专利名称：以免疫活性肽为载体的分支多肽及其衍生物与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以免疫活性肽为载体的分支多肽及其衍生物与应用，特别是涉及一种具有流感病毒免疫原性的分支多肽。
背景技术：
RNA病毒的高变异能力对生产针对这类病毒感染的疫苗是极大的挑战，这些病毒主要包括流感病毒、HIV和HCV等。由不同型别流感病毒引起的流感大流行时刻威胁着全球，而现有流感疫苗的保护效果受到疫苗毒株与实际流行株的匹配程度的制约。所以为了研制对甲型流感病毒各种亚型或突变株都有效的通用疫苗，人们将目光投向了流感病毒较为保守的核蛋白(NP)和基质蛋白 2(M2) (GS Jimenez, R Planchon, Q Wei，HumVaccin, 3(5) :157-64,2007 ；M Schotsaert, M De Filette, W Fiers, Expert RevVaccines,8(4) 499-508,2009)。抗病毒疫苗的保护效果除了与针对的病毒蛋白有关，还与疫苗的类型有关。合成肽疫苗，尤其是筛选病毒的抗原表位并采用人工合成方法制成的表位肽疫苗具有很多优点可避免不利于免疫应答的表位而选择有利于免疫应答的表位，在保持抗原特异性的基础上诱导免疫应答；可用化学合成的方法制备，研发时间短、工艺简单并且制备过程安全， 获得病毒抗原序列信息后可很快完成制备过程，因此适宜应对新发、突发传染病。但抗原表位多是短肽，分子量小，抗原性和免疫原性都很弱，必须进行加工改造才能发挥疫苗的作用。
发明内容
本发明提供了一种分支多肽及其衍生物与应用，目的之一是提供一种免疫原性高的分支多肽。本发明所提供的分支多肽自氨基端到羧基端的结构式为(AAn)4-(Lys)2-Lys-Thr-Lys-Pr0-Arg,上述分支多肽的羧基端序列 Thr-Lys-Pro-Arg为免疫活性肽Tuftsin。所述AAn为甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区。 将上述分支多肽命名为分支状(iCe)4-TuftSin。其中，所述甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区自氨基端到羧基端的序列为Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-C ys-Asn—Asp-Ser—Ser—Asp。可在所述的分支多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、 羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化，得到所述分支多肽衍生物。所述的分支多肽可以与酸或碱反应形成药学上可接受的盐类化合物。对本发明的分支多肽可进行等同变化获得如下的分支多肽(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 8_ (Lys) 4_ (Lys) 2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg ；
(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 2~Ly s-Thr-Ly s-Pro-Arg ο本发明的另一个目的是提供所述分支多肽及其衍生物的应用。所述分支多肽及其衍生物可制备成流感疫苗。所述的流感疫苗，其活性物质为所述的分支多肽或所述分支多肽的衍生物。所述流感疫苗中还含有佐剂，佐剂能够增强对疫苗组分抗原特异性免疫应答或改变免疫反应。佐剂可以选用多种，如Al (OH)3佐剂。上述流感疫苗为甲型流感病毒疫苗。所述甲型流感病毒包括Hmi流感病毒、H2N2流感病毒、H3N2流感病毒、H5W流感病毒、H7N7流感病毒和H9N2流感病毒等。本发明的分支多肽能与M2多克隆抗体特异性结合，能与巨噬细胞特异结合，提高了抗原呈递细胞的工作效率。本发明的分支多肽制备的疫苗诱导动物的免疫应答效率高，并能保护动物免受病毒感染。本发明的具体实施方式
由以下实施例及其附图详细给出。
图1为分支状(iCe)4-TuftSin结构示意图。图2为分支状(iCe)4_Tuftsin HPLC分析结果。图3为分支状(Mk) 4-Tuftsin质谱分析结果。图4为分支状(Mk)4-Tuftsin SDS-PAGE分析结果，图中1代表分支状 (M2e) 4-Tuftsin ；2 代表分支状(M2e)4-G40图5为分支状(Mk) 4-Tuftsin Western-blot检测结果，图中1为分支状 (M2e) 4-Tuftsin ；2 为分支状(M2e)4-G40图6为ELISA检测免疫小鼠血清中Mk抗体效价。图7为ELISpot检测免疫小鼠脾细胞的结果。图8为流感病毒攻击后不同免疫组小鼠存活率。图9为分支状(iCe)8_Tuftsin结构示意图.图10为ELISA检测分支状(Mk) 8-Tuftsin抗原性结果。图11为FITC标记分支状(iCe)8_Tuftsin与巨噬细胞结合结果0OOX)。图12为实施例2ELISA检测小鼠血清Mk抗体效价。图13为实施例2ELISpot实验结果。图14为实施例2小鼠肺病毒载量的检测结果。
具体实施例方式实施例11)合成分支状多肽使用多肽合成仪，采取固相合成法合成图1所示的四分支多肽(Mk)4-Tuftsin， 该分支状多肽从N端到C端的结构式为(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 4- (Lys) 2-Lys-Thr-LyS-Pro-Arg0对上述合成的分支状多肽进行高效液相和质谱分析，以及SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳和ffestern-blot分析。图2至图5所示结果表明，多肽合成仪合成的多肽为我们所设计的分支状多肽，将其命名为分支状(M&)4-TUftSin，其分子量为11312Da。2)分支状多肽的抗原性鉴定采用ELISA的方法测定分支状(Mk) 4-Tuftsin与M2多克隆抗体特异性识别和结合的能力，具体方法如下将浓度0. 0625 μ g、0. 125 μ g、0. 25 μ g、0. 5 μ g 禾口 1 μ g 的分支状(M2e) 4-Tuftsin 分别包被到ELISA板的孔内，以大肠杆菌表达的重组禽流感病毒M2蛋白作为阳性对照。以小鼠抗M2多克隆抗体作为一抗，二抗为碱性磷酸酶标记羊抗小鼠免疫球蛋白IgG抗体。ELISA结果显示示，分支状(Mk) 4-Tuftsin能与抗M2多克隆抗体特异性识别和结合，当分支状(Mk) 4-Tuftsin包被量在0. 0625 μ g/孔至0. 25 μ g/孔范围时，吸光度值与其成正比；而分支状(Mk) 4-Tuftsin量在0. 25 μ g/孔至1 μ g/孔时，吸光度值达到平台期。说明分支状(M&)4-TUftSin具有甲型流感病毒M2抗原活性。3)分支状多肽与巨噬细胞结合试验使用多肽合成仪，采取固相合成法合成对照分支肽(Mk) 4-G4，用四个甘氨酸取代了 Tuftsin。分支肽(M2e)4-G4 从 N 端到 C 端的结构式为(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Th r-Pro-IIe-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 4- (Lys) 2-Lys-Gly -Gly-Gly-Gly0测定荧光素FITC标记的分支状(iCe)4-TuftSin与巨噬细胞结合的能力，以荧光素FITC标记的分支肽(Mk) 4-G4作为对照，具体方法如下取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞，在96孔板1640培养液中37°C 5% CO2培养7h，每孔2 X 106/1个腹腔巨噬细胞，弃去上层悬浮细胞，再将贴壁的巨噬细胞置4°C培养40分钟。将上述96孔板分成两组，每组48孔。其中一组每孔加入FITC标记的分支状(]\Ce) 4-Tuftsin，分支状(]\Ce) 4-Tuftsin 的终浓度为0.5ymol/L;另一组每孔加入FITC标记的分支肽(Mk)4-G4，分支状 (M2e) 4-G4的终浓度为0. 5 μ mol/L,混勻，4°C培养20分钟。然后用1640培养液分别洗涤细胞2次，将洗涤后的细胞置于奥林巴斯1X-51FL荧光显微镜下观察。荧光显微镜下观察结果为，FITC标记的分支状(Mk) 4-Tuftsin与小鼠腹腔巨噬细胞共同孵育后在紫外光下的图像，可观察到细胞表面有绿色荧光，说明FITC标记的分支状(iCe) 4-Tuftsin能与巨噬细胞表面Tuftsin受体结合；FITC标记的分支肽(iCe)4_G4与小鼠腹腔巨噬细胞共同孵育在紫外光下的图像，细胞表面未见绿色荧光，说明对照分支肽 (M2e)4-G4不能与巨噬细胞结合。上述的实验说明分支状(Mk) 4-Tuftsin能与巨噬细胞结合，证实了 Tuftsin的活性。4)用分支状多肽免疫小鼠将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为四组PBS组、ICe单体组、(M2e) 4-Tuftsin组和(M2e)4-G4组，每组16只BALB/c小鼠。PBS组为在小鼠两条后腿内侧肌肉各注射10 μ 1的PBS与Al (OH) 3佐剂的混合物， PBS与Al (OH) 3佐剂的混合物中PBS与Al (OH) 3佐剂的体积比为1 1。M2e单体组为在小鼠两条后腿内侧肌肉各注射10 μ 1的Mk单体与Al (OH) 3佐剂混合制备的流感疫苗，流感疫苗中M2e单体的浓度为5ug/10ul。每只小鼠的M2e单体注射总量为IOug/Ko(M2e) 4-Tuftsin组为在小鼠两条后腿内侧肌肉各注射10 μ 1的分支状 (M2e) 4-Tuftsin与Al (OH) 3佐剂混合制备的流感疫苗，流感疫苗中分支状(Mk) 4-Tuftsin 的浓度为5ug/10ul。每只小鼠的分支状(MkM-Tuftsin注射总量为10 μ g/只。(M2e)4-G4组为在小鼠两条后腿内侧肌肉各注射10 μ 1的分支肽(Mk) 4-G4与 Al (OH) 3佐剂的混合物，分支肽(Mk) 4-G4与Al (OH) 3佐剂的混合物中分支肽(Mk) 4-G4的浓度为5ug/10ul。每只小鼠的分支肽(Mk)4-G4注射总量为IOyg/只。各组小鼠均免疫两次，每次免疫间隔两周。A)每次免疫后的第14天分别从小鼠眼眶后静脉采血，分别离心取血清，-20°C保存，用于血清中抗似e抗体滴度检测。采用ELISA方法检测不同免疫组小鼠每次免疫后第14天血清中抗M2e抗体滴度。ELISA结果如图6所示，第一次免疫后第14天(图6中以第一次免疫后表示) M2e单体组、分支状(iCe) 4-Tuftsin组和分支肽(Mk) 4-G4组的血清中抗体效价分别为 3、860和180 ；第二次免疫后第14天(图6中以第二次免疫后表示单体组、分支状 (iCe) 4-Tuftsin组和分支肽(iCe) 4-G4组的血清中抗体效价分别为4J4800和11940 ；PBS 组两次免疫后的抗体效价均为零。上述的结果说明，M2e单体组、分支状(iCe)4-Tuftsin组和分支肽(iCe)4_G4组都能诱导小鼠产生抗Mk抗体，分支状(Mk) 4-Tuftsin组和分支肽(iCe) 4-G4组与Mk单体组的抗体滴度相比都有显著性差异(P < 0. 05)。而分支状(MkM-Tuftsin组比分支状 (M2e)4-G4组诱导产生的抗Mk抗体水平更高，它们之间抗体滴度相比也有显著性差异(P < 0. 05)。B)第二次免疫后12天，每组各取4只小鼠处死取脾脏，分离脾淋巴细胞，用于 ELISP0T 试验。采用ELISP0T方法检测用Mk多肽刺激脾淋巴细胞后能分泌IFN-Y的细胞数量， 间接反映免疫后小鼠Thl细胞的特异性反应功能。ELISP0T 使用 BD 公司 ELISP0T 试剂盒。ELISP0T检测结果如图7所示，PBS组小鼠脾淋巴细胞中平均每1 X IO6细胞产生6 个斑点，ICe单体组小鼠脾淋巴细胞中平均每IX IO6细胞产生46个斑点，(Mk) 4-Tuftsin 组小鼠脾淋巴细胞中平均每IX IO6细胞产生2M个斑点，(Mk) 4-G4组小鼠脾淋巴细胞中平均每IX IO6细胞产生156个斑点。上述结果说明分支状(Mk) 4-Tuftsin、(Mk) 4_G4和单体Mk均能诱导小鼠产生特异性细胞免疫，分支状Mk组产生的斑点数目与单体Mk组产生的斑点数目有显著性差异(P < 0. 05)，而对照分支肽(Mk) 4-G4诱导产生斑点数目要明显低于含Tuftsin的分支肽免疫组。
C)第二次免疫后14天，用流感病毒PR8株攻击每组剩余的小鼠，流感病毒攻击方法如下用CO2吸入法将小鼠麻醉，然后迅速在其两侧鼻孔滴入10个LD5tl的流感病毒PR8 株病毒液，使其充分吸入。攻毒后第5天，每组各取2只小鼠处死取肺，称重，制备肺组织悬液，连续稀释后接种MDCK细胞，测定流感病毒滴度(TCID5tl)。肺病毒载量测定结果显示，PBS组IgTCID5tl为 7. 21，]\Ce 单体组 Ig TCID5。为 6. 32，(]\Ce) 4-Tuftsin 组 Ig TCID5。为 5. 63，(]\Ce) 4-G4 组 Ig TCID50为5. 9，这个结果说明病毒在三个M2e免疫组小鼠体内的复制受到有效的抑制，而含 Tuftsin的分支肽免疫组小鼠肺病毒载量最低，与PBS组相比具有显著性差异(P < 0. 05)。攻毒后每日观察各组小鼠的存活情况，至攻毒后14天统计存活率，攻毒M小时内死亡的小鼠视为意外死亡。小鼠存活状况统计结果如图8所示，接种PBS的小鼠攻毒后有9只死亡，接种Mk 单体的小鼠有7只死亡，接种分支状(Mk) 4-Tuftsin的小鼠只有2只死亡，接种(Mk) 4-G4 的小鼠除1只意外死亡外，另有5只死亡，说明这两种分支肽免疫对小鼠均具有保护作用， 而含Tuftsin的分支肽免疫组的保护效果最好。实施例21)合成分支状多肽使用多肽合成仪，采取固相合成法合成图9所示的八分支多肽(Mk)S-Tuftsin, 该分支状多肽从N端到C端的结构式为(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Ar g-Asn-Glu-Trp-Gly-Cy s-Arg-Cy s-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 8- (Lys) 4- (Lys) 2-Lys-Thr-Lys-Pro—Arg。对上述合成的分支状多肽进行高效液相色谱和质谱分析。分析结果表明，多肽合成仪合成的多肽为我们所设计的分支状多肽，将其命名为分支状0\Ce)8-Tuftsin，其分子量为22251Da。2)分支状多肽的抗原性鉴定采用ELISA的方法测定分支状(Mk) 8-Tuftsin与M2多克隆抗体特异性识别和结合的能力，具体方法如下将浓度0. 0625 μ g、0. 125 μ g、0. 25 μ g、0. 5 μ g 禾口 1 μ g 的分支状(M2e) 8-Tuftsin 分别包被到ELISA板的孔内，以大肠杆菌表达的重组禽流感病毒M2蛋白作为阳性对照。以小鼠抗M2多克隆抗体作为一抗，二抗为碱性磷酸酶标记羊抗小鼠免疫球蛋白IgG抗体。ELISA结果如图10所示，分支状(Mk) 8-Tuftsin能与抗M2多克隆抗体特异性识别和结合，当分支状(M2e) 8-Tuftsin包被量在0. 0625 μ g/孔至0. 25 μ g/孔范围时，吸光度值与其成正比，而分支状(Mk) 8-Tuftsin量在0. 25 μ g/孔至1 μ g/孔时，吸光度值达到平台期。说明分支状(Mk)S-Tuftsin具有甲型流感病毒M2抗原活性。3)分支状多肽与巨噬细胞结合试验使用多肽合成仪，采取固相合成法合成对照分支肽(Mk) 8-G4，用四个甘氨酸取代了 Tuftsin。分支肽(M2e)8-G4 从 N 端到 C 端的结构式为(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Th r-Pro-IIe-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 8- (Lys) 4- (Lys) 2-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly0
测定荧光素FITC标记的分支状(Mk)S-Tuftsin巨噬细胞结合的能力，以荧光素 FITC标记的分支肽(Mk) 8-G4作为对照，具体方法如下取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞，在96孔板1640培养液中37°C 5% CO2培养几，每孔 2XlOVml个腹腔巨噬细胞，弃去上层悬浮细胞，再将贴壁的巨噬细胞置4°C培养40分钟。将上述96孔板分成两组，每组48孔。其中一组每孔加入FITC标记的分支状(iCe)8_Tuftsin，分支状(iCe) 8-Tuftsin 的终浓度为0.5ymol/L;另一组每孔加入FITC标记的分支肽(Mk)8-G4，分支状 (M2e) 8-G4的终浓度为0. 5 μ mol/L,混勻，4°C培养20分钟。然后用1640培养液分别洗涤细胞2次，将洗涤后的细胞置于奥林巴斯1X-51FL荧光显微镜下观察。荧光显微镜下观察结果如图11所示图IlA为FITC标记的分支状(Mk)S-Tuftsin 与小鼠腹腔巨噬细胞共同孵育后可见光下的图像；图IlB为FITC标记的分支状 (Mk)S-Tuftsin与小鼠腹腔巨噬细胞共同孵育后在紫外光下的图像，可观察到细胞表面有绿色荧光，图IlA和图IlB的结果说明FITC标记的分支状(Mk)S-Tuftsin能与巨噬细胞表面Tuftsin受体结合；图IlC为FITC标记的分支肽(Mk) 8-G4与小鼠腹腔巨噬细胞共同孵育可见光下的图像；图IlD为FITC标记的分支肽(Mk)8-G4与小鼠腹腔巨噬细胞共同孵育在紫外光下的图像，细胞表面未见绿色荧光，图IlC和图IlD的结果说明分支肽(Mk)8-G4 不能与巨噬细胞结合。上述的实验说明分支状(iCe)8-TuftSin能与巨噬细胞结合，证实了 Tuftsin的活性。4)用分支状多肽免疫小鼠将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为三组PBS组、(iCe) 8-Tuftsin组和(iCe) 8_G4 组，每组20只BALB/c小鼠。PBS组为在小鼠两条后腿内侧皮下各注射30 μ 1的PBS与不完全福氏佐剂的混合物，PBS与不完全福氏佐剂的混合物中PBS与不完全福氏佐剂的体积比为1 1。(M2e) 8-Tuftsin组为在小鼠两条后腿内侧皮下各注射30 μ 1的分支状(Mk)S-Tuftsin与不完全福氏佐剂混合制备的流感疫苗，流感疫苗中分支状 (M2e)8-Tuftsin的浓度为5ug/30ul。每只小鼠的分支状(M2e)8-Tuftsin注射总量为 IOyg/只。(M2e) 8_G4组为在小鼠两条后腿内侧皮下各注射30 μ 1的分支肽(Mk) 8_G4 与不完全福氏佐剂的混合物，分支肽(Mk)8-G4与不完全福氏佐剂的混合物中分支肽 (M2e)8-G4的浓度为5ug/30ul。每只小鼠的分支肽(Mk) 8-G4注射总量为10 μ g/只。各组小鼠均免疫三次，每次免疫间隔三周。A)每次免疫后的第14天分别从小鼠眼眶后静脉采血，分别离心取血清，-20°C保存，用于血清中抗似e抗体滴度检测。采用ELISA方法检测不同免疫组小鼠每次免疫后第14天血清中抗Mk抗体滴度。ELISA结果如图12所示，第一次免疫后第14天(图12中以第一次免疫后表示) 分支状(iCe) 8-Tuftsin组和分支肽(Mk) 8-G4组的血清中抗体效价分别为1056和39 ；第二次免疫后第14天(图12中以第二次免疫后表示)分支状(Mk) 8-Tuftsin组和分支肽
8(Mk) 8-G4组的血清中抗体效价分别为9370和252 ；第三次免疫后第14天(图12中以第三次免疫后表示)分支状(iCe)8-TuftSin组和分支肽(iCe)8-G4组的血清中抗体效价分别为14703和696 ；PBS三次免疫后的抗体效价均为零。上述的结果说明，分支状(Mk)S-Tuftsin和分支肽(Mk) 8-G4都能诱导小鼠产生抗Mk抗体，分支状(Mk) 8-Tuftsin组和分支状(Mk) 8-G4组与PBS组的抗体滴度相比都有显著性差异(P < 0. 05)。而分支状(Mk) 8-Tuftsin组比分支状(Mk) 8-G4组诱导产生的抗Mk抗体水平更高，它们之间抗体滴度相比也有显著性差异(P < 0. 05)。B)第三次免疫后12天，每组各取5只小鼠处死取脾脏，分离脾淋巴细胞，用于 ELISP0T 试验。采用ELISP0T方法检测Mk特异性刺激产生IFN-Y的细胞数量间接反映免疫后小鼠Thl细胞的特异性反应功能。ELISP0T 方法使用 Quick Spot 人 IFN-Y ELISPOT 预包被试剂盒。ELISP0T方法检测结果如图13所示，PBS组小鼠脾淋巴细胞中平均每5X IO5细胞产生12个斑点，(M2e) 8-Tuftsin组小鼠脾淋巴细胞中平均每5 X IO5细胞产生124个斑点， (M2e)8-G4组小鼠脾淋巴细胞中平均每5 X IO5细胞产生30个斑点。说明分支状(Mk) 8-Tuftsin能诱导小鼠产生细胞免疫，产生的斑点数目与PBS诱导产生的斑点数目有显著性差异(P <0.05)，而对照分支肽(Mk) 8-G4诱导产生斑点数目要明显低于含Tuftsin的分支肽。C)第三次免疫后14天，用流感病毒PR8株攻击每组剩余的小鼠，流感病毒PR8攻击方法如下用C02吸入法将小鼠麻醉，然后迅速在其两侧鼻孔各滴入25 μ 1 5倍TCID5tl 流感病毒PR8病毒液，使其充分吸入。攻毒后第5天，每组各取5只小鼠处死取肺，称重，制备肺组织悬液，连续稀释后接种MDCK细胞，测定TCID5Q。肺病毒载量测定结果如图14所示，PBS组Ig TCID50为6. 53，(M2e)8-Tuftsin组 Ig TCID5tl为5. 53，(iCe)8-G4组Ig TCID5tl为5. 89，这个结果表明含Tuftsin的分支肽免疫组小鼠肺病毒载量最低，与PBS组相比具有显著性差异(P < 0. 05)，说明病毒在这组小鼠体内的复制受到有效的抑制。攻毒后每日观察每组10只小鼠的存活率，至攻毒后14天统计存活率，攻毒M小时内死亡的小鼠视为意外死亡。小鼠存活状况统计结果显示，接种PBS的小鼠攻毒后第7天和第8天各有1只死亡，接种对照分支肽(Mk) 8-G4的小鼠在第8天有1只死亡，而接种分支状(Mk)S-Tuftsin 的小鼠未出现死亡，说明这两种分支肽免疫对小鼠具有保护作用。本发明的另外的实施例还提出一种分支多肽衍生物，是在分支状(MkM-Tuftsin 和分支状(Mk)S-Tuftsin的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化所得到的衍生物。本发明的其他实施例还提出分支状(iCe)4-TuftSin和分支状(Mk) 8-Tuftsin药学上可接受的盐，这些盐通过以分支状(iCe)4-TuftSin和分支状(Mk) 8-Tuftsin为原料结合现有技术的制备方法既可以得到。本发明提出的分支状(iCe)4-TuftSin和分支状(iCe) 8-Tuftsin可以用于制备疫苗，特别是制备甲型流感病毒疫苗，更进一步的，所述甲型流感病毒为Hmi流感病毒、H2N2流感病毒、H3N2流感病毒、H5N1流感病毒、H7N7流感病毒或H9N2流感病毒。
本发明还提出一种疫苗，是以分支状(iCe)4-TuftSin或分支状(Mk)8-Tuftsin 作为活性组分。所述疫苗为甲型流感病毒疫苗，更进一步的，所述甲型流感病毒疫苗为Hmi 流感病毒疫苗、H2N2流感病毒疫苗、H3N2流感病毒疫苗、H5N1流感病毒疫苗、H7N7流感病毒疫苗或H9N2流感病毒疫苗。
权利要求
1.一种分支多肽，其特征在于所述分支多肽自氨基端到羧基端的结构式如下；(AAn) 8- (Lys) 4- (Lys) 2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg ；或(AAn) 4- (Lys) 2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg ；所述AAn为甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区，上述分支多肽的羧基端序列 Thr-Lys-Pro-Arg 为免疫活性肽 Tuftsin。
2.根据权利要求1所述的分支多肽，其特征在于所述甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区自氨基端到羧基端的的序列如下Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-A sn—Asp-Ser—Ser—Asp。
3.一种分支多肽衍生物，是在权利要求1或2所述的分支多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化所得到的衍生物。
4.一种分支多肽衍生物，是权利要求1或2所述的分支多肽的药学上可接受的盐。
5.权利要求1至4中任一所述的分支多肽在制备疫苗中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述疫苗为甲型流感病毒疫苗。
7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于所述甲型流感病毒为Hmi流感病毒、H2N2流感病毒、H3N2流感病毒、H5N1流感病毒、H7N7流感病毒或H9N2流感病毒。
8.一种疫苗，其活性物质为权利要求1至4中任一所述的分支多肽。
9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于所述疫苗为甲型流感病毒疫苗。
10.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于所述甲型流感病毒为Hmi流感病毒、 H2N2流感病毒、H3N2流感病毒、H5N1流感病毒、H7N7流感病毒或H9N2流感病毒。
全文摘要
本发明是关于一种以免疫活性肽为载体的分支多肽及其衍生物与应用。该分支多肽自氨基端到羧基端的结构式为(AAN)4-(Lys)2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg；AAN为甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区，羧基端序列Thr-Lys-Pro-Arg为免疫活性肽Tuftsin。甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区自氨基端到羧基端的序列为Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp。本发明的分支多肽可制备成流感疫苗。本发明的分支多肽能与M2多克隆抗体特异性结合，能与巨噬细胞特异结合，促进抗原呈递细胞的处理。本发明的分支多肽制备的疫苗诱导动物免疫应答效率高，并能保护动物免受病毒感染。
文档编号C07K19/00GK102153654SQ20101061733
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者刘晓宇, 姚立红, 张智清, 徐一, 郭建强, 陈爱珺, 韩苏 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 元森泰生物科技(天津)有限公司