳定表达。本发明的细菌表达系统可以稳定高效地表达TFPI。2.高效抑菌作用。本发明的TFPI可以有效裂解多种致病菌，从而抑制细菌感染。
图1为本发明实施例纯化得到的TFPI-I电泳图谱，(其中纯化得到的TFPI-I为 泳道2，泳道1为分子量marker。)。图2.本发明实施例纯化得到的TFPI-I电泳图谱，(其中纯化得到的TFPI-2为泳 道2,泳道1为分子量marker。)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技 (北京)有限公司”的相应试剂盒。2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。实施例1组织因子途径抑制物TFPI-I如序列表SEQ ID No. 1中氨基酸序列所示；组织因子 途径抑制物TFPI-2如序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列所示。序列表SEQ ID No. 1 为:MAPVKWWILCAVLLCCVPRFGSCRRDRQADGPLPELFIFNELCALKDEPGPCKAIKDRFFFNVDTGHCE LFEYGGCGGNA
NNFETLEDCEETCVVSDNKNPCHLAEAPGPCRGLVTRYFFDSGSQQCKHFYYGGCFGNANNFKSMAECQ AKCQNPENPTKAPEVHTQPAGKSNVVQPTILTGEMTVSEPQVQTNETHKNPKVLRPTELCFDPVDRGTCQGSEKRFAYNP ITKRCHAFSYSGCGGNRNNFAYRKDCMIKCRRRKVHGPMIRIRKKNLDNILHRSI(a)序列特征 长度284 类型氨基酸序列 链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(C)假设否(d)反义否(e)最初来源美国红鱼结构特征该蛋白的最明显结构特征是含有3个Kimitz结构，分别由氨基酸 41-94，100-153，以及 207-260 构成。序列表SEQ ID No. 2 为:MEFCTLTLVALFSTFYNVLALSPKGVCLLQVDEGPCRGEIERYYYNTITQKCEIFYYGGCQGNANNFKS YQECQKTCFRIPKIPQICRFPKEEGPCRALLHRYFF匪TTMQCESFSYGGCQGNMNRFQDLTSCMEYCSPRKTVPVLCLD PLDKGRCSASIPRYYYNTATKMCEEFIYSGCGGSSNNFVSRQSCMDVCVKGGKKYKRQGKGHRMRRYRNNHITFLQA(a)序列特征 长度2 类型氨基酸序列 链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)假设否(d)反义否(e)最初来源美国红鱼结构特征该蛋白的最明显结构特征是含有3个Kimitz结构，分别由氨基酸 25-78,85-138,以及 145-198 构成。实施例2组织因子途径抑制物TFPI-I和TFPI-2的制备方法1)质粒 pE15TFPIl 的构建以美国红鱼cDNA为模板，用引物TPlFl和TPlRl进行PCR扩增。PCR条件为94°C 60s 预变性模板 DNA，然后 94°C 40s, 52°C 60s, 72°C 60s，5 个循环后改为 94°C 40s, 58°C 60s, 72°C 608，25个循环后再在721延伸反应7-101^11。PCR产物纯化后与载体pBS_T (购于“天根生化科技(北京)有限公司”)于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌后 在含100ug/ml安卡青霉素、40ug/ml Xgal、异丙基-β _D_硫代半乳糖苷Q^g/ml)的LB 培养基上培养18- 小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBSTPl。将上述质粒pBSTPl和质粒pET259 (质粒pET259的构建过程参见Zheng， W. J. , Hu, Y. H. , Sun, L. ,2010. Cloning and analysis of a ferritinsubunit from turbot (Scophthalmus maximus). Fish. Shellfish. Immunol. 28 (5-6), 829 836.)分另ll用限 制性内切酶EcoRV和SwaI酶切后回收0. 78kb和5. 4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶 连接，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18- 小时，筛 选转化子提取质粒，即为PE15TFPI1。所述引物TPlFl 和 TPlRl 分别为TP1F1 为 5，-GATATCAGAAGAGACAGACAAGCA-3，， TPlRl 为 5’ -GATATCGATGGAGCGATGAAGAAT-3，。2)质粒 pE15TFPI2 的构建以美国红鱼cDNA为模板，用引物TP2F1和TP2R1进行PCR扩增。PCR条件与步骤 1)相同。PCR产物纯化后与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌后 在含100ug/ml的安卡青霉素、40ug/ml的Xgal、2^g/ml的异丙基- β _D_硫代半乳糖苷) 的LB培养基上培养18- 小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBSTP2。将上述质粒pBSTP2和质粒pET259 (质粒pET259的构建过程参见Zheng， W. J. , Hu, Y. H. , Sun, L. ,2010. Cloning and analysis of a ferritinsubunit from turbot (Scophthalmus maximus). Fish. Shellfish. Immunol. 28 (5-6), 829 836.)分另ll用限 制性内切酶EcoRV和SwaI酶切后回收0. 6kb和5. 4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连 接，连接液转化入大肠杆菌，在含50ug/ml的卡那霉素的LB培养基上培养18- 小时，筛选 转化子提取质粒，即为质粒PE15TFPI2。所述引物TP2F1 为 5，-GATATCTTGTCACCTAAAGGCGTGT-3，，TP2R1 为 5，-GATATCAGC CTGCAAGAAAGTGATG-3’。所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠， 97. 5%蒸馏水。3)组织因子途径抑制物TFPI-I和TFPI-2的表达和制备将步骤1)和2)的质粒pE15TFPIl和pE15TFPI2分别转化大肠杆菌BL21(DE3)(购 于“天根生化科技(北京)有限公司”)，在含50ug/ml的卡那霉素的LB培养基上培养，筛 选转化子即为 BL21/pE15TFPIl 和 BL21/pE15TFPI2。将 BL21/pE15TFPIl 和 BL21/pE15TFPI 分别于含有卡那霉素的LB培养基中于37°C培养至0D_为0. 6，加入异丙基- β -D-硫代半 乳糖苷使培养基中异丙基-β -D-硫代半乳糖苷终浓度达到ImM，37°C继续摇动培养4_5小 时，而后用GE Healthcare (美国)公司的nickel-nitrilotriacetic acid亲和层析柱纯 化重组蛋白(层析条件用4-5ml Wash buffer洗柱两次，随后用0. 5_lml Elution buffer 洗柱，收集所有洗脱液)。将洗脱液中的重组蛋白进行N-端氨基酸测序，证实其分别为序列 表SEQ ID No. 1中氨基酸序列所示的组织因子途径抑制物TFPI-1，序列表SEQ ID No. 2中 氨基酸序列所示的组织因子途径抑制物TFPI-2。上述Wash buffer 成分为50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mM imidazole, pH 8. 0 ； 上述 Elution buffer 成分为50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mMimidazole, pH 8. 0.
实施例3组织因子途径抑制物TFPI-I和TFPI-2的应用1)迟缓爱德华氏菌制备。在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TXl (保存于CGMCC， 编号为CGMCC No. 2330)至OD600为0. 5，然后离心(5000g，4°C ) IOmin0收集菌体，将其悬浮 于PBS中至终浓度为lxl05cfu/ml。所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl,0. 02 % KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO402)组织因子途径抑制物TFPI-I和TFPI-2杀菌效应。将20ul上述步骤1)的菌液 分别与0. 5uM实施例2制备的TFPI-I、TFPI-2和PBS (对照)混合，于25°C保温3_5h。随 后将混合液涂布于LB固体平板，培养32-4他。菌落计数发现，与PBS相比，TFPI-I和 TFPI-2处理导致细菌数目减低约90%，即约90%的细菌被TFPI-I和TFPI-2杀死。另将上述实施例2制备的TFPI-I和TFPI-2处理鳗弧菌，处理过程按照上述操作， 与PBS相比，TFPI-I和TFPI-2处理导致细菌数目减低约90%，即约90%的细菌被TFPI-I 和TFPI-2杀死。因此，TFPI-I和TFPI-2具有良好的杀菌效应，可防止鱼类细菌性病害，既 可作为鱼类细菌的杀菌剂。
权利要求
1.一种组织因子途径抑制物，其特征在于组织因子途径抑制物TFPI-I如序列表SEQ ID No. 1中氨基酸序列所示；组织因子途径抑制物TFPI-2如序列表SEQ ID No. 2中氨基酸 序列所示。
2.—种权利要求1所述的组织因子途径抑制物的构建方法，其特征在于1)质粒pE15TFPIl的构建以美国红鱼cDNA为模板，用引物TPlFl和TPlRl进行PCR扩增，扩增产物纯化后与载 体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒 pBSTPl ；将上述质粒PBSTPl和质粒pET259分别用限制性内切酶EcoRV和SwaI酶切后回收 0. 78kb和5. 4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化 子提取质粒，即为PE15TFPI1 ；2)质粒pE15TFPI2的构建以美国红鱼cDNA为模板，用引物TP2F1和TP2R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载 体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒 PBSTP2 ；将上述质粒PBSTP2和质粒pET259分别用限制性内切酶EcoRV和Swa I酶切后回收 0. 61Λ和5. 41Λ片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子 提取质粒，即为质粒PE15TFPI2 ；3)组织因子途径抑制物TFPI-I和TFPI-2的制备将上述步骤1)和2、的质粒pE15TFPIl和pE15TFPI2分别转化大肠杆菌BL21 (DE3)，筛 选转化子即为 BL21/pE15TFPIl 和 BL21/pE15TFPI2。将 BL21/pE15TFPIl 和 BL21/pE15TFPI 分别于含有卡那霉素的LB培养基中于37°C培养0D_为0. 6，并加入终浓度为ImM的异丙 基-β-D-硫代半乳糖苷，再以37°C继续培养4-5小时，而后用nickel-nitrilotriacetic acid亲和层析柱纯化重组蛋白，即分别为序列表SEQ ID No. 1中氨基酸序列所示的组织 因子途径抑制物TFPI-1，序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列所示的组织因子途径抑制物 TFPI-2。
3.按权利要求2所述的组织因子途径抑制物的构建方法，其特征在于所述步骤1)中 弓I物 TPlFl 禾口 TPlRl 分另Ij为 TPlFl :5’ 一GATATCAGAAGAGACAGACAAGCA—3’ 禾口 TP1R15’ -GATAT CGATGGAGCGATGAAGAAT-3‘。
4.按权利要求2所述的组织因子途径抑制物的构建方法，其特征在于所述步骤2)中 引物 TP2F1 和 TP2R1 分别为 TP2F15，-GATATCTTGTCACCTAAAGGCGTGT-3，TP2R1 5，-GATATCA GCCTGCAAGAAAGTGATG-3’。
5.一种权利要求1所述的组织因子途径抑制物的应用，其特征在于所述序列表SEQ ID No. 1中氨基酸序列组织因子途径抑制物TFPI-I和序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列组 织因子途径抑制物TFPI-2可作为鱼类细菌的杀菌剂。
全文摘要
本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是组织因子途径抑制物及其制备和应用。组织因子途径抑制物TFPI-1如序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示；组织因子途径抑制物TFPI-2如序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示。其制备方法将质粒pE15TFPI1和pE15TFPI2分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得BL21/pE15TFPI1和BL21/pE15TFPI2，将其用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后通过亲和层析纯化重组蛋白，即为TFPI-1和TFPI-2。所述组织因子途径抑制物具有高效杀菌作用，因此可以抵抗细菌感染，用于疾病防治。本发明的TFPI可以有效裂解多种致病菌，从而抑制细菌感染。
文档编号C07K14/435GK102070711SQ20101054492
公开日2011年5月25日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者孙黎, 张敏 申请人:中国科学院海洋研究所