专利名称：一种R蛋白Glyma11g00320在促进水杨酸生物合成以及增强植物抗病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及增强植物抗病性的蛋白、其编码核苷酸序列与应用。本发明的某些方面涉及将本发明提供的R蛋白编码核苷酸序列导入植物细胞中，并使其表达，从而促进了植物水杨酸的合成以及增强植物的抗病性。
背景技术：
植物在栽培生产过程中常发生各种病害，一些病害对植物生长构成极大威胁，如根腐病、灰斑病等。对于农作物，这些病害严重损害其产量和质量。对于植物病害，目前主要采用药物措施防治。最近人们开始应用非生物诱导剂诱导植物抗病性，并已广泛应用于烟草、马铃薯、番茄、黄瓜、菜豆、水稻等多种重要农作物。这种措施的效果虽然理想，但成本较高，并污染环境。因此，迫切需要开发新的生物学手段以提高植物自身的抗病性。系统获得性抗性是植物的一种防御反应，当植物遭受病原体和害虫攻击时，这种反应会被诱导，并且能够迅速扩散到植株的其它部位以保护植物。病程相关蛋白I3R是一类逆境蛋白，被认为在植物的抗病中起重要作用，其中编码PRl蛋白的基因常被用作植物抗病反应和系统获得抗性中的指示基因，PRl基因的表达在植物抗病反应中起重要作用。水杨酸是广泛存在于植物体内的酚类物质，被认为是诱发系统获得性抗性的信号，可以诱导对病毒、细菌、真菌等多种病原体的抗性。研究表明，外施水杨酸后，PRl基因的转录被显著激活。研究还发现，当植物某部位遭受病原体攻击之后，植物体内水杨酸含量会增加，而且水杨酸的增加出现在PRl基因表达之前。(L Sticher, B Mauch-Mani，and JP Metraux. Systemic Acquired Resistance. Annual Review of Phytopathology,1997, 35 :235-270 ；ER Ward, SJ Uknes, SC Williams et al. , Coordinate Gene Activity in Response to Agents That Induce Systemic Acquired Resistance. The Plant Cell, 1991,3 :1085-1094)研究进一步发现，植物中水杨酸的合成在很大程度上是通过异分支酸合成酶 (ICS, isochorismate synthase) ICSl 作用于底物异分支酸(isochorismate)从而合成水杨酸。但目前对于植物水杨酸合成调控的研究报道还极为少见。植物的抗性基因(resistance gene, R gene)是一类显性或半显性基因，它所编码的蛋白产物与病原菌的无毒基因(avirulence gene, avr)所编码的蛋白质之间存在着相互作用，这种相互作用是植物识别病原菌并迅速产生超敏反应(hypersensitive response,HR)进而引发整株植物的非特异性抗性，即系统获得性抗性(systemic acquired resistance, SAR)所必需的。随着生物科学的不断发展，近几年来关于R基因的研究已经取得了重大进展。人们已经成功克隆了 48 个 R 基因(Dilbirligi M.，and Gill K. S. ,2003, Identification and analysis of expressed resistance gene sequences in wheat, Plant Mol. Biol.， 53(6) :439-453),并且初步认识了它们的结构、特征、特异性分子基础和进化起源，以及R基因介导的抗病的分子机理。研究发现，大多数R基因所编码的R蛋白具有相类似的结构域，即核苷酸结合位点 (nucleotide binding site, NBS) > g(leucine-rich repeat, LRR) 氨酸 / 苏氨酸激酶(serine-threonine kinase，STK)、亮氨酸拉链(leucine zippers, LZ) 和 iToll/ 白细胞介素-1 受体类似结构(TollAnterleukin-l receptor simility，TIR)。 那么究竟是哪些R基因及其蛋白可以调控ICSl表达及水杨酸的合成，特别是在大豆中，对水杨酸的合成及其调节机制的研究报告很少，有待于深入研究。发明概述在一个方面，本发明提供了一种R蛋白及其编码核苷酸序列，以及该R蛋白的类似物蛋白及其编码核苷酸序列。在另一个方面，本发明提供了一种增强植物抗病性的方法。所述方法包括将编码本发明R蛋白的核苷酸序列导入植物细胞中，并使其表达。所述植物细胞可以来源于双子叶植物或单子叶植物。所述病害可以是根腐病、灰斑病等。在某些实施方案中，所述植物细胞是大豆细胞。在又一个方面，本发明提供了一种调节植物水杨酸合成的方法。所述方法包括将编码本发明R蛋白的核苷酸序列导入植物细胞中，并使其表达。在某些实施方案中，所述植物细胞是大豆细胞。在又一个方面，本发明提供了一种调控植物抗性基因表达的方法。所述方法包括将本发明R蛋白的编码核苷酸序列导入植物细胞中，并使其表达。在某些实施方案中，所述植物抗性基因是PRl基因。在一个具体的实施方案中，本发明R蛋白通过调控植物水杨酸合成来调控植物抗性基因表达。在又一个方面，本发明提供了生产具有增强的抗病性的植物的方法。所述方法包括提供表达编码本发明R蛋白的核苷酸序列的植物细胞，并在合适的条件下将所述植物细胞培养为植物。进一步地，本发明提供了参与水杨酸合成调节的R蛋白，其来源于大豆，可具有序列表中SEQ ID N0:2的氨基酸序列，命名为Glymallg00320蛋白。其编码核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示，命名为Glymallg00320基因。此外，本发明还提供了 Glymallg00320蛋白的类似物蛋白，以及其编码核苷酸序列。附图简述
图1为大豆Glymallg00320基因PCR电泳图。图2为拟南芥ICSl基因启动子PCR电泳图。图3为拟南芥PRl基因启动子PCR电泳图。图4显示融合FLAG表达标签的大豆Glymal lg00320基因表达载体图。图5显示拟南芥ICSl基因启动子连接GFP报告基因的表达载体图。图6显示拟南芥PRl基因启动子连接GFP报告基因的表达载体图。图7显示将大豆Glymal lg00320基因表达载体和拟南芥ICSl基因启动子连接GFP 报告基因的表达载体共同转化原生质体后，GFP荧光蛋白的显微镜观测结果。图8显示将大豆Glymal lg00320基因表达载体和拟南芥ICSl基因启动子连接GFP报告基因的表达载体共同转化原生质体后，GFP荧光蛋白的Western Blotting结果。图9显示将大豆Glymal lg00320基因表达载体和拟南芥ICSl基因启动子连接GFP 报告基因的表达载体共同转化原生质体后，FLAG蛋白的Wfestern Blotting结果。图10显示将大豆Glymal lg00320基因表达载体和拟南芥PRl基因启动子连接GFP 报告基因的表达载体共同转化原生质体后，GFP荧光蛋白的显微镜观测结果。图11显示将大豆Glymallg00320基因表达载体和拟南芥PRl基因启动子连接GFP 报告基因的表达载体共同转化原生质体后GFP荧光蛋白的Western Blotting结果。图12显示将大豆Glymal lg00320基因表达载体和拟南芥PRl基因启动子连接GFP 报告基因的表达载体共同转化原生质体后FLAG蛋白的Wfestern Blotting结果。发明详述定义本说明书全篇中所用的术语应解释为具有对本领域普通技术人员而言常规和典型的意义。然而，申请人希望给予下列术语如下特定含义。术语“基本一致”相对于核苷酸序列而言可以被解释为核苷酸序列与参考核酸序列有至少约85 %、90 %、95 %或97 %的序列一致性。术语“一致”应解释成，在比对序列并引入空隙(如果需要的话，以使整个序列达到最大的序列一致性百分比)之后，不考虑保守替代作为序列一致性的一部分时，候选序列中和与其比较的对应序列中相同的核苷酸的百分数。3’端或5’端延伸或插入不应被理解成减少了一致性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是本领域所熟知的。用序列分析软件可以测定序列一致性。术语“植物”包括完整的植物、植物器官(例如，叶、茎、根，等)、种子等。术语“严格杂交条件”通常指盐浓度低于约1. 5M，通常为约0.01-1. 0M，pH在约 7. 0-8. 3之间，温度在约30-60摄氏度之间。也可以通过添加去稳定剂，例如甲酰胺，来实现严格杂交条件。术语“报告基因”通常指一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把报告基因的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。常见的报告基因包括GFP、FLAG等。术语“类似物蛋白”应理解为指与Glymallg00320蛋白不同的任何分子，但仍保留与Glymallg00320蛋白相似或基本相似的生物学功能，特别是调节植物水杨酸合成。在一些方面，类似物蛋白的基本整体结构与Glymallg00320蛋白相似，或结构上仅与实现 Glymallg00320蛋白生物学功能的一个或多个区域或结构域的结构相似。典型地，可以通过向Glymallg00320蛋白的氨基酸序列添加一个或多个氨基酸、从Glymallg00320蛋白的氨基酸序列删除一个或多个氨基酸、和/或置换Glymallg00320蛋白的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸、和/或上述方式的组合提供或形成Glymallg00320蛋白的类似物蛋白。在一些方面，本发明涵盖了导致氨基酸序列改变的氨基酸倒置和其它突变改变。可以通过向核酸分子中引入核苷酸改变，从而通过表达突变的核酸分子实现需要的氨基酸改变。氨基酸的取代可涉及保守的或非保守的氨基酸取代。术语“氨基酸保守置换”指用特征相似或基本相似的的另一个氨基酸来替换氨基酸残基，基本不改变蛋白质的生物学功能。下表1中提供了示例性的氨基酸保守置换。在一些方面，具体的保守置换是G、A、V、I、L、M ；D、E、N、Q ;S、C、T ;K、R、H ；和P、N-α -烷基氨基酸。在一些方面，氨基酸保守置换可以基于以下选择，它们对(a)取代区域中肽骨架的结构、(b)蛋白质在取代位点的电荷或疏水性、(c)在取代位点的侧链体积、和/或上述方面的组合，不具有任何实质性的影响。表1 示例性氨基酸保守置换AlaVal*, Leu, IleArgLys*, Gin, AsnAsnGln氺，His, Lys, Arg, AspAspGlu*, AsnCysSerGlnAsn*, His, Lys,GluAsp*，γ-羧基谷氨酸(Gla)GlyProHisAsn, Gin, Lys, Arg氺lieLeu*, Val, Met, Ala, Phe, norleucine (Nle)LeuNle, lie*, Val, Met, Ala, PheLysArg*, Gin, Asn, ornithine (Orn)MetLeu*, lie, Phe, NlePheLeu*, Val, lie, AlaProGly*，羟脯氨酸(Hyp)，Ser, ThrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp, Phe*, Thr, SerVallie, Leu*, Met, Phe, Ala, Nle*表示优选的保守置换在一个方面，本发明提供了一种R蛋白及其编码核苷酸序列，以及其类似物蛋白及其编码核苷酸序列。进一步地，本发明提供了参与水杨酸合成调节的R蛋白，其来源于大豆，可具有序列表中SEQ ID N0:2的氨基酸序列，命名为Glymallg00320蛋白。其编码核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示，命名为Glymallg00320基因。此外，本发明还提供了 Glymallg00320蛋白的类似物蛋白，以及其编码核苷酸序列。在另一个方面，本发明提供了一种增强植物抗病性的方法。所述方法包括将本发明R蛋白的编码核苷酸序列导入植物细胞中，并使其表达。所述植物细胞可以来源于双子叶植物或单子叶植物。所述病害可以是根腐病、灰斑病。在某些实施方案中，所述植物可以是大豆。在又一个方面，本发明提供了一种调节植物水杨酸合成的方法。所述方法包括将本发明R蛋白的编码核苷酸序列导入植物细胞中，并使其表达。在又一个方面，本发明提供了一种调控植物抗性基因表达的方法。所述方法包括将本发明R蛋白的编码核苷酸序列导入植物细胞中，并使其表达。在某些实施方案中，所述植物抗性基因是PRl基因。在一个具体的实施方案中，本发明R蛋白通过调控植物水杨酸合成来调控植物抗性基因表达。在又一个方面，本发明提供了生产具有增强的抗病性的植物。所述方法包括提供表达编码本发明R蛋白的核苷酸序列的植物细胞，并在合适的条件下将所述植物细胞培养为植物。在本发明的一个实施方案中，将筛选获得的可能参与植物水杨酸合成调节的候选基因，融合到含有FLAG报告基因的转化表达载体中，通过与连接有诱导水杨酸合成关键基因-异分支酸合成酶基因(ICSl)-启动子的GFP报告基因的转化表达载体共同瞬时转化植物原生质体，根据荧光显微镜观察植物原生质体是否产生绿色荧光。并提取原生质体总蛋白，分别用GFP和FLAG的抗体进行Western Blotting试验，最终鉴定筛选到的候选蛋白是否能够调节水杨酸合成。在另一个实施方案中，本发明提供了一种可以诱导ICSl基因启动子的R蛋白及其编码核苷酸序列。实验证明，将本发明的核苷酸序列构建到表达载体，与连接有诱导ICSl 基因启动子的GFP报告基因的表达载体共同转化到拟南芥原生质体后，可以在原生质体的细胞质中观察到绿色荧光的产生，这说明所述R蛋白能够调控ICSl的启动子起始转录。 Western Blotting杂交的结果也再次证明了 GFP蛋白的增加是因为所述R蛋白的表达所引起的。在另一个实施方案中，本发明提供了一种可以诱导PRl基因启动子的R蛋白及其编码核苷酸序列。实验证明，将本发明的核苷酸序列构建到表达载体，与连接有诱导I3RI 基因启动子的GFP报告基因的表达载体共同转化到拟南芥原生质体后，可以在原生质体的细胞质中观察到绿色荧光的产生，这说明所述R蛋白能够调控PRl的启动子起始转录。 Western Blotting杂交的结果也再次证明了 GFP蛋白的表达是因为所述R蛋白的表达所引起的。不受任何理论的约束，本发明的发明人认为所述R蛋白通过调控植物水杨酸合成促进了抗病基因PRl启动子的起始转录。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明做进一步详细说明。下述实施例中所用方法如无特别说明，则均为常规方法。具体步骤可参见 ((Molecular Cloning :A Laboratory Manual))(Sambrook J. ,Russell,David W. ,Molecular Cloning :A Laboratory Manual,3rd edition,2001, NY,Cold Spring Harbor)。 Mffi弓L 合成及DNA序列测定，均由北京英骏生物有限公司进行。实施例1、与水杨酸合成相关Glymal 1^00320基因的获得检索Wiytozome数据库及文献，获得Glymallg00320基因的序列(登录号 Glymallg00320)，设计正向引物5，> GCTCTAGAATGTCTAGTTTGGTTTTGTTGT > 3，和反向引物 5，> CGGGATCCGGCATCCAAAATCATAAGGAAC > 3，。提取大豆叶片的 RNA，通过反转录得到 cDNA， 用TaKaRa公司I^rimeSTAR HS高保真酶的方法将该基因扩增出来，构建到3^-FLAG表达载
7体中，将连接产物通过热激方法转化进大肠杆菌DH5 α菌株，挑选阳性菌落加入到2. 5ml含 50mg/L氨苄霉素的LB液体培养基中，在37°C、180rpm的摇床中培养12-16小时。小量提取质粒，酶切鉴定正确后，送英骏生物公司进行序列测定。将测序正确的质粒用QIAGEN生物公司的质粒大提试剂盒进行质粒大提，最终将质粒浓度定为2ug/ul，OD2607280介于1. 8到 2. 0之间，用于后面的拟南芥原生质体转化试验。根据本实验所设计的引物，最终成功克隆到了全长为636bp的Glymallg00320基因(其核苷酸序列为SEQ ID N0:1所示序列)，电泳结果参见图1，其中M代表核苷酸的 marker,为 TaKaRa 公司的 DL2000。t施例2、拟南芥水杨酸合成关键某因ICSl某因启动子(ProAtIcsl)的获得检索NCBI数据库及文献，获得AtICSl的序列(登录号AT1G74710)， 根据生物信息学的方法分析启动子序列，根据其序列分析结果，分别设计正向弓丨物5， > AACTGCAGTTATCCACGCTTTGTCACACA > 3，和反向引物 5， > CGGGATCCCCATTGCAGAAATTCGTAAAGT > 3，。提取拟南芥叶片的RNA，通过反转录得到cDNA， 用TaKaRa公司I^rimeSTAR HS高保真酶的方法将该基因扩增出来，构建到326-GFP表达载体中，将连接产物通过热激方法转化进大肠杆菌DH5 α菌株，挑选阳性菌落加入到2. 5ml含 100mg/L氨苄霉素的LB液体培养基中，在37°C、180rpm的摇床中培养12-16小时。小量提取质粒，酶切鉴定正确后，送英骏生物公司进行序列测定。将测序正确的质粒用QIAGEN生物公司的质粒大提试剂盒进行质粒大提，最终将质粒浓度定为2ug/ul，OD2607280介于1. 8到 2. O之间，以用于后面的拟南芥原生质体转化试验。根据本实验所设计的引物，最终成功克隆到了全长为2102bp的拟南芥ICSl基因启动子核苷酸片段(其核苷酸序列为SEQ ID NO 3所示序列)，电泳结果参见图2，其中M 代表核苷酸的marker，为TaKaRa公司的DL2000。
_0]3、拟南芥棺4勿抗病基因PRl启动子(Pro^)的获得检索NCBI数据库及文献，获得AtPRl的序列(登录号AT2G14610)， 根据生物信息学的方法分析启动子序列，根据其序列分析结果，分别设计正向引物5，> AACTGCAGTGGCAAATAAACAACGGACA >3，和反向引物 5，> CCGCTCGAGTAAAATTCATTTTTCTAAGTTGA > 3，。提取拟南芥叶片的RNA，通过反转录得到cDNA， 用TaKaRa公司I^rimeSTAR HS高保真酶的方法将该基因扩增出来，构建到326-GFP表达载体中，将连接产物通过热激方法转化进大肠杆菌DH5 α菌株，挑选阳性菌落加入到2. 5ml含 100mg/L氨苄霉素的LB液体培养基中，在37°C、180rpm的摇床中培养12-16小时。小量提取质粒，酶切鉴定正确后，送英骏生物公司进行序列测定。将测序正确的质粒用QIAGEN生物公司的质粒大提试剂盒进行质粒大提，最终将质粒浓度定为2ug/ul，OD2607280介于1. 8到 2. O之间，以用于后面的拟南芥原生质体转化试验。根据本实验所设计的引物，最终成功克隆到了全长为1939bp的拟南芥PRl基因启动子核苷酸片段(其核苷酸序列为SEQ ID NO :4所示序列)，电泳结果参见图3，其中M代表核苷酸的marker，为TaKaRa公司的DL2000。实施例4、拟南芥原生质体的转化实施例4. U326-Pro,tIcsl: :GFP 表达载体与 326-Glymal 1^)0320: FLAG 表达载体的转化
将构建正确的3^-ProAtKS1: :GFP表达载体(参见图5 ；GFP的核苷酸序列为SEQ IDNO 5所示序列)，分别与构建正确的3^-Glymallg00320:FLAG表达载体(参见图4)和 3^-T7-FLC表达载体共同转化拟南芥原生质体。采用PEG介导的拟南芥叶片原生质体瞬时表达的方法。在MS培养基上萌发拟南芥种子，待根长至1-3厘米时即可移栽到土里，温室培养，光照12h/12h，150 μ E0准备好一个90mm培养皿，称1. 82g D-甘露醇于20ml双蒸水中。培养皿的盖子用来切叶片。取4周后未抽薹前的叶片，约90片。切成Imm宽的长条， 置于甘露醇溶液中。配酶解液，IOOml三角瓶，15ml酶解体系。将细条捞出，置于酶解液中。 黑暗，23°C，40-50rpm酶解3小时。酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于15ml离心管(直径约Icm)中，均分为两管。4°C，60g，15分钟。弃上清，沉淀用冰冷的 W5溶液轻柔洗涤，每管。4°C，100g, 1分钟。弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管鈿1。冰上放置30分钟。23°C，100g，l分钟。弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬。共转化时，每种质粒取约15ug于IOml管中，加300ul原生质体。用200ul枪头(剪去前端) 轻柔混勻。加入310ulPEG4000/Ca(NO3)2溶液，轻柔混勻。放置20-30分钟。加入Iml W5 溶液，来回颠倒混勻。23°C，100g，l分钟。弃上清，加IOOul W5，混勻。加900ul W5，混勻。 上述混合液体置于六孔板内，230C，弱光，孵育6-18小时。荧光观察，观察之后常温IOOg离心2分钟，终体积控制在50ul，液氮速冻之后，置于-80°C保存。实施例4. 2、326-ProWR1: :GFP 表汰载体与 326_Glymallg00320:FLAG 表汰载体的转化按照实施例4. 1所述方法，将构建正确的326_ftx)AtPK1::GFP表达载体(参见图6)， 分别与构建正确的3^-Glymallg00320:FLAG表达载体(参见图4)和3^_T7_FLC表达载体共同转化拟南芥原生质体。实施例5、转化后拟南芥原生质体的荧光显微镜观察吸取转化后的拟南芥原生质体30ul，置于载玻片上，轻轻盖上盖玻片后，放于 ZEISSAXI0SK0P荧光显微镜下进行观察和拍照。实施例5. U326-Pro,tIcsl: :GFP 表达载体与 326-Glymal 1^00320: FLAG 表达载体转化的拟南芥原牛质体转化了3^-ProAtresi: :GFP 和 3^_Glymallg00320:FLAG 载体的拟南芥原生质体的荧光显微镜观察结果参见图7，分别进行了荧光观测和明场观测。根据图7所示，我们可以得到在荧光观测下，在共同转化了 3^-ProAtiesi: :GFP和3^_Glymallg00320:FLAG载体的原生质体中，出现了与转化326-GFP载体的正对照相同的绿色荧光。并且此时作为负对照的共同转化3^-ProAtresi: :GFP和3^_T7_FLC载体的原生质体并不能观察到明显的绿色荧光。这样的结果表明，Glymallg00320表达的蛋白，可以与ICSl启动子区作用，并且促使其后续GFP基因的表达。因此可以判断，Glymallg00320基因在正调控水杨酸合成关键酶ICSl 的启动子上，起到了促进的作用。实施例5. 2、326-ProWR1: :GFP 表达载体与 326_Glymal 1^)0320:FLAG 表达载体转化的拟南芥原牛质体转化了3^-ProAtPK1: :GFP 和 3^_Glymallg00320:FLAG 表达载体的拟南芥原生质体的荧光显微镜观察结果参见图10。分别进行了荧光观测和明场观测。根据图10所示，我们可以得到在荧光观测下，在共同转化了 3^-ProAtPK1: :GFP和3^-Glymallg00320:FLAG载体的原生质体中，出现了与转化326-GFP载体的正对照相同的绿色荧光。并且此时作为负对照的共同转化3^-ProAtPK1: :GFP和3^_T7_FLC载体的原生质体并不能观察到明显的绿色荧光。这样的结果表明，Glymallg00320蛋白促进了水杨酸的合成关键酶ICSl基因的表达，并且最终可以导致抗病基因PRl启动子起始转录，并且促使其后续GFP基因的表达。不受任何理论的约束，本发明的发明人认为Glymallg00320基因通过调控植物水杨酸的合成促进了抗病基因PRl启动子的起始转录。t施例6、转化后拟南芥原牛质体总可溶蛋白的Western Blotting检测丨将转化后的拟南芥原生质体加入等体积2 X上样缓冲液，沸水煮5分钟，离心后用于SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳分离胶采用浓度12%的均一胶，浓缩胶浓度为4%。分离胶之上覆盖一层长度约Icm的4%浓缩胶。本试验电流采用20mA/板。电泳完毕后切去浓缩胶等多余部分，并切去凝胶的右上角作为上样顺序标记。电泳凝胶在转膜缓冲液中平衡10-20分钟。之后剪取与电泳凝胶大小一样的PVDF膜，也在右上角做一标记。之后先用甲醇浸润10秒，用水冲洗之后放入转膜缓冲液中平衡10分钟。然后打开半干转膜仪，依次放置三层滤纸、PVDF膜、电泳凝胶、三层滤纸，合上转膜仪顶盖。操作过程中，一定要将膜与胶之间的气泡全部赶出，最后再次确定蛋白是从负极到正极移动。待装好电转移装置后，设定电流大小为所转膜面积的0.8倍，即I(mA)= Area (cm2) X0. 8,电转移 1· 5 小时。电转移完成后，将PVDF膜取出放在培养皿中，将与凝胶接触的一面向上，用TTBS 短暂冲洗后加入TTBS封闭液(TTBS+5%脱脂奶粉)，4°C封闭2小时以上。当膜封闭好之后，按1 2000 (ν/ν)稀释倍数加入GFP或者FLAG的一抗，4°C结合过夜。第二天用TTBS洗涤3次，每次5分钟。然后按照1 5000 (ν/ν)稀释倍数，加入羊抗鼠的辣根过氧化物酶HRP抗体，4°C结合2小时。再用TTBS洗涤3次，每次5分钟。将ECL超敏化学发光液(普利莱生物公司)A和B等体积混合后加到膜上，用保鲜膜包裹平整后，在暗室中压上X光胶片，曝光显影、定影。最后待X光胶片晾干之后，扫描保存。实施例6. U326-Pro,tIcsl: :GFP 表达载体与 326-Glymal 1^00320: FLAG 表达载体转化的拟南芥原牛质体对转化3^-ProAtiesi: :GFP 和 3^_Glymallg00320:FLAG 载体后的拟南芥原生质体，进行总可溶蛋白W^festern Blotting检测。结果参见图8，当用Anti-GFP抗体杂交时我们发现，在共同转化了 3^-ProAtiesi: :GFP和3^-Glymallg00320:FLAG载体的原生质体中，出现了与326-GFP正对照相同条带，可以确定为GFP条带，而在作为负对照的共同转化 326-ProAtIcsl: :GFP和326_T7_FLC载体的原生质体中，并没有GFP蛋白信号。为了判断GFP的产生是否与Glymallg00320蛋白有关，我们又用Anti-FLAG抗体与三种转化的原生质体进行了 Western Blotting检测，结果参见图9。实验结果发现，对转化3^-ProAtiesi GFP和3^_Glymallg00320 FLAG载体的拟南芥原生质体中， 326-Glymallg00320 FLAG确实得到了表达，这就进一步从蛋白水平说明了 Glymal lg00320 基因所表达的蛋白，可以与ICSl的启动子区作用，并且促使其后续GFP基因的表达。因此可以判断，Glymallg00320基因在正调控水杨酸合成关键酶基因ICSl的启动子上，起到了促进的作用。
实施例6. 2、326-ProWR1: :GFP 表汰载体与 326_Glymallg00320:FLAG 表汰载体转化的拟南芥原牛质体对转化3^-ProAtPK1: :GFP和3^_Glymallg00320: FLAG载体后的拟南芥原生质体， 进行总可溶蛋白的Astern Blotting检测。结果参见图11，当用Anti-GFP抗体杂交时我们发现，在共同转化了 3^-ProAtPK1: :GFP和3^_Glymallg00320:FLAG载体的原生质体中，出现了与M6-GFP正对照相同条带，可以确定为GFP条带，而在作为负对照的共同转化 326-ProAtPE1::GFP和326_T7_FLC载体的原生质体中，并没有GFP蛋白信号。为了判断GFP的产生是否与Glymallg00320蛋白有关，我们又用Anti-FLAG抗体与三种转化的原生质体进行了 Western Blotting检测，结果参见图12。实验结果发现，对转化3^-ProAtPK1 GFP和3^_Glymal lg00320 FLAG载体的拟南芥原生质体中， 326-Glymallg00320 FLAG确实得到了表达，这也进一步说明了 Glymal lg00320蛋白诱导了拟南芥原生质体中水杨酸合成关键酶ICSl基因的表达，并且最终可以导致下游抗病基因 PRl启动子起始转录，促使了后续GFP基因的表达。不受任何理论的约束，本发明的发明人认为Glymallg00320基因通过调控植物水杨酸的合成促进了抗病基因PRl启动子的表达。本说明书中提及的所有出版物都通过引用纳入本文中。本说明书中对文献、操作、 材料、仪器、文章等的任何讨论，都仅为本发明公开的实施方式提供上下文背景。不应将其视为承认这些材料中的任一或全部形成现有技术基础的一部分、或者是本发明相关领域的常规知识。如本说明书显示的，在不背离所公开的本发明精神或范围的前提下，可以根据公开的实施方式产生多种变化和/或修饰，这对本领域技术人员是显而易见的。因此，在各方面，本发明的实施方式都应认为是示例性而非限制性的。
权利要求
1.一种调节植物中水杨酸合成的方法，该方法包括将编码下述蛋白的核苷酸序列导入植物细胞，并使该核苷酸序列表达(i)所述蛋白具有SEQID NO 2的氨基酸序列；或(ii)通过置换、缺失或添加SEQID NO :2氨基酸序列中的氨基酸而形成的类似物蛋白，该类似物蛋白可以调节植物中水杨酸的合成。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述置换是氨基酸保守置换。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列为SEQID NO :1所示序列。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列在严格杂交条件下可以与SEQID NO 1核苷酸序列的互补序列杂交。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列的核苷酸序列与SEQID N0:1核苷酸序列基本一致。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述核苷酸序列的核苷酸序列与SEQID N0:1核苷酸序列具有至少90%的一致性
7.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白通过调控所述植物中异分支酸合成酶基因启动子来调节该植物中水杨酸的合成。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述异分支酸合成酶基因启动子具有SEQID NO 3 的核苷酸序列。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞来源于双子叶植物或单子叶植物。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述植物细胞是大豆细胞。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述病害包括根腐病、灰斑病。
12.—种生产具有增强的病害抗性的植物的方法，该方法包括(a)提供表达编码下述蛋白的核苷酸序列的植物细胞(i)所述蛋白具有SEQID NO 2的氨基酸序列；或(ii)通过置换、缺失或添加SEQID NO :2氨基酸序列中的氨基酸而形成的类似物蛋白，该类似物蛋白可以增强植物对病害的抗性；和(b)将所述植物细胞培养为植物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述蛋白通过调节所述植物中水杨酸的合成来使该植物的病害抗性增强。
全文摘要
本发明涉及生产具有增强的病害抗性的植物的方法。在某些方面，本发明提供了一种R蛋白及其编码基因，该蛋白通过调控植物中水杨酸的合成，增强了植物的抗病性。
文档编号C07K14/415GK102477431SQ20101055491
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者周晓锋, 孔祥雄, 蔡斌, 金京波 申请人:中国科学院植物研究所