专利名称：一种土壤胞外蛋白质的提取分离方法
技术领域：
本发明涉及一种土壤胞外蛋白质的提取分离方法，属于生物技术领域。
背景技术：
环境宏蛋白质组学是近年来新出现的一种概念和研究技术，该技术可将土壤中复 杂的生物群体有效地进行结合并分析，为充分及深入揭示土壤生态系统变化提供了有力的 技术保障。环境宏蛋白质组学研究的关键问题在于，土壤中蛋白质的提取与分析，其中土壤 胞外蛋白质的提取是环境宏蛋白质组学研究的重点。土壤胞外蛋白质包含着，种植于土壤 中的植物、土壤中的微生物、动物等在环境影响下分泌的蛋白质，而这些蛋白质在植物、微 生物、动物的相互联系中起着关键的作用。因此土壤胞外蛋白质的提取是环境宏蛋白质组 学研究的前提，然而由于土壤蛋白质提取方法的缺乏，当前土壤蛋白质组学研究还未能有 效地开展。因此开发一种有效提取土壤胞外蛋白质的方法对于环境宏蛋白质组学研究的研 究具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效的土壤胞外蛋白质的提取分离方法。本发明的土壤胞外蛋白质的提取分离方法，具体方法如下 (1) 土壤胞外蛋白质提取
称取4-6g 土壤于50mL的离心管中，加入0. 05mol/L, pH8. 0的柠檬酸钠缓冲液 16-24mL,于漩涡振荡器中振荡3_4小时，期间每隔15分钟置于冰上冷却5分钟，16000rpm 离心30min ；取上清液过0. 45 μ m的滤膜，取滤液添加pH为8. 0的Tris-饱和酚8_12mL， 置于漩涡振荡器中振荡5-20min，静置25-50min，16000rpm离心30min ；取下层酚相，加入 5倍体积预冷至4°C的0. lmol/L甲醇-醋酸铵溶液，置于_20°C条件下沉淀、过夜，然后 16000rpm离心30min，弃上清液，用10_15mL甲醇洗涤沉淀，16000rpm离心30min，去除上清 液，用10-15mL丙酮洗涤沉淀2次，每次洗涤后于16000rpm离心30min，将沉淀于超净台中 吹干，获得蛋白质干粉。(2) 土壤胞外蛋白质分离
取1.2mg蛋白质干粉，加入300μ 1蛋白质裂解液，制成蛋白质样品，进行双向电泳分
1 O双向电泳的具体步骤选取Mcm IPG胶条，加入蛋白质样品后置于水化盘上水化 12-24小时，然后放入IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、1000V，6 小时、8000V，7小时、3000V，10-30小时；等电聚焦结束后，将胶条分别置于平衡缓冲液I和 平衡缓冲液II中，各平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳；SDS-PAGE电泳凝胶底层为10%分 离胶，用0. 8-1%的琼脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温度保持在 15-20°C,电泳时间为7-9小时；电泳结束后，卸下胶片，胶片经固定、水洗、染色、脱色，最后用扫描仪扫描。本发明的显著优点
1、国际上首次提出土壤胞外蛋白质提取方法。2、提取的土壤胞外蛋白质经SDS-PAGE检测后条带清晰。3、提取的土壤胞外蛋白质经双向电泳分离后蛋白质点清晰。
图1为采用本发明方法提取的土壤胞外蛋白质的SDS-PAGE图，其中1表示水稻土 壤，2表示甘蔗土壤，3表示烟草土壤；
图2为采用本发明方法分离的水稻土壤胞外蛋白质的双向电泳图。
具体实施例方式本发明的土壤胞外蛋白质的提取分离方法，具体方法如下 (1) 土壤蛋白质提取剂的配置
IOOmL的0. 05mol/L的柠檬酸钠缓冲液配置方法称取1. 4705g 2水合柠檬酸钠采用 双蒸水溶解并定溶至IOOmL,并用0. lmol/L的NaOH溶液调节pH值为8.0 ;100mL的0. Imol/ L的NaOH溶液配制方法称取0. 4g NaOH，采用双蒸水溶解并定溶至100mL。IOmL的SDS凝胶缓冲液配置方法首先称取0. 121g Tris定容到lmL，加入浓HCL 调PH值到6. 8，其次加入0. 25g SDS，0. 31g 二硫苏糖醇(DTT)，2mL甘油，0. 02g溴酚蓝加水 定容至10ml。5mL的蛋白质裂解液配置方法称取0.76g硫脲、2. Ig尿素、0. 05g 二硫苏糖醇、 0. 2g 3-[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)于IOmL离心管中，加双蒸水 溶解并定容至5mL。IOOmL的0. lmol/L甲醇-醋酸铵溶液配置方法称取0. 771g醋酸铵，加入40mL的 甲醇溶解，再用甲醇定溶至100mL。IOmL的平衡缓冲液I配置方法称取0. 12g的Tris溶于670 μ L的双蒸水，HCl调 节PH值至8. 8，加入7. 21g的尿素，6. 9mL的甘油，0. 4g的SDS，0. Ig 二硫苏糖醇(DTT)， 加入0. 001 g的溴酚蓝，双蒸水定容至10mL。IOmL的平衡液缓冲II配置方法称取0. 12g的Tris溶于670 μ L的双蒸水，HCl调 节pH值至8. 8，加入7. 21g的尿素，6. 9mL的甘油，0. 4g的SDS, 0. 4g碘乙酰铵，加入0. 001 g的溴酚蓝，双蒸水定容至10mL。IOOOmL的固定液配置方法量取500 mL甲醇、500mL乙酸充分混勻后即可。500mL的染色液配置方法称取0. 6g的G-250，加入50mL的磷酸，50mL的硫酸铵、 IOOmL的甲醇，蒸馏水定容至500mL。(2) 土壤胞外蛋白质提取
称取4-6g土壤于50 mL的离心管中，加入0. 05mol/L，pH8. 0的柠檬酸钠缓冲液16-24mL mL,于漩涡振荡器中振荡3-4小时，期间每隔15分钟置于冰上冷却5分钟，16000rpm离心 30min ；取上清液过0. 45 μ m的滤膜，取滤液添加pH为8. 0的Tris-饱和酚8_12mL，置于漩 涡振荡器中振荡5-20min，静置25_50min，16000rpm离心30min ；取下层酚相，加入5倍体积预冷至4°C的0. lmol/L甲醇-醋酸铵溶液，置于_20°C条件下沉淀、过夜，然后16000rpm 离心30min，弃上清液，用10-15mL甲醇洗涤沉淀，16000rpm离心30min，去除上清液，用 10-15mL丙酮洗涤沉淀2次，每次洗涤后于16000rpm离心30min，将沉淀于超净台中吹干，
获得蛋白质干粉。(3) 土壤胞外蛋白质分离
取1.2mg蛋白质干粉，加入300μ L蛋白质裂解液，用于蛋白质双向电泳分离。双向电 泳具体步骤选取24cm IPG胶条，加入蛋白质样品后置于水化盘上水化12- 小时，放入 IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、1000V，6小时、8000V，7小时、 3000V, 10-30小时；等电聚焦结束后，将每根胶条分别置于平衡缓冲液I和平衡缓冲液II 中平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳凝胶底层为10%分离胶，用0. 8-1%的 琼脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温度保持在15-20°C，电泳时间 为7-9小时。电泳结束后，卸下胶片，先用固定液固定1小时，水洗3次，每次5分钟，然后 用300mL的考马斯亮蓝G-250染色液染色过夜。染色完成，水洗脱色2天，最后用扫描仪扫 描检测蛋白质提取与分离效果。为充分公开本发明的一种有效的土壤胞外蛋白质提取方法，以下结合方法验证和 实施实例加以说明。实施例1
(1) 土壤蛋白质提取步骤
称取5g水稻土壤于50mL的离心管中加入0. 05mol/L柠檬酸钠缓冲液20mL。于漩涡振 荡器中充分振荡3小时。振荡结束后，将离心管置于预冷至4°C的离心机中16000rpm离心 30min。取上清液过0.45 μ m的滤膜并转移至一新的50mL离心管中，添加IOmL Tris-饱和 酚(PH8.0)，置于漩涡振荡器中振荡lOmin，静置30min。然后将离心管置于预冷至4°C的离 心机中16000rpm离心30min，取下层苯酚液体于一新的50mL离心管中，并加入5倍体积预 冷的0. lmol/L甲醇-醋酸铵溶液，置于_20°C条件下沉淀过夜。将沉淀后的溶液于预冷至 4°C的离心机中16000rpm离心30min。倒掉上清液，用IOmL甲醇洗涤沉淀后4°C的离心机 中16000rpm离心30min，去除甲醇溶液，IOmL丙酮洗涤沉淀2次，每次洗涤后于4。C的离心 机中16000rpm离心30min。将沉淀于超净台中吹干。吹干后的沉淀用蛋白裂解液溶解，采 用SDS-PAGE检测土壤胞外蛋白质提取效果。SDS-PAGE电泳条件凝胶规格为102X84X2. 4mm,分离胶为10%聚丙烯酰胺凝 胶，用1%琼脂糖(电泳缓冲液配置)封闭；电泳槽加入电极缓冲液；15mA恒流进行电泳，室 温，待溴酚蓝离底部0. 5cm即可停止电泳，电泳2小时；电泳槽电极缓冲液配比25mmol/L Tris, 192mmol/L 甘氨酸，0. 1%SDS。如图1所示，采用本发明方法提取不同作物土壤胞外蛋白质结果表明，提取土壤 胞外蛋白质经SDS-PAGE检测后条带清晰。(2) 土壤蛋白质分离步骤
取1.2mg水稻土壤蛋白质干粉，加入300μ 1蛋白质裂解液，用于蛋白质双向电泳分离。 双向电泳具体步骤选取Mcm IPG胶条，加入蛋白质样品后置于水化盘上水化12小时，放 入IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、1000V，3小时、8000V，6小 时、3000V，10小时；等电聚焦结束后，将每根胶条分别置于平衡缓冲液I和平衡缓冲液II中平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳凝胶底层为10%分离胶，用1%的琼 脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温度保持在15°C，电泳时间为9小 时。电泳结束后，卸下胶片，先用固定液固定1小时，水洗3次，每次5分钟，然后用300mL 的考马斯亮蓝G-250染色液染色过夜。染色完成，水洗脱色2天，最后用扫描仪扫描。如图 2所示，采用本发明方法提取分离的水稻土壤胞外蛋白质双向电泳结果表明，提取的土壤胞 外蛋白质分离效果良好，土壤蛋白质点清晰，分离的蛋白质点多。实施例2
(1) 土壤胞外蛋白质提取
称取4g甘蔗土壤于50mL的离心管中，加入0. 05mol/L, pH8. 0的柠檬酸钠缓冲液16mL， 于漩涡振荡器中振荡3小时，期间每隔15分钟置于冰上冷却5分钟，16000rpm离心30min ； 取上清液过0. 45 μ m的滤膜，取滤液添加pH为8. 0的Tris-饱和酚8mL，置于漩涡振荡器 中振荡5min，静置25min，16000rpm离心30min ；取下层酚相，加入5倍体积预冷至4°C的 0. lmol/L甲醇-醋酸铵溶液，置于_20°C条件下沉淀、过夜，然后16000rpm离心30min，弃 上清液，用IOmL甲醇洗涤沉淀，16000rpm离心30min，去除上清液，用IOmL丙酮洗涤沉淀2 次，每次洗涤后于16000rpm离心30min，将沉淀于超净台中吹干，获得蛋白质干粉。(2) 土壤胞外蛋白质分离
取1.2mg蛋白质干粉，加入300μ 1蛋白质裂解液，制成蛋白质样品，进行双向电泳分
1 O双向电泳的具体步骤选取Mcm IPG胶条，加入蛋白质样品后置于水化盘上水化 12小时，然后放入IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、1000V，6小 时、8000V，7小时、3000V，10小时；等电聚焦结束后，将胶条分别置于平衡缓冲液I和平衡 缓冲液II中，各平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳；SDS-PAGE电泳凝胶底层为10%分离胶， 用0. 8%的琼脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温度保持在15-20°C， 电泳时间为7小时；电泳结束后，卸下胶片，胶片经固定、水洗、染色、脱色，最后用扫描仪扫 描。如图2所示，结果表明，提取的土壤胞外蛋白质分离效果良好，土壤蛋白质点清晰，分离 的蛋白质点多。实施例3
(1) 土壤胞外蛋白质提取
称取6g烟草土壤于50mL的离心管中，加入0. 05mol/L, pH8. 0的柠檬酸钠缓冲液24mL， 于漩涡振荡器中振荡4小时，期间每隔15分钟置于冰上冷却5分钟，16000rpm离心30min ； 取上清液过0. 45 μ m的滤膜，取滤液添加pH为8. 0的Tris-饱和酚12mL，置于漩涡振荡器 中振荡5-20min，静置50min，16000rpm离心30min ；取下层酚相，加入5倍体积预冷至4°C 的0. lmol/L甲醇-醋酸铵溶液，置于_20°C条件下沉淀、过夜，然后16000rpm离心30min， 弃上清液，用15mL甲醇洗涤沉淀，16000rpm离心30min，去除上清液，用15mL丙酮洗涤沉淀 2次，每次洗涤后于16000rpm离心30min，将沉淀于超净台中吹干，获得蛋白质干粉。(2) 土壤胞外蛋白质分离
取1.2mg蛋白质干粉，加入300μ 1蛋白质裂解液，制成蛋白质样品，进行双向电泳分
1 O双向电泳的具体步骤选取Mcm IPG胶条，加入蛋白质样品后置于水化盘上水化24小时，然后放入IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、1000V，6小 时、8000V，7小时、3000V，O小时；等电聚焦结束后，将胶条分别置于平衡缓冲液I和平衡 缓冲液II中，各平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳；SDS-PAGE电泳凝胶底层为10%分离胶， 用1%的琼脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温度保持在15-20°C， 电泳时间为9小时；电泳结束后，卸下胶片，胶片经固定、水洗、染色、脱色，最后用扫描仪扫 描。如图2所示，结果表明，提取的土壤胞外蛋白质分离效果良好，土壤蛋白质点清晰，分离 的蛋白质点多。
权利要求
1.一种土壤胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下(1)土壤胞外蛋白质提取称取4-6g 土壤于50mL的离心管中，加入0. 05mol/L, pH8. 0的柠檬酸钠缓冲液 16-24mL,于漩涡振荡器中振荡3_4小时，期间每隔15分钟置于冰上冷却5分钟，16000rpm 离心30min ；取上清液过0. 45 μ m的滤膜，取滤液添加pH为8. 0的Tris-饱和酚8_12mL， 置于漩涡振荡器中振荡5-20min，静置25-50min，16000rpm离心30min ；取下层酚相，加入 5倍体积预冷至4°C的0. lmol/L甲醇-醋酸铵溶液，置于_20°C条件下沉淀、过夜，然后 16000rpm离心30min ；弃上清液，用10_15mL甲醇洗涤沉淀，16000rpm离心30min，去除上清 液，用10-15mL丙酮洗涤沉淀2次，每次洗涤后于16000rpm离心30min ；将沉淀于超净台中 吹干，获得蛋白质干粉；(2)土壤胞外蛋白质分离取1.2mg蛋白质干粉，加入300μ 1蛋白质裂解液，制成蛋白质样品，进行双向电泳分1 O
2.根据权利要求1所述的一种土壤胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于步骤(2) 所述双向电泳的具体步骤为选取Mcm IPG胶条，加入蛋白质样品后置于水化盘上水化12-24小时，然后放入 IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、1000V，6小时、8000V，7小时、 3000V, 10-30小时；等电聚焦结束后，将胶条分别置于平衡缓冲液I和平衡缓冲液II中，各 平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳；SDS-PAGE电泳凝胶底层为10%分离胶，用0. 8-1%的琼 脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温度保持在15-20°C，电泳时间为 7-9小时；电泳结束后，卸下胶片，胶片经固定、水洗、染色、脱色，最后用扫描仪扫描。
全文摘要
本发明提供了一种土壤胞外的蛋白质提取分离方法，该方法采用土壤的柠檬酸钠提取液，经Tris-饱和酚、甲醇-醋酸铵等进一步进行胞外蛋白质的提取，然后通过双向电泳分离。提取的土壤胞外蛋白质经SDS-PAGE检测后条带、蛋白质点清晰，是国际上首次提出的土壤胞外蛋白质的提取分离方法。
文档编号C07K1/36GK102079776SQ20101058515
公开日2011年6月1日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者何海斌, 俞振明, 吴林坤, 张志兴, 林文雄, 王海斌 申请人:福建农林大学