专利名称：构建应用于高质量噬菌体抗体库的表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种构建应用于高质量噬菌体抗体库的表达载体。
背景技术：
噬菌体抗体库技术的发展和应用为抗体技术领域带来了巨大的变化，已被广泛应 用于生物学、医学等各个研究领域，通过基因工程和噬菌体展示技术的结合，能得到人源化 的针对几乎所有抗原表位的抗体，这极大地推动了各种性能优良抗体及多功能抗体融合蛋 白的开发和应用。噬菌体抗体库模拟了天然抗体库，使得人们可以不经过复杂的免疫过程， 而是直接利用抗原就可以从抗体库中筛选出特异性抗体成为可能。它既解决了人源性单抗 的来源困难、人体杂交瘤系统的低效及鼠单抗的动物源性等难题，也使得单克隆抗体的制 备变得简单易行，稳定有效，使人单克隆抗体的制备有了突破。但是，此技术目前还有许多 问题尚待解决，如在保证抗体库的多样性和呈现效率的同时，如何提高有效库容量、如何在 构建抗体库时提高抗体基因连接效率等问题上，还有待进一步解决。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种载体。本发明提供的载体，按照如下方法制备1)将McB的编码基因1插入到pDF的多克隆位点间，得到中间载体PSBX ；2)将步骤1)得到的中间载体PSBX的BssHII酶切位点改为BglII酶切位点，得到 中间载体PSGX ；3)将&icB的编码基因2插入到步骤2)得到的中间载体PSGX的Nhe I和NcoI酶 切位点间，得到载体pDF-D-SacB ；所述McB的编码基因1为序列表的序列1自5’末端第30-1908位核苷酸；所述McB的编码基因2为序列表中的序列2自5’末端第7-1857位核苷酸。步骤1)中，所述将McB的编码基因1插入到pDF的多克隆位点为将McB的编码 基因1插入到pDF的BssHII和Xba I酶切位点间。本发明的另一个目的是提供一种载体。本发明提供的载体按照如下方法制备1)以pUc19-&iCB为模板，用引物对1进行PCR扩增，得到PCR产物1，将PCR产 物1插入到pDF的BssHII和Xba I酶切位点间，得到中间载体PSBX ；所述PCR产物1即为 SacB的编码基因1，所述McB的编码基因1为序列表的序列1自5’末端第30-1908位核
苷酸；所述引物对1中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列5，所述引物对1中的 另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；2)将步骤1)得到的中间载体PSBX上的BssHII酶切位点改变为BglII酶切位点， 得到中间载体PSGX ；
3)以pUC19-&iCB为模板，用引物对2进行PCR扩增，得到PCR产物2，将得到的 PCR产物2插入到步骤2)得到的中间载体PSGX的Nhe I和Nco I位点间，得到重组载体 PDF-D-SacB ；所述PCR产物2即为&icB的编码基因2，所述&icB的编码基因2为序列表中 的序列2自5’末端第7-1857位核苷酸；所述引物对2中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列7，所述引物对2中的 另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列8。上述将BssHII酶切位点改为BglII酶切位点按照如下方法进行A 将中间载体PSBX用BssHII酶切后，再加入碱性磷酸酶去磷酸化，得到去磷酸化 的PSBX线性片段；B:将含有BglII的引物对在98°C-20°C进行退火，得到退火的引物对，再 向退火的引物对进行磷酸化处理，得到磷酸化的退火引物对；C:将磷酸化的退火引物对和去磷酸化的PSBX线性片段连接，得到中间载体 PSGX ；所述含有BglII的引物对中的一条引物为序列表中的序列3，另一条引物为序列 表中的序列4。所述将含有BglII的引物对在98°C _20°C进行退火，具体为将含有BglII的引物 对在 98°C、90°C、80°C、70°C、60°C、50°C、40°C、30°C和 20°C进行退火。含有所述的载体的转基因细胞系或重组菌或重组病毒也是本发明保护的范围。所述的载体或所述转基因细胞系或重组菌或重组病毒在制备噬菌体抗体库中的 应用也是本发明保护的范围。所述应用中，所述抗体为抗乙肝表面抗原抗体。本发明的实验证明，将抗体基因插入自杀载体(含有自杀基因McB)后，自杀基因 失去功能，而没有插入抗体基因的自杀载体，自杀基因表达自杀蛋白，表达该蛋白的革兰氏 阴性菌在含有蔗糖的培养基中生长时，会将蔗糖分解为对细菌有毒的产物，从而杀死表达 该蛋白的细菌。具体为通过向PDF重、轻链区域插入McB基因，并改造抗体基因克隆位点， 构建了 PDF-D-SacB载体；经检测，pDF-D-SacB可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体，可以 在分泌Cre蛋白酶的细菌胞内发生预期的Cre-Loxp介导的定点重组；pDF-D-SacB中选用 了抗体胚系可变区基因中不存在的内切酶位点，以保证内切酶序列不会影响到成熟抗体分 子氨基端的序列，将酶切位点BssHII改为Bglll，从而极大地提高了抗体基因的连接效率， 减少了工作量。因此，使用自杀基因作为反筛基因与抗性基因等正向筛选基因联合，用于构 建细菌的无痕缺失突变株，用这种方法构建的抗体库质量和稳定性均有提高；本发明的噬 菌粒载体PDF-D-SacB为构建大容量噬菌体抗体库提供了有效工具，同时增加了抗体对抗 原识别的多样性。噬菌粒载体pDF-D-SacB构建的抗体库，不仅容量大，而且质量更高，理论 上可以得到近于100%的有效克隆；为淘选各种类型的抗原的噬菌体抗体打下坚实的研究 ■石出。
图1为验证PUC19-&1CB的自杀功能图2为PCR扩增McB基因纯化回收图3为EcoR I酶切鉴定1 %凝胶电泳图
图4为Dra I酶切鉴定1 %凝胶电泳图(轻链)图5为Dra I酶切鉴定1 %凝胶电泳图(重链)图6为pDF-D-SacB所表达的噬菌体抗体的ELISA检测结果图7为pDF-D-SacB的结构示意图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、载体PDF-D-SacB的获得大肠杆菌transl-Blue购自北京全式金生物有限公司；噬菌体VCSM13、BS1365 菌、表达载体PDF由海军总医院周丽君教授馈赠；Pucig-McB质粒由军事医学科学院疾病 预防控制所黄留玉研究员馈赠；带有抗乙肝病毒表面抗原(HBsAg)人Fab段基因的质粒 B4-HFLF由本室保存。Phusion, BssHII，Xba I，Nco I，Nhe I，BglII，碱性磷酸酶，购自 New EnglandBiolabs(NEB) W] ；EcoR I, Dra I, T4 DNA Ligase, T4 Plolynucleotide Kinnase (PNK) _ 自 TaKaRa ( i； ) ^ W] ；EasyPure Plasmid MiniPrep Kit, EasyPure Quick Gel ExtractionKit 购自北京全式金生物有限公司；5000DNA Marker, DL2000DNA Marker购自北京博迈德公司；1、验证pUC19_&icB的自杀功能1) pUC 19-SacB (王玉飞、陈泽良、乔凤、汪舟佳、杜昕颖、苑锡铜、黄留玉，布鲁氏 菌自杀载体的构建及其在突变株构建中的应用，世界华人消化杂志，2007年9月观日， 15(27) J934-2937;公众可从军事医学科学院微生物流行病研究所获得。)转入大肠杆菌 中，吸取100 μ 1加入到5ml无抗性液体LB培养基中，在37°C摇床上220r/min振摇至饱和， 用挑菌棒蘸取少量该菌液，在含有氨卞抗性的固体LB培养基上划线，放入37°C温箱中过 夜。从平板上挑取携带有pUC19-&iCB质粒的单克隆至3ml含有氨卞抗性液体LB培 养基中，在37°C摇床中220r/min振摇IOh至对数生长期；取上述菌液200 μ 1分别加入到 预先准备好5ml含有氨卞抗性液体LB培养基和含有氨卞抗性及5%蔗糖液体LB培养基两 支试管中，在37°C摇床上220r/min振摇5h，结果见图IA所示，从图中看出，在仅含有氨卞 抗性液体LB培养基中菌生长，但是在含有氨卞抗性及5%蔗糖的培养基中菌未生长，表明， pUC19-SacB在蔗糖环境下有自杀功能。将两支试管的菌液分别从KT1稀释至10_9，各取每个稀释梯度的菌液5 μ 1，加入到 预先准备的含有氨卞抗性固体LB培养基平板上相应的格子中，放入37°C温箱中，次日观察 结果。结果见图IB所示，由图IB可以看出在含有Amp抗性液体LB培养基中生长的大肠 杆菌(左图)，在10—1至10_5均有克隆，且KT1-IO-3稀释倍数克隆无法计数，在10_4有86个 单克隆，在10_5有11个单克隆；而在含有Amp抗性及5%蔗糖液体LB培养基中(右图)生 长的大肠杆菌KT1至10_5均无克隆。表明大肠杆菌在是否含蔗糖的培养基环境里，生长相 差5个数量级，说明PUC19-&CB质粒带有自杀功能，进一步证明自杀基因McB的功能。2、设计引物
为了提高轻链抗体基因连接效率，设计了两条引物来改造原始噬菌粒载体 PDF(乔媛媛、王琰、陈晓穗、王欲晓、化冰，大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定，中华微生物 学和免疫学杂志，2004年3月第M卷第3期，194-197，公众可从军事医学科学院微生物 流行病研究所获得。)上用以连接轻链抗体基因的酶切位点BssHII，其新的酶切位点为 Bglll，同时设计用于克隆McB自杀基因的引物序列来构建抗体库载体，具体引物序列见 表1-1，以及用于克隆抗乙肝表面抗原抗体的引物序列，具体引物见表1-2，所有引物均由 上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表1-1引物序列
权利要求
1.一种载体，按照如下方法制备1)将McB的编码基因1插入到PDF的多克隆位点间，得到中间载体PSBX；2)将步骤1)得到的中间载体PSBX的BssHII酶切位点改为BglII酶切位点，得到中间 载体PSGX ；3)将McB的编码基因2插入到步骤2)得到的中间载体PSGX的NheI和NcoI酶切位 点间，得到载体PDF-D-SacB ；所述McB的编码基因1为序列表的序列1自5’末端第30-1908位核苷酸；所述McB的编码基因2为序列表中的序列2自5’末端第7-1857位核苷酸。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于步骤1)中，所述将McB的编码基因1插入到pDF的多克隆位点为将McB的编码基因 1插入到pDF的BssHII和XbaI酶切位点间。
3.一种载体，按照如下方法制备1)以puC19-&iCB为模板，用引物对1进行PCR扩增，得到PCR产物1，将PCR产物1插 入到pDF的BssHII和Xba I酶切位点间，得到中间载体PSBX ；所述PCR产物1即为SacB的 编码基因1，所述McB的编码基因1为序列表的序列1自5’末端第30-1908位核苷酸；所述引物对1中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列5，所述引物对1中的另一 条引物的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；2)将步骤1)得到的中间载体PSBX上的BssHII酶切位点改变为BglII酶切位点，得到 中间载体PSGX ；3)以pUC19-McB为模板，用引物对2进行PCR扩增，得到PCR产物2，将得到的PCR产物 2插入到步骤2)得到的中间载体PSGX的Nhe I和Nco I位点间，得到重组载体pDF-D-SacB ； 所述PCR产物2即为McB的编码基因2，所述McB的编码基因2为序列表中的序列2自 5’末端第7-1857位核苷酸；所述引物对2中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列7，所述引物对2中的另一 条引物的核苷酸序列为序列表中的序列8。
4.含有权利要求1-3中任一所述的载体的转基因细胞系或重组菌或重组病毒。
5.权利要求1-3中任一所述的载体在制备噬菌体抗体库中的应用；或权利要求4所述转基因细胞系或重组菌或重组病毒在制备噬菌体抗体库中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用中，所述抗体为抗乙肝表面抗原抗体。
全文摘要
本发明公开了一种构建应用于高质量噬菌体抗体库的表达载体。本发明提供的载体，按照如下方法制备1)将轻链区域SacB的编码基因插入到pDF的多克隆位点间，得到中间载体PSBX；2)将步骤1)得到的中间载体PSBX的BssHII酶切位点突变为BglII酶切位点，得到中间载体PSGX；3)将重链区域SacB的编码基因插入到步骤2)得到的中间载体PSGX的Nhe I和Nco I酶切位点间，得到载体pDF-D-SacB。本发明的实验证明，所获得的含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB适用于构建大容量噬菌体抗体库。
文档编号C07K16/18GK102094035SQ201010565730
公开日2011年6月15日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者安小平, 张宝中, 潘博, 王晓娜, 童贻刚, 米志强 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所