专利名称：斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆和重 组应用。
背景技术：
BAFF具有很强的B细胞趋化性，在体外作为B细胞增殖和分化的共刺激因子，能 诱导活化的B细胞分泌大量的IgG、IgA、IgM等。对于休眠B细胞，BAFF虽不能独立激活使 之进入细胞周期循环，但通过上调细胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、BcI-Xl的表达，可延长休 眠B细胞的寿命。在体内，它可以促进脾脏内Tl-B细胞向T2-B细胞以及成熟B细胞的发 育。BAFF的正常表达是GC形成、抗体亲和力成熟、记忆性B细胞形成及B细胞正常发育的 必须条件BAFF+小鼠的次级淋巴器官囊外及过渡区B细胞完全缺失，而BAFF转基因小鼠则 由于B220+细胞数目剧增而引起脾脏、淋巴结、派尔斑(Peyer’ s patch)肿大，血清中IgM、 IgG、IgA、IgE滴度上升，8周后出现与典型SLE(系统性红斑狼疮)相似的症状。最近的研 究显示BAFF还具有调节B细胞分化的作用。BAFF在体外能促进B系淋巴瘤的增殖，并抑制 FasL-Fc和TACI-Fc的促凋亡作用，提示其还可能具有抑制细胞凋亡的作用。由于T细胞表面表达BAFF特异性受体BAFF-R，且用抗BAFF-R的单克隆抗体 能阻断BAFF对T细胞的增殖效应，因此推测BAFF通过BAFF-R对T细胞的激活和分化起共 调节作用。有专家认为，BAFF是B细胞存活的关键因子，犹如针对B细胞的一个精妙的安检 站。过度表达BAFF可以减少B细胞的耐受性，产生免疫反应。目前临床实验得到的结果证 明了 BAFF在类风湿性关节炎(RA)发病中的病理学角色。研究发现，存在于骨髓中的B细 胞的发育和选择不依赖于BAFFJfii B细胞离开骨髓，便成为外周B细胞存活和成熟以及 T、B细胞激活的主要细胞因子。BAFF不仅是B细胞的存活因子，还对T细胞激活有共刺激作用。最新研究表明， BAFF的表达水平与感染和炎症反应密切相关。T、B细胞在自身免疫疾病中起到了重要作用，而BAFF主要表达在单核细胞、巨 噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和活化的T细胞表面，分泌细胞因子、生长因子和各种介 质，使B细胞活化为浆细胞，分泌大量免疫球蛋白，包括自身抗体，使机体出现炎性反应和 破坏。BAFF是B细胞活化的正调节蛋白。通过实验研究发现，与正常对照组比较，RA患 者的BAFF血清水平明显增高，B细胞活化的标记物可溶性⑶23 (s⑶23)同样有明显升高， 但二者相比无相关性。进一步研究发现，BAFF与RF具有相关性，表明BAFF在RA中作用是 诱导自身抗体的产生，而不是B细胞的活化。干燥综合征中BAFF及其受体在唾液腺局部表达的作用，进一步研究表明这些细 胞因子具有活性，可以延长正常B细胞的存活。在SS中，BAFF的表达不仅来源于上皮细胞 和T细胞，还来自于B细胞，通过自分泌发挥免疫作用各种研究表明，许多恶性B系肿瘤异常表达BAFF和APRIL，并且这些肿瘤细胞表面 表达一种或多种BAFF与APRIL受体。人们也研究了“诱饵受体”BCMA-Fc、TACI_Fc及BAFF 的单克隆抗体对这些B系肿瘤抑制的影响，发现这些抗体及抗体类似物均能恢复这些肿瘤 细胞的凋亡作用。BAFF/APRIL配体-受体系统极有可能成为对抗多种恶性肿瘤的分子靶点库。根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前已 知BAFF基因序列的鱼类包括虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点绿河豚；APRIL基因序列包括虹 鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点叉尾鮰，并分别已在GenBank数据库中申请了序列号，序列号分别 是 ABC84582、NP_001135232, SINFRUP00000153079、EF451543、DY736744、CB940845。斑马 鱼B淋巴细胞刺激因子(zBAFF) cDNA还未被克隆出来，关于斑马鱼BAFF基因的研究在整 个国内外还处于完全空白状态。斑马鱼(Zfeflio rerio)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼，属于辐鳍亚纲 (Actinopterygii)鲤科iPyprinidae)短担尼鱼属(JMnio)的一种硬骨鱼。原产自印度东 部、巴基斯坦、缅甸、孟加拉国等南亚地区，是一种常见的热带鱼。斑马鱼是国际标准化组织 认可的5种鱼类实验动物之一，已经成为发育生物学、遗传学、毒理学等研究常用的模式生 物。60年代末70年代初，Mreisinger首先对这种生物进行了单倍体培育，建立了第 一个用紫外线突变的突变体。随着纯合子培养技术的成熟和广泛高效的突变剂ENU的出 现，位于TUbingen和Boston等地的几个实验室自1993年开始对斑马鱼进行ENU大规模系 统突变筛选和建库工作。1994年，在冷泉港召开的斑马鱼研究专题会议，标志着斑马鱼已成 为继小鼠，果蝇，线虫后又一生物学研究的重要模式生物。虽然斑马鱼最初主要被用来进行遗传学及发育生物学研究，但近几年，随着 对斑马鱼了解的日趋深入，其在免疫学中的应用也越来越为人们所重视。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种从斑马鱼提取的B淋巴细胞刺激因子 cDNA，并提供斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法及重组应用。本发明从斑马鱼中克隆到B淋巴细胞刺激因子cDNA，它具有SEQ ID NO. 1所示的 序列。斑马鱼B淋巴细胞刺激因子，它具有SEQ ID NO. 2所示的序列。本发明的斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法如下
(1)从斑马鱼脾脏组织总RNA
(2)利用RT-PCR方法通过同源克隆(homologycloning)策略并结合cDNA末端快速扩 增法(RACE)克隆斑马鱼全长BAFF的cDNA序列。上述斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法具体操作如下
(1)利用Trizol试剂一步法提取斑马鱼脾脏组织总RNA
(2)通过Clustalw软件分析虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点绿河豚BAFF cDNA保守区， 设计兼并引物
zBAFF1 5'-TTGTNCCNTGGCTTCTNAGCTTTAA-3' ； (SEQ ID N0. 3)zBAFF2 5' -GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3' (SEQ ID NO. 4) (3)进行PCR扩增，得到807bp的片段，如SEQ ID NO. 1所示。通过CLUSTAL软件分析，比对斑马鱼与虹鳟鱼、大西洋鲑鱼、斑点绿河豚的BAFF氨 基酸序列(Genbank ABC84582, NP_001135232, EN: SINFRUP00000153079)结果如图 3所示， 它们的同源性分别为67. 6，61. 4和66. 9%，并且可溶部分比跨膜区和胞内区在进化上更保 守。其开放阅读框如SEQ ID NO. 1所示。上述斑马鱼B淋巴细胞刺激因子(zBAFF)的cDNA的重组应用，通过现有基因工程 方法，生产重组zBAFF。具有绿色荧光活性的重组蛋白，其可溶性、稳定性及生物学活性达到 了预期的良好效果，为进一步进行相关的研究提供了生物工程工具的前体。
图1 zBAFF (GenBank NO. FJ587513)的cDNA序列及对应的蛋白序列
图2保守氨基酸用黑色阴影标注，跨膜区域用虚线标注，(★)为三个保守的Cys残基， 箭头所指为N-糖基化位点，双线标注部位为Flap环，划线部分为胞外可溶区。图3是EGFP和EGFP-zsBAFF的荧光光谱测定。图4是zsBAFF空间结构预测模型(aa 116-268) hsBAFF空间结构模型比较(aa 134-285) 0 (a)和(b)表示zsBAFF3D结构的卡通示意模型和空间填满模型，(c)和(d)表 示hsBAFF 3D结构的卡通模型和空间填满模型。图5是SDS-PAGE分析EGFP_zsBAFF在大肠杆菌中的表达1重组蛋白非诱导；2 重组蛋白诱导20h ；3纯化后蛋白EGFP-zsBAFF ；4 western blotting图。图6是EGFP-zsBAFF对小鼠淋巴细胞的促存活作用。图7是EGFP-zsBAFF与小鼠淋巴细胞结合的激光共聚焦检测结果。(a)和(d)为 透射光(相位差)。(b)和(e)为(a)和(d)在488nm激发下的EGFP荧光(绿色)。(c) 和(f)为a/b or d/e两图的合并。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。实施例1
斑马鱼购自南京大学模式动物遗传中心
(1)引物设计通过Clustal W软件分析虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点绿河豚BAFF cDNA 保守区，设计兼并引物 zBAFFl 5' -TTGTNCCNTGGCTTCTNAGCTTTAA-3' ；zBAFF2 5' -GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3'。(2)提取总RNA 应用RNA抽提试剂TRIzol (Invitrogen公司)按照其操作手册 提取斑马鱼脾脏细胞的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。(3)RT-PCR 以上述zBAFFl及zBAFF2为弓|物进行PCR扩增，得到807bp的片段Pl。①逆转录
在DEPC处理的1. 5ml Eppendorf管中依次加入总RNA抽提物3 μ 1，Oligo d(T)18 1μ 1， 10mmol/L dNTP 2 μ 1，DEPC水5 μ 1置于；65 ° C，15min后立即冰浴5min ；再在上述体系 中加入 5 X RT 反应缓冲液 4 μ 1，RNase inhibitor 0· 5 μ 1 (20u)，AMV 反转录酶 2 μ 1，DEPC 水2. 5μ1至总体积为20μ1的反应液，于42 ° C反应1.5h，94 ° C，IOmin终止反应，置 于冰上； ②PCR
利用逆转录所得模板进行PCR，体系为5 O μ 1，10 μ mo 1 /L上、下游引物各2. 5 μ 1， 2. 5mmol/L dNTP 4 μ 1，25mmol/L MgCl2 3 μ 1，IOX 缓冲液 5 μ 1，cDNA 模板 5 μ 1，rTaq 酶 IylJnddH2O 27 μ I0 反应程序为94 ° C 5min，94 ° C 30s, 56 ° C 30s,72° C lmin, 30个循环，最后72 ° C孵育5min。反应完成后将产物于1%琼脂糖凝胶中电泳分离，用胶回收试剂盒回收得到约 340bp的DNA条带，克隆入pMDIS-T载体，经含Amp抗生素(50mg/ml)的琼脂糖平板筛选转 化子，挑出阳性克隆送往上海英骏测序公司进行碱基序列测定。(4)同源检索将所得序列Pl通过CLUSTAL软件分析，比对斑马鱼与虹鳟 鱼、大西洋鲑鱼、斑点绿河豚的BAFF氨基酸序列(Genbank ABC84582, NP_001135232, EN:SINFRUP00000153079)结果如图2所示，它们的同源性分别为67. 6，61. 4和66. 9%，并 且可溶部分比跨膜区和胞内区在进化上更保守。实施例2
斑马鱼BAFF重组表达载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达 根据已知的zsBAFF序列和EGFP序列为模板分别设计引物Al、A2和A3、A4。其中Al 的5’端具有I酶切位点，A4的5’端具有Λ /7 /ΙΙΙ酶切位点，而Α2和A3含有在EGFP 和 zsBAFF之间编码(GlyJer)2 linker 的碱基序列。通过over-lap PCR扩增 EGFP-zsBAFF 基因片段。两轮PCR后，将PCR产物割胶回收及pET-28a载体分别用B_H I和Hind III酶 切，T4 DNA Ligase连接，连接产物转化五coh'DH5a中，获得含pET28a-EGFP-zsBAFF重组 菌株。挑选阳性重组菌株，扩大培养提取pET28a-EGFP-ZSBAFF重组质粒，转化到大肠杆菌 BL2KDE3)中，挑选阳性菌株诱导表达。引物序列如下 Al CGCGGATCCATGGTGAGCAAG (SEQ ID N0. 5)
A2 GCTGCCACCTCCACCGCTACCGCCGCCTCCCTTGTACAGCTC(SEQ ID N0. 6) A3 GGTGGAGGTGGCAGCAGCTTGAGTCATGCGCCAAAC(SEQ ID N0. 7) A4: CCCAAGCTTTCAGGCCAGTTTTATTGCTCCTA(SEQ ID NO. 8)
(其中Al含有及^/7 I酶切位点，A4含有Λ /^ΙΙΙ酶切位点；A2、A3含有编码一个linker (Gly4Ser)2的基因序列)
经SDS-PAGE检测(图5)显示，在大约50 kDa处为目的蛋白，经IPTG诱导20 h达到
最大表达量。重组目的蛋白的Ni+亲和纯化
IPTG低温诱导含有重组载体pET28a-EGFP-ZSBAFF的大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)24小时后，4°C收菌，冰上超声破碎(160W，工作4s，暂停8s，共99次)表达菌体，4°C，13， 000Xg，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+-NTA柱。简要过程是3体积 Binding Buffer平衡Ni+-NTA柱后，手动上样含可溶性重组蛋白的上清，先后用10倍体积 的Binding buffer和 6倍体积的Washing buffer(20 mmol/L Imidazole, 0· 5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris HCl，pH 7. 9)洗去杂蛋白，最后用 Elute buffer (1 mol/L Imidazole，0. 5 mol/L NaCl，20 mmol/L TrisHCl, pH 7.9)洗脱目的蛋白，分管收集，PBS 除盐。SDS-PAGE 检测各收集管蛋白纯度和紫外分光光度计测定蛋白浓度。如图5 (条带3)所示，表达得到 的目的蛋白经Ni+柱亲和纯化得到纯度达95%的活性目的蛋白。zsBAFF空间结构预测
如图4所示，zsBAFF空间结构预测模型和hsBAFF空间结构模型比较，由此看出，其空 间结构与人BAFF已知结构非常相似。Western 印记分析
Western-blot中所用一抗为鼠抗Hk6单抗，二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG。 其简要步骤是将样品先进行SGS-PAGE，然后以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维素膜 (NC膜)上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5%脱脂奶粉室温封闭lh，与一 抗孵育lh，与HRP标记的二抗IgG孵育lh，每步完成后均严格洗膜，最后加TMB避光显色。 结果如图5 (条带4)所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。实施例3 受体结合特性
BAFF可以与其三个受体结合，它们分别是TACI，BCMA和BAFF-R。TACI 表达与B细胞和激活的T细胞表面，而BCMA和BAFF-R则大部分或绝对表达与B细胞 表面。在这里EGFP-zsBAFF的结合特性我们用激光共聚焦显微镜来检测。通过激光共聚焦 显微镜我们可以看到EGFP-zsBAFF可以结合与小鼠的淋巴细胞表面，而对照EGFP没有结合 特性(图7)。 EGFP-zsBAFF对小鼠淋巴细胞促存活作用
在体外通过MTT细胞毒试验检测EGFP-zsBAFF对小鼠淋巴细胞的促存活作用，如图6 所示，PBS为空白对照，12 μ g/ml EGFP-zsBAFF、12 μ g/ml EGFP+anti_IgM、5 μ g/ml EGFP和 anti-IgM 培养细胞为阴性对照，6 μ g/ml zsBAFF+ anti-IgM 和 2 μ g/ml hsBAFF+anti-IgM 为阳性对照。结果表明本实验克隆得到的EGFP-zsBAFF对小鼠淋巴细胞都具有明显的促存 活效应，且呈现剂量依赖效应。实施例4
将实施例1获得的斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，转入动物 体内，增加其免疫力，在饲养中应用。按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰斑马鱼B淋巴细胞刺激因子 基因并用于所述研究和生产。
权利要求
1.斑马鱼B淋巴细胞刺激因子CDNA，其特征在于，具有SEQID NO. 1所示的序列。
2.—种权利要求1所述的斑马鱼B淋巴细胞刺激因子的克隆方法，其特征在于包括如 下步骤(1)TRIzol法提取斑马鱼脾脏总RNA，(2)根据B淋巴细胞刺激因子的保守序列设计兼并引物 正义寡核苷酸引物 zBAFFl :5，-ATGCCTGCTGAAGATGTTGGTCC-3，， 反义寡核苷酸引物 zBAFF2 :5，- TCAGGCCAGTTTTATTGCTCC-3，，(3)通过RT-PCR方法，以上述引物dBAFFl及dBAFF2为引物，扩增出斑马鱼全长BAFF 的cDNA序列。
3.一种权利要求1所述的斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA的重组应用，是通过现有基 因工程方法，生产重组斑马鱼B淋巴细胞刺激因子，作为斑马鱼类免疫增强剂。
4.斑马鱼B淋巴细胞刺激因子，其特征在于，具有SEQID NO. 2所示的序列。
全文摘要
斑马鱼B淋巴细胞刺激因子(zBAFF)cDNA及其克隆方法和重组应用，涉及生物基因工程领域。斑马鱼B淋巴细胞刺激因子基因的克隆方法如下TRIzol法提取斑马鱼脾脏总RNA并进行逆转录；通过Clustalw软件分析虹鳟鱼,大西洋鲑鱼,斑点绿河豚BAFFcDNA以及虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点叉尾鮰BAFFcDNA保守区设计兼并引物进行PCR扩增，获得807bp全长cDNA。所述斑马鱼B淋巴细胞刺激因子和增殖诱导配体cDNA可通过现有基因工程方法，生产重组斑马鱼的BAFF。
文档编号C07K14/52GK102115748SQ20101059839
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者张双全, 梁臻宁, 闵翠 申请人:南京师范大学