专利名称：一种荧光筛选克隆载体及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和微生物学领域。具体的讲，本发明涉及一种荧光筛选载体，同时涉及到该载体的构建方法，以及该载体在精确筛选细菌阳性菌落中的应用。
背景技术：
70年代后，以基因工程技术的出现作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能改造生命的新时期开始，其间的重大成就包括重组DNA技术的建立和发展。重组 DNA (Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤1)重组DNA分子的构建；2)将重组DNA分子转化宿主细胞；3)重组子筛选及增殖；4)收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子(质粒)，并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如 α -互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有半乳糖苷酶基因(IacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS)，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β -半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，IacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂 IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA 插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37°C温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。蓝白斑筛选重组子的方法一直沿用至今，基本可以满足实验需要。但是我们在长期大量实验中总结发现，有些时候平板生长15小时以上，仍然无法分辨出蓝白斑，或者全部为蓝斑；总结如下1)某些特定的基因会影响细菌正常成长，致使细菌生长缓慢，菌落在常规时间内无法生长到一定大小，以至于肉眼无法分辨其颜色；2)插入基因片段太小并没有破坏编码框，以至于表达的蛋白仍然可以产生α-互补效应；幻基因工程菌株并没有对应的IacZ基因缺陷。绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Portein，GFP)是从一种生活在北太平洋寒冷水域的水母体内发现的，它的27k Da的单体由238个氨基酸构成，本身就是一个生物发光系统，附带有激发后能发射生物荧光的发光色基，其发光过程不同于其它生物发光组织，不需荧光素酶参与，也不需要任何的协同因子、底物等。当GFP在原核或真核细胞中表达并受到蓝光或紫外光辐照时就可发出亮绿色荧光。GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450 490nm蓝光波长下更稳定。GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大， 如生物材料的固定，脱水剂戊二酸或甲醛等。GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析.GFP的晶体结构是由11个β -折叠组成的柱状结构，直径约3nm，长约4nm。柱中央有一个α-螺旋(图1)，发色基团在α-螺旋上，非常靠近柱的中心(图1，图2)。蛋白的二级结构大部分为α-螺旋和β-折叠。GFP色基是由丝氨酸酪氨酸甘氨酸GerTyrGly)形成的环化三肽所构成，并且只有色基包被在完整的GFP蛋白中才能发出荧光，被切断的GFP(即使是C末端的少数几个氨基酸)亦能导致GFP失去发光能力。GFP和GFP S65T的晶体结构研究表明色基紧密地包被在由β折叠围成的β盒中。这一结构提供了色基发射荧光的微环境，该环境排除了基质及氧对色基发光的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得到了保护。发色团由蛋白质链上的三个氨基酸甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸(或丝氨酸)自发形成。只具备一级结构GFP是不能发光的，功能性色基的形成是在转录翻译后， 并经历一个环化反应和一分子氧的氧化步骤。RedSiifted(红偏移)GFP突变系(EGFP & GFP S65T)色基发生了氨基酸取代， Xmax(Excitation)偏移至490nm附近。红偏移突变系的最大激发峰都落在常用滤色片的波长范围内，所以获得的荧光信号要比wtGFP明亮得多。同样，FACS和共焦显微镜的氩离子光源的发射波长为488nm，对RedShifted突变系的激发效率也明显高于wtGFP。EGFP发生了双氨基酸取代，Leu (亮氨酸)取代Phe64 (苯丙氨酸)，Thr (苏氨酸)取代Ser65 (丝氨酸)。基于等量溶解蛋白的光谱分析，由于Em(消光系数)的增加和色基构型的高效率， EGFP在488nm处激发后灯荧光强度为wtGFP的35倍。在相同条件下089歷)测得EGFP 得 Em 为 53，OOOcm-IM-I，而 wtGFP 为 9，500CM-1M-1，GFPS65T 为 55，OOOcm-IM-I0 EGFP 的色基构型在37°C比wtGFP或GFPS65T发光效率更高，在这一温度下表达的EGFP可溶性蛋白95%为有效色基。GFPS65T为Thr取代Ser65的突变体，同样条件下，它的荧光强度强于 wtGFP4 6倍，并且其唯一的Redshifted激发峰位于490nm，但37°C时色基形成的效率不如 EGFP。
发明内容
本发明的目的是在于克服现有技术中的缺陷，提供一种荧光筛选克隆载体及其制备与应用。本发明的载体替换了原有载体的IacZ的α -互补筛选，而采用绿色荧光蛋白作为筛选标准。绿色荧光蛋白基因在Lac启动子启动下完成表达，只要有该功能蛋白的产生，即能够准确快速的检测到阳性克隆的存在。本发明一方面提供了一种荧光筛选克隆载体，以编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸和/或其互补链为其阳性克隆筛选标记，所述增强型绿色荧光蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO. 5。
较佳的，所述编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸序列为SEQ ID NO. 4。较佳的，所述荧光筛选克隆载体的多核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。其结构图如图 11。本发明第二方面提供了所述荧光筛选克隆载体的制备方法，为将编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸和/或其互补链克隆入载体，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 5。进一步的，所述编码绿色荧光蛋白的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ ID NO. 4。所述编码绿色荧光蛋白的多核苷酸可采用化学合成的方式获得，如设计引物并用 overlap PCR方法拼接获得。如实施例列举的，克隆入的载体可为pUC18。所述荧光筛选克隆载体可为将编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸和其互补链克隆入PUC18的EcoRI和NdeI位点之间获得。如实施例列举的，荧光筛选克隆载体的制备可包括以下步骤A.通过合成引物及overlap PCR方法获得两端带有EcoRI和NdeI酶切位点的全长muEGFP基因，所述全长muEGFP基因的编码序列如SEQ ID N0. 4所示；B.用EcoRI和NdeI酶切消化步骤A获得的全长muEGFP基因和载体pUC18，将消化片段连接后得到荧光筛选克隆载体。由于本发明提供的阳性筛选标记内含有多克隆位点，一旦外源基因插入到多克隆位点，则会影响到绿色荧光蛋白的表达，从而使得克隆入外源基因的阳性克隆在488nm光照射下不发出绿色荧光以与未插入外源基因的克隆相区别，达到筛选目的。本发明的荧光筛选克隆载体可用于菌落筛选，特别是自动化菌落筛选仪上的应用。活体荧光成像系统(in vivo bioluminescence imaging)是近年来发展起来的一项分子、基因表达的分析检测系统。它由敏感的CCD及其分析软件和作为报告子的荧光素酶(Iuciferase)以及荧光素(Iuciferin)组成。它有无创伤性、可多次重复在不同时间点检测、快速扫描成像等诸多优点。而GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。目前所有的自动菌落挑取仪， 如Microtec PM-2S型自动菌落挑取仪、CP7200 CP0600自动菌落挑选仪等均以彩色CCD 照相方式作为图像识别方式，适用于蓝白斑筛选类克隆载体，正如前面讲到的，蓝白斑筛选有诸多问题影响着显色结果，造成该种方式无法做出准确的筛选，而采用本发明中构建的 pUC-muEGFP载体完成克隆，菌落在蓝绿色LED光源上可以显现出亮丽的蓝绿色，克隆结果能够得到完美的体现。即空质粒克隆发出亮绿色光，而阳性克隆不发光。
图IGFP —级结构中第65 67位氨基酸残基(Ser-Tyr-Gly)形成的荧光发色基团(方框内)。图2GFP的四级结构。柱状结构中央为带有发色基团的α -螺旋。图3GFP的四级结构。柱状结构中央为带有发色基团的α -螺旋。图4GFP氨基酸序列调整比对结果。第二行为原始序列，第三行为修改后序列。图5PCR得到muEGFP的两个基因片段，第一泳道muEGFP-Ι为化学合成片段，第二泳道muEGFP-2为从pEGFP上P得的片段。第三泳道为DNA marker图6PCR得到muEGFP的全长基因。第一泳道muEGFP，第二泳道为DNA marker图7muEGFP克隆到载体pUC18后，平板生长紫外拍照，亮色为阳性克隆(圆圈内所示)°图8pUC-muEGFP转化，过夜培养，平板上所有菌落均发荧光。图9pUC-muEGFP中插入目的片段后，平板上部分菌落发光(位于上方的框内)；部分菌落不发光(位于下方的方框内)。图10挑取阳性克隆检测，确证8个菌样均为阳性结果。图 11 载体 pUC-muEGFP 结构图。
具体实施例方式以下列举具体实施例以进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。实施例中，转化用大肠杆菌DH5a(推广后不限于IacZ基因缺陷型大肠杆菌) 采用的是氯化钙转化法；所用限制性内切酶、连接酶等均购自i^ermentas，载体pUC57为 Fermentas 产品，pEGFP-Nl 为 BD Biosciences Clonetech 产品。实施例中采用下列设计方案制备荧光筛选克隆载体A.根据SEQ ID NO. 5所示氨基酸序列设计其编码序列绿色荧光蛋白基因的序列设计以pEGFP-Nl中的EGFP为母本，在不改变蛋白高级结构的前提下修改部分碱基，其序列为SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列和SEQ ID NO. 5所示氨基酸序列；B.设计序列的建立、合成使用化学合成方法完成设计序列的合成，根据基因的具体情况用DNA works软件设计引物，并化学合成，合成好的引物溶于水以达到适当的浓度，在第一轮PCR时取引物各Iul混合作为模板，加上下游引物48摄氏度退火获得全长模板；取第一轮PCR产物Iul为模板，加上下游引物55度退火获得足量全长基因序列。使用 overlapPCR方法将得到的EGFP基因片段拼接得到全长序列muEGFP。C.荧光筛选克隆载体的构建用EcoRI/Ndel酶切消化权利要求2中设计并合成的序列muEGFP和载体pUC18，连接克隆，得到pUC_muEGFP实施例1荧光筛选克隆载体的构建与验证构建荧光筛选克隆载体的设计思路和技术路线如下1、增强型绿色荧光蛋白基因的序列设计。载体pEGFP-Nl中的绿色荧光蛋白基因是EGFP，其详细序列为SEQ ID N0. 2，对应的氨基酸序列为SEQ ID N0. 3，结构图见图3。GFP 的晶体结构是由11个β-折叠组成的柱状结构，GFP色基tyg紧密地包被在由β折叠围成的β盒中，它被保护起来以免受周围环境的影响。本发明在不改变其蛋白结构的情况下， 对核酸序列进行了适当的修改，在该修改过程中引入了常用的酶切位点，同时修改了 4个氨基酸，分别是G20V，W9G，A37L，V55G(图4)，修改后核酸序列为SEQ IDN0.4，对应的氨基酸序列为SEQ ID N0. 5。SEQ ID NO. 4序列的前以化学合成方法获得，并在不产生移码的前提下增加了更多的酶切位点，在EGFP序列上游增加了 Ec0RI、)(baI、)(h0I等位点。2、设计序列的建立、合成。用DNA works软件根据基因的具体情况设计引物(寡核苷酸单链)12条，化学方法合成12条单链DNA序列10D，序列为SEQID N0. 6 SEQ IDNO. 17，每个引物加400ul的灭菌水(约6umol/ul)，PCR反应如下第一轮反应体系
SEQ ID N0. 6Iul
SEQ ID NO. 17Iul
dNTPIul(IOmM)
10XPFU Buffer5ul (200mM TrisHCl, ρΗ8· 8 ； IOOmM KCl ；20mM
MgS04 ； 160mM(NH4) 2HS04 ；1% Triton and
lmg/mlBSA)
SEQ ID NO. 6 17 12X0. 2ul
Pfu0. 25(5U/ul)
加水至50ul
(所有试剂均为生工生物产品)
反应参数
980C 3min ；94°C 18sec，48°C 18sec，72°C 25sec，20 个循环；
72°C 延伸 5min
第二轮反应体系
SEQ ID N0. 6Iul
SEQ ID NO. 17Iul
dNTPIul
10XPFU Buffer5ul
第一轮反应产物Iul
Pfu0.25ul
加水至50ul
反应参数
950C 3min ；94°C 19sec，55°C 20sec，72°C 25sec，22 个循环；
72°C 延伸 3min
第二轮反应液琼脂糖凝胶电泳，在大约265bp处可见一条清晰的特异性条带
muEGFP-l(图5)，大小与预期相符，胶回收PCR产物，待用。同时以pEGFP-Nl为模板，用SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 18为上下游引物，PCR得到530bp产物muEGFP-2 (图5)。大小与预期相符，胶回收PCR产物，待用。取以上产物 Iul 和 530bp 产物 Iul，用 SEQ ID NO. 6 和 SEQ ID NO. 18 为引物，PCR获得全长muEGFP序列SEQ ID N0. 19，电泳结果如图6。3、荧光筛选克隆载体的构建。将全长muEGFP序列用EcoRI/Ndel酶切；同时用相同酶消化PUC18，电泳回收MOObp条带，去掉270bp的LacZ序列，连接回收的pUC18大片段和muEGFP，连接产物转化到大肠杆菌E. coli DH5a感受态细胞，LB氨苄抗性平板37°C过夜培养，16小时后，紫外灯下拍照，看到大部分细胞发鲜艳的绿色荧光(图7)，即为阳性克隆。 挑取12个带有鲜艳绿色的菌落，LB氨苄液体培养基37°C过夜培养，小量抽提质粒，酶切验证确有长为740bp左右的muEGFP克隆到了载体上，选择一个阳性克隆。经测序验证，序列结果与设计方案完全一致。命名为pUC-muEGFP
4、空荧光筛选克隆载体的转化验证。将测序完全正确的重组质粒pUC-muEGFP转化，过夜培养。在紫外灯下可以很明显的看到全部菌落均发出鲜艳的绿色荧光，拍照得到图 8，证明构建的荧光筛选克隆载体pUC-muEGFP是可以发出荧光的，基本符合要求。5、插入目的片段验证发光性。以化学方法随机合成一段序列SEQ ID NO. 20，合成过程可参照技术路线2的方法，电泳回收全长为25^p的片段。使用平端克隆方法完成连接克隆；按照以下实验方案克隆到pUC-muEGFP中T4 DNA Ligase Buffer2ul
Yellow Buffer2ul
PEG4000Iul
pUC-muEGFP2ul
PCR产物4ul
T4DNA LigaseIul
SmaIIul
加水至20ul
(所有试剂均为生工生物产口 、 BFI )
22°C连接1小时，转化，LB平板上37°C过夜培养。
将平板在紫外灯下拍照，查i孴，明显可以看到有大部分菌落无法呈现出亮绿色，而
少部分菌落发出亮绿色的光(在488nm蓝绿光下，颜色差别更显著)，详情请见图9。6、插入片段阳性克隆检测。挑取8个不发光的菌样，过夜培养并抽提出质粒。用基因片段特异性引物PCR，电泳均可以查看到长度为的条带(图10)。7、荧光筛选克隆载体的应用。从上述例子中可以有力的证明完全可以使用EGFP 作为一种新型的阳性克隆筛选标记。
权利要求
1.一种荧光筛选克隆载体，以编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸和/或其互补链为其阳性克隆筛选标记，所述增强型绿色荧光蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 5。
2.如权利要求1所述荧光筛选克隆载体，其特征在于，所述编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸的序列为SEQ ID NO. 4。
3.如权利要求1所述荧光筛选克隆载体，其特征在于，所述荧光筛选克隆载体为将所述编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸和其互补链克隆入PUC18的EcoRI和NdeI位点之间获得。
4.如权利要求1所述荧光筛选克隆载体，其特征在于，所述荧光筛选克隆载体的多核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。
5.一种荧光筛选克隆载体的制备方法，为将编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸和/ 或其互补链克隆入载体后获得所述荧光筛选克隆载体，所述增强型绿色荧光蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO. 5。
6.如权利要求5所述荧光筛选克隆载体的制备方法，其特征在于，所述编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸序列为SEQ ID NO. 4。
7.如权利要求5所述荧光筛选克隆载体的制备方法，为将编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸和其互补链克隆入载体PUC18的EcoRI和NdeI位点之间后获得所述荧光筛选克隆载体。
8.如权利要求7所述荧光筛选克隆载体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤A.通过合成引物及overlapPCR方法获得两端带有EcoRI和NdeI酶切位点的全长 muEGFP基因，所述全长muEGFP基因的编码序列如SEQ ID NO. 4所示；B.用EcoRI和NdeI酶切消化步骤A获得的全长muEGFP基因和载体pUC18，将消化片段连接后得到荧光筛选克隆载体。
9.如权利要求1-4任一权利要求所述荧光筛选克隆载体用于菌落筛选的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，将所述荧光筛选克隆载体用于自动化菌落筛选仪。
全文摘要
本发明涉及分子生物学和微生物学领域，公开了一种荧光筛选载体及其构建与应用，本发明的荧光筛选载体，以编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸和/或其互补链为其阳性克隆筛选标记，所述增强型绿色荧光蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.5。本发明的载体能够广泛应用于基因克隆中阳性克隆的筛选。
文档编号C07K14/00GK102181465SQ20101059237
公开日2011年9月14日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者孔凡静, 王素莲, 王绪慧 申请人:生工生物工程(上海)有限公司