专利名称：：用于冠状动脉粥样硬化斑块的反应剂及其用途的制作方法用于冠状动脉粥样硬化斑块的反应剂及其用途本发明涉及试剂及用于制备其的方法。具体而言，本发明包含针对冠状动脉斑块中存在的抗原的抗体或其片段。本发明进一步涉及编码这些抗体的核苷酸序列及抗体或其片段的氨基酸序列用于免疫测定法的用途。进一步地，本发明包含涉及所述抗体或其片段的或其配体的用途的诊断和治疗应用。
背景技术：
：急性冠脉综合征(还简称为ACS)是冠状动脉中斑块破裂的表征。硬化斑块的破裂或侵蚀，以及随后的血栓形成和动脉闭塞可导致心肌梗死和不稳定型心绞痛(JAL"Newinsightsintoatheroscleroticplaquerupture"D.M.Braganza和Μ.R.Bennett,Postgrad.Med.J.2001；77；94-98，作为一般参考)。动脉粥样硬化事件以充满脂质、单核细胞衍生的泡沫细胞以及相结合的T细胞的皮下积累开始，这些形成非狭窄型脂肪条纹。随着发展，病灶形成胆固醇酯的非细胞核心，周围是含有平滑肌细胞(VMSC)和炎性细胞(巨噬细胞和T淋巴细胞二者)的内皮化纤维帽。新血管也呈现于晚期的病灶中并且羟磷灰石钙沉积物也可在晚期病灶中出现(JAL"Coronarydisease:Atherogenesis:currentunderstandingofthecausesofatheroma”PeterL.ffeissberg,Heart2000；83；247-252，作为一般参考)。斑块的细胞外脂质核心由游离胆固醇、胆固醇结晶以及衍生自浸润了动脉壁的脂质或衍生自死亡的泡沫细胞的胆固醇酯组成。脂质核心可通过引起对斑块肩部区域的压力而影响斑块；另外，脂质核心包含前血栓氧化脂质并且进一步充满衍生自巨噬细胞的组织因子，所述巨噬细胞中的脂质核心物质在接触循环血时具有高度的血栓形成性(见，例如，“MechanismofPlaqueVulnerabilityandRupture，，PredimanK.Shah，JournaloftheAmericanCollegeofCardiology2003；41(Suppl1)；15—22)。斑块的稳定性还取决于斑块的脉管平滑肌细胞(SMC)的含量，因为其能够合成结构上重要的I型和III型胶原。相反，巨噬细胞和其他炎性细胞可释放降解胶原和细胞外基质的基质金属蛋白酶(MMP)，因此潜在地弱化斑块(见“Newinsightsintoatheroscleroticplaquerupture"D.Μ·Braganza禾口Μ·R.Bennett,Postgrad.Med.J.2001；77；94-98)。纤维帽的结构组分包括衍生自SMC的基质组分如胶原、弹性蛋白和蛋白聚糖。所述的纤维帽保护斑块的深层组分不与循环血接触，并已经观察到其在破裂的附近变薄。已经显示破裂的斑块具有相对于完整斑块的数种组织形态学特征。因此，当这些特征存在时，认为其表示了对斑块破裂的易损性。人们认为与斑块形成相关的可能原因之一是由对内皮层反复损伤引起的，这些损伤由以下四“大”危险因子引起吸烟、高血压、糖尿病和高血脂症(高水平的LDL和低水平的HDL)。此外，损伤后伴随的内皮功能紊乱在斑块起始中起到关键作用，因为脂质可以更容易地从血流通过进入内膜。易损的斑块可自发(即，无需前文提到的任何诱因的发生)或在具体事件(如极端的身体活动，严重的感情创伤和不同性质压力或急性感染)之后发生破裂。斑块破裂经常导致血栓症，具有临床表征为ACS。对斑块破裂的血栓应答很可能受斑块上暴露出的成分的促血栓性的调节；通常地，斑块破裂发展于这样病灶中，其具有坏死核心以及受到炎性细胞严重浸润的薄的覆盖的纤维帽。支架血栓由于血小板和坏死核心之间的物理接触而进一步发展(见，例如，"Pathologicassessmentofthevulnerablehumancoronaryplaque'T7.D.Kolodgie^AHeart2004；90;1385-1391)。纤维帽的破裂或侵蚀使高度血栓形成性的胶原基质和脂质核心与循环系统相接触，不可避免地导致血小板积累和活化。这一点反过来导致纤维蛋白沉积以及血栓形成，其可导致脉管闭塞，后者在如沉默期(silentepisodes)的情况下不可避免(见，例如，"Coronarydisease:Atherogenesis:currentunderstandingofthecausesofatheroma，，PeterL.ffeissberg,Heart2000；83；247-252)。直到最近，人们都认为动脉粥样硬化是退行性且发展缓慢的疾病，通过其对血流的机械效应引起症状，而现在理解的是其为可显著修饰的动态炎性过程。最近对造成动脉粥样硬化发展的细胞和分子事件的研究将注意力聚焦在决定疾病转归(outcome)的斑块组分之间的动态相互作用(见，"Coronarydisease=Atherogenesiscurrentunderstandingofthecausesofatheroma，，PeterL.ffeissberg,Heart2000；83；247-252作为一般参考)。对于冠脉综合征和要评估的数种病原体之间的关系的数据之间有着显著差异。在一项前瞻性研究中(见，例如"Impactofviralandbacterialinfectiousburdenonlongtermprognosisinpatientswithcoronaryarterydisease”RupprechtH.J.etal.,Circulation2001，Jul3；104(1):25_31)，描述了在一组1018个患者中的中风和8种不同病原体(1-2型单纯疱疹病毒(Herpessimplexvirus1-2)、EB__(Epstein-Barr)、UMM'MM(Cytomegalovirus)、M1^Bfifilff菌(Haemophilusinfluenzae)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、幽门螺方宠杆菌(Helicobacterpylori)和肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae))之间的关系；发现死亡率的增加，与6-8种病原体的血清阳性7%和12.6%有关。DePalma禾口其小组("PatientswithAcuteCoronarySyndromeShowOligoclonalT-CellRecruitmentWithinUnstablePlaque'DePalma等人Circulation2006,113:640-646)对提取自血液样品及直接提取自急性冠脉综合征的冠脉斑块的T细胞库(Tcellsrepertoire)进行了研究。抗体结构存在有五种类型的抗体(也称为免疫球蛋白)IgG、IgA、IgD、IgM和IgE。IgG的结构(在图1中说明)包含两条分子量约23kDa的轻链和两条分子量约53-70kDa的重链。这四条链通过二硫键以“Y”构象互相连接。重链分类为Υ、η、α、δ和ε，以及一些其中的亚类，而轻链则分类为κ或λ。每条重链包含恒定区和可变区，后者处于免疫球蛋白分子的N-末端，长度大约为100个氨基酸。具体而言，免疫球蛋白(Ig)的重链和轻链中最可变的部分为第三互补决定区(⑶R3)——由V-D-J基因片段之间的连接形成的短氨基酸序列。⑶R3发现于抗原受体蛋白质(例如，免疫球蛋白和T细胞受体)与抗原形成互补的可变结构域。CDR3部分的可变性使得产生的抗体数量升高并决定哪些抗体特异性针对哪些抗原；所述可变性由V，D和J微基因在成熟B细胞生成中在骨髓中发生的重排决定。在第一次重排发生后，当成熟B细胞遇到抗原时，进一步的超突变事件使得抗体对所述特异性抗原的亲和力增加。发明_既述本发明涉及重组抗体，其包含氨基酸SEQIDNO:2和4或其任何片段，作为用于鉴定动脉粥样硬化斑块中涉及或存在的抗原的反应剂。所述抗体优选地为IgG抗体。本发明进一步的目标是用于生产所述抗体的方法，所述方法包含在宿主细胞中制备分离的编码SEQIDNO:2和4或其片段的多核苷酸序列。优选地，所述分离的编码SEQIDNO2和4或其片段的多核苷酸序列为多核苷酸分子SEQIDNO:1和3或其片段。进一步的实施方式包含表达载体，其包含合适的宿主细胞中的一条或多条分离的SEQIDN01和3的多核苷酸分子，以及其互补或同源序列，这些在一起成为表达系统。本发明进一步的目标是一种测定法，其包括一条或多条对应着SEQIDN0:2和4的氨基酸序列或其任何片段及其同源序列的用途。在本发明的一个进一步的实施方式中，提供了包含本发明的抗体或其任何片段的组合物以及与其相连的用于治疗或诊断目的的治疗或诊断部分。本发明的进一步的目标是用于筛选和/或鉴定分子或抗原的方法，所述分子或抗原甚至是包含于复合基质如细胞或活检样本之内的、具有对本发明的抗体或其任何片段的结合亲和力。附图简述图1为IgG抗体分子及其Fab片段的结构示意图。图2表示用于生产抗体的重组形式。图3表示人免疫球蛋白基因座的功能基因片段的数量。图4为根据本发明(左，来自冠脉斑块样本的mRNA)以及根据现有技术(右，mRNA来自血液标本)的抗体或其片段的制备示意图。图5显示了通过在细胞裂解物Ofep-2)、颈动脉裂解物、人工抗原上的生物筛查进行免疫亲和力选择的结果。图6显示了根据本发明的Fab68的ELISA结果。发明详述^X在本发明中，除非另外有所提供，术语“分离的多核苷酸”或“分离的核苷酸”指的是多核苷酸分子，其中分别地，多核苷酸的和核苷酸的及多核苷酸和核苷酸以相同的意义交替地进行使用，其基本上不含通常在其天然发生环境中存在的或与其接触的任何其他细胞物质或组分，如其他核苷酸或多核苷酸序列的片段、蛋白质或其他细胞组分。除非另外有所提供，“互补的序列”指的是在严格条件下与目标序列杂交的序列，产生分别在腺嘌呤和胸腺嘧啶残基之间形成的两条氢键或在胞嘧啶和鸟嘌呤残基之间形成的三条氢键，以及其具有简并性密码子置换或沉默置换(即，一个或两个或三个连续核苷酸的置换由于遗传密码的简并性产生所编码相同的氨基酸)的其保守类似物。在本发明意义内的分离的多核苷酸包含例如，基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、质粒、载体、分离的DNA、探针以及引物。除非另外有指出，本发明的分离的多核苷酸除了上文描述的具体情况之外，还包含其互补序列。“cDNA”指的是连续地编码一段氨基酸序列的互补的DNA序列单链或双链的，还指任何其同源序列以及其任何片段，即，其序列不含内含子且可通过逆转录技术从分离的mRNA合成。在本发明的意义内的“同源序列”指的是部分地或几乎与目标序列同一的任何序列；因此，在那些单元为核苷酸或氨基酸时，两条或多条序列的“同源性”或“同一性”来自对组成所述核苷酸/氨基酸序列的总单元中占据相同位置的相同单元数目的实际测量。例如，90%的同源性指的是当两条序列比对最大配对时，组成序列的每100个单元中有90个是同一的。在本发明内，同源序列具有至少85%，优选地90%，更优选地95%，甚至更优选地至少97%或99.5%的同一性。氨基酸的“保守性置换”预期为一种氨基酸被具有相同特性的另一种氨基酸所置换，使得这种置换对肽的总体特征性属性或功能没有影响。这些保守性置换的实例包括如下属于相同的组的一种氨基酸对另一种氨基酸的置换(i)具有带电基团的氨基酸，包含谷氨酸和天冬氨酸，赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(ii)具有正电基团的氨基酸，包含赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(iii)具有负电基团的氨基酸，包含谷氨酸和天冬氨酸；(iv)具有芳香基团的氨基酸，包含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(ν)具有氮环基团的氨基酸，包含组氨酸和色氨酸；(vi)具有大的脂肪族非极性基团的氨基酸，包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(vii)具有轻度极性基团的氨基酸，包括甲硫氨酸和半胱氨酸；(viii)具有小残基基团的氨基酸，包括丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸(ix)具有脂肪族基团的氨基酸，包含缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸；(χ)具有小的水性基团的氨基酸，包含丝氨酸和苏氨酸。在下文的公开中，“⑶R3”为包含在重链和轻链任何区域之内的短序列，并且指的是通过编码抗体的V-D-J基因(在重链中)或V-J基因(在轻链中)片段之间的连接形成的互补决定区。⑶R3发现于与抗原互补的可变结构域。在SEQIDN0:2和4之内，CDR3区域分别由以下片段表示CVTLGRWSSWQGGALSW和CQQYHNWPPLTF(SEQIDN09和SEQIDN010)。“单克隆”指的是编码抗体的CDR3区域的序列，其能够特异性结合抗原/表位。显示相同⑶R3的序列被视为由相同的克隆产生。“克隆变体”意指任何在一个或多个核苷酸或氨基酸上有差异的序列，在与种系相比具有相同突变的V区域、同一的VDJ或VJ基因用途以及相同的D和J长度存在的情况下。“取代突变”意指引起编码另一种氨基酸的核苷酸突变。“沉默突变”意指由于DNA简并性而不引起所编码的氨基酸发生改变的核苷酸突变。“表达载体”意指用于传输遗传信息的核苷酸分子。“分离的表达系统”意指用于氨基酸分子表达的系统，并且会包括包含了编码一种或多种本发明的氨基酸分子的核苷酸序列的一种或多种表达载体，以及转染入所述一种或多种载体的适合的宿主细胞。关于本发明的“宿主细胞”意指包含一种或多种本发明的表达载体的细胞，且其能够例如通过将其表达在它的表面而产生对应的编码的一种或多种氨基酸序列或其任何片段。根据本发明的“抗体”和“抗体片段”旨在包括IgG、IgA、IgD、IgM或IgE类型的完全抗体(也称为免疫球蛋白)以及其任何片段，如蛋白水解和/或重组片段——如Fab片段(在用木瓜蛋白酶消化Ig时产生)、F(ab’)2(在用胃蛋白酶消化免疫球蛋白时产生)、Fab’、Fv、单链抗体(scFv)以及抗体的单链，例如，单链的重链或轻链。本发明之内的“配体”意指任何结合本发明的抗体的识别功能区域或其任何片段的试剂。根据本发明的“寡肽”为包含少于50个氨基酸残基的氨基酸序列。在以下的描述中除非另外有所提供，“种系”序列意指编码抗体/免疫球蛋白的序列或其任何不含突变的片段，因此，同源性的百分比为与抗原接触后任何类型的重链部分经历的突变事件的表示；更具体地，所述突变涉及抗体/免疫球蛋白的CDR3部分或其任何片段。"RS突变”比率指的是发生于抗体/免疫球蛋白编码序列中FR或⑶R3部分的取代(R)和沉默⑶突变之间的比率。⑶R3的所述比率高于FR序列的比率，因为⑶R3经历较高数量的突变事件以适应抗原的结构。相反，FR通常是更保守的序列。僅“ρ值”表示突变事件的显著性。具体而言，重排V片段的体细胞超突变以及抗原选择具有更高亲和力的突变体的过程使亲和力成熟得以进行，以产生对抗原具有提高的结合特性的抗体。此过程导致了CDR区域中取代突变(R)的积累，其直接参与抗原的结合。相反，沉默突变(在FR区域中积累，其通常为更保守的序列，以维持抗体的构象。在没有抗原选择的情况下，随机的突变过程在抗体的重链和轻链的序列中产生R和S突变的随机分布。然而在选择过程中，CDR3中RS突变比率通常高于FR序列的比率。因此，ρ值与抗原选择过程的概率相关，其通过意外发生突变的过量(如CDR)或稀缺(如FR)的多重正态分布模型而计算。低的ρ值表示相比于对应种系序列，重链和轻链变异概率高，这是由于抗原驱动的抗体亲和力成熟。显著的P值预期为低于5%。根据本发明的第一个方面，提供了用于制备抗体的方法，所述抗体包含在重链可变区对应于SEQIDNO2并在轻链可变区域对应于SEQIDNO4的氨基酸序列，以及其同源序列，以及通过多核苷酸分子表达获得的具有保守性置换的任何序列或其片段。优选地，所述多核苷酸序列包含SEQIDNO:1和3以及与其互补和同源的序列。本发明的多核苷酸序列编码抗体的氨基酸序列或其任何片段，其结合于可能发现于冠脉斑块中的抗原或其任何片段。优选地，在本发明之内，上文的实施方式中分离的多核苷酸为根据本领域熟知步骤通过逆转录获自mRNA的cDNA分子。如所指出的，这些定义预期包含类似序列，以便包括其中在氨基酸序列的情况下至少一个或多个氨基酸被衍生物(如对应的D-异构体或，例如，对应的硫酸化、糖基化或甲基化的氨基酸)所置换的那些序列；或构成序列的总氨基酸中的一个或多个或多至10%可由其衍生物置换——例如，半胱氨酸可由同型半胱氨酸置换。还包括具有保守置换的序列。根据本发明，还包括的是编码根据本发明第一个实施方式的抗体或其任何片段的多核苷酸序列，在使用ImMunoGeneTics(通过网址http://imgt.cines.fr可得)中可得的数据库时，其相比于种系具有至少80%，优选地至少90%，更优选地至少95%以及甚至更优选地97%的同源性。另外，对于本发明的第一个目标，超突变的氨基酸序列也包含在内。因此，还包括编码氨基酸序列(其具有的上文提到的⑶R3部分的ρ值低于5%，优选地低于2%，更优选地低于1%，甚至更优选地低于1%。)的多核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。如前文确定的，根据本发明，包括cDNA分子的合成，这是在分离自患者活性冠脉斑块的合适样品的mRNA上进行。为了本发明的目的，所述活性冠脉斑块的合适样品包括在梗死事件后立即取得的冠脉斑块样品，即，所谓“新鲜样品”或，备选地，可取得样品并在液氮条件下保藏一段合适的时间，以不妨害或改变其组织学特性并用于进一步分析。为了本发明的目的，选择患有急性冠脉综合征(ACS)的患者，其经历了在入院48小时之内发生的典型性胸痛或ECG变化，这些提示了心肌损伤。为了排除可能的混淆因子，有近期感染性疾病、免疫学障碍、免疫抑制治疗或肿瘤疾病的患者已经排除。从上文的合适的样品中(即，从冠脉斑块和外周血)中分离mRNA这是根据熟知方法进行的。见例如Molecularcloning.Sambrook禾口Russell.ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarbor,NewYork.ThirdEdition2001作为参考。根据第二个实施方式，本发明的表达载体选自例如质粒、粘粒、YAC、病毒颗粒或噬菌体，并包含一种或多种根据本发明第一个实施方式的多核苷酸序列；在一个优选的方面，表达载体为质粒，其包含一种或多种根据本发明第一个实施方式的多核苷酸序列。在本发明一个最优选的实施方式中，表达载体(即，质粒)包含多核苷酸SEQIDNO1和3。然而，根据遗传密码的简并性和在其中实现重组表达的各个生物体中偏好密码子的用途，任何编码SEQIDN02和4的多核苷酸序列被视为包含在本发明范围之内。表达载体通常还包括复制起点，可操作性连接(即，以在引入细胞时核酸序列表达得以进行的方式连接其上)的位于编码序列上游的启动子，以及核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺嘌呤位点和转录序列。本领域技术人员将能够构建适当的表达载体，并因此根据所选择的宿主细胞构建任何适当的表达载体；例如，通过选择可以由宿主生物体识别的启动子而构建。在一个甚至更优选的实施方式中，本发明的表达载体以Burioni等人(HumanAntibodies2001；10(3-4):149-54)描述的载体为代表。根据本发明的分离的表达系统可包含单一的表达载体，其包含一种或两种本发明多核苷酸序列。备选地，上文的表达系统可包含两种或多种表达载体，其中每种都包含本发明多核苷酸分子的任何一种。例如，表达载体可包含编码抗体的轻链或其片段的本发明的多核苷酸分子，第二种表达载体可包括编码抗体的重链或其片段的本发明的多核苷酸分子。在本发明的一个实施方式中，表达系统包含单一的表达载体，其包括一种或多种包含SEQIDNO:1-3且编码氨基酸序列SEQIDNO:2_4的多核苷酸分子或具有相同抗原特异性的其任何片段以及其任何同源序列。在本发明一个优选的实施方式中，表达系统包含一种表达载体，其包含编码轻链(即，SEQIDNO3)的多核苷酸序列和第二种编码重链(即，SEQIDNO1)的多核苷酸序列。备选地，表达系统可包含合适的框架用于⑶R3氨基酸序列SEQIDNO:9或SEQIDNO10的表达，其具有与完全抗体相同的特异性。根据此实施方式，任何编码SEQIDN09和10的核酸序列都包含在本发明之内，尽管优选的序列为发现于SEQIDN01和3之内的那些序列。制备本发明表达系统之内的表达载体包括根据本领域熟知的方法将恰当的核酸分子插入一种或多种载体，所述载体通常包含一条或多条信号序列、复制起点、一种或多种标志基因或序列、增强子元件、增强子，以及转录终止序列。作为所述步骤的一般参考，见例如Phagedisplay,ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor,NewYork。例如，编码本发明重链的序列与Flag或六组氨酸尾巴一起转入表达载体，用于更容易地检测或纯化。根据本发明第四个实施方式的宿主细胞可以为例如原核细胞或真核细胞。合适的原核细胞包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，且可包括例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏菌(E.coli))，肠杆菌属(EntercAacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)，以及志贺氏菌属(Shigella)，还有芽孢杆菌属(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.Iicheniformis)，假单胞菌属(Pseudomonas)如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，以及链霉菌属(Str印tomyces)。例如，可以使用的公开可得的菌株为例如，大肠杆菌K12株MM294(ATCC31，446)；大肠杆菌X1776(ATCC31，537)；大肠杆菌株W3110(ATCC27,325)以及K5772(ATCC53，635)或大肠杆菌XLl-Blue，其代表着优选的大肠杆菌株。除了原核细胞，真核微生物如丝状真菌或酵母是合适的宿主细胞。通常使用的是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，也已知为普通面包酵母(commonbaker，syeast)；其他酵母为例如，糖酵母属(Saccharomyces)，毕赤酵母(Pichiapastoris)，或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母(K.Iactis)、脆弱克鲁维酵母(K.fragilis)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)、维克拉姆克鲁维酵母(K.wickeramii)、K.waltii、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)以及马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)如裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，耳口子囊菌酵母属(yarrowia),汉逊酵母属(Hansenula),瑞氏木霉属(Trichodermareesia),粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)，许旺酵母属(ktiwanniomyces)如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)，链抱霉属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，弯颈霉属(Tolypociadium)，曲霉属(Aspergillus)如构巢曲霉(A.nidulans)，假丝酵母属(Candida)，球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Iihodotorula)。另外，用于制备表达系统的合适的真核细胞可衍生自多细胞生物体，如来自无脊椎动物细胞或植物细胞。植物细胞包括例如根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和烟草(Nicotianatabacum)。另外，可使用昆虫细胞，其包括例如果蝇(Drosophila)S2以及斜纹夜蛾(Spodoptera)Sf9。相反地，哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)和COS细胞。更具体的实例包括SV40转化的猴肾CVI系(C0S-7，ATCCCRL1651)；人胚肾系、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR、小鼠支持细胞(Sertolicell)、人肺细胞(W138,ATCCCCL75)；人肝细胞(HepG2，HB8065)；以及小鼠乳腺瘤(MMT060562，ATCCCCL51)。对恰当宿主细胞的选择被视为在本领域技术人员的知识之内，S卩，原核细胞可用于制备抗体片段如Fab，而对于完全抗体如IgG的制备，可采用真核细胞如酵母。在根据本发明的抗体定义中包括任何适合于表达轻和/或重链可变链或其特异性CDR(例如Fab片段、F(ab，)2、Fab，、Fv和单链抗体(scFv))的脚手架蛋白。用于细胞转染和转化以制备包含上文表达系统的上文公开的宿主细胞的方法取决于所使用的宿主细胞并在本领域技术人员的一般知识之内。例如，用钙或电穿孔处理通常用于原核细胞，而用根癌农杆菌转染用于特定植物细胞的转化。对于哺乳动物细胞，可使用磷酸钙沉淀，如Graham和vanderEb,Virology,52:456-457(1978)所公开的。然而，用于将多核苷酸序列引入细胞的其他方法例如核显微注射、电穿孔、细菌与完整细胞的融合、或多聚阳离子也可使用。另外，宿主细胞也可移植入动物以产生转基因的非人动物，用于制备人源化抗体或其片段。优选的非人动物包括，例如，小鼠、大鼠、仓鼠。根据本发明的一个实施方式，生产重组抗体及其片段是根据本领域已知的方法进行的，包括本发明的分离的多核苷酸序列的用途。具体而言，所述方法包括如下步骤a)在任何一种上文公开的合适的宿主细胞中，制备包含一种或多种编码氨基酸SEQIDNO2和4且优选地具有SEQIDNO:1和3的cDNA分子的表达系统；b)在合适的生长条件下培养宿主细胞；c)回收和/或纯化所生产的具有氨基酸SEQIDNO:2和4或其任何片段的抗体或其任何片段。在上文描述的方法中，片段优选地为具有SEQIDNO:9CVTLGRWSSWQGGALSW和SEQIDNO:10CQQYHNWPPLTF的⑶R3片段，其可在任何一种上文公开的宿主细胞中的合适脚手架蛋白中表达。合适的脚手架蛋白通常衍生自人抗体，其中，在可变区由本发明的⑶R3区域取代先前存在的CDR3。微抗体(minibody)或kFv框架也用于CDR3的表达。包含表达系统的宿主细胞在合适的生长条件下生长，然后回收和/或纯化如此生产的抗体或其任何片段用于进一步用途。为了评估统计学发生的突变或其它不同于参与冠脉斑块B细胞成熟的机制对所获得的结果的影响，还在一小部分具有保守区域的基因上进行克隆和测序。因此，作为内部参考物，选择β-球蛋白基因；具体而言，使用了标准β-球蛋白L48931。因此，本发明的一个进一步的目标是本发明的宿主细胞并根据上文公开的方法产生的分离的重组抗体和其片段，包括IgG型的免疫球蛋白(简称为Ig)，而“其片段”优选地包括IgG的Fab片段。根据本发明，还包括编码抗体或其任何片段的氨基酸序列，其可根据上文公开的方法产生，并且当使用ImMunoGeneTics(通过网址http://imgt.cines.fr可得)中可得的数据库时，相比于种系具有至少80%、优选地至少90%、更优选地至少95%甚至更优选地至少97%的同源性。此外，还包括氨基酸序列，其具有的⑶R3部分的ρ值低于5%、优选地低于2%、更优选地低于1%，甚至更优选地低于1%。。本发明的一个进一步的具体实施方式表示为一种测定法，优选地是一种免疫测定法，其包含根据本发明的抗体或其任何片段的用途。免疫测定法是基于抗原/抗体复合物的形成的测试，可以是竞争性的或非竞争性的。竞争性免疫测定法包括测试未知样品，其含有与另一种抗原竞争结合于抗体(优选地为标记的抗体)的具体抗原；因此，应答情况与未知样品中抗原浓度成反比。相反地，非竞争性免疫测定法——也称为“三明治测定法”——包括使用如本发明公开的固定化抗体，其被抗原结合而形成标记抗体靶向的复合物；因此所述方法的结果直接与抗原浓度成比例。广泛使用的免疫测定法包括，例如，RIA(放射免疫测定法)、Western印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、免疫染色、免疫沉淀、免疫电泳、免疫荧光、发光免疫测定(LIA)、免疫组织化学，这些在实验室实践中常规使用。根据本发明的一个优选的免疫测定法是ELISA测试。ELISA是一种已经成熟建立的生化技术，其使得能够在给定样品中检测并进一步定量生物分子，如抗体或其片段、抗原、蛋白质、激素和其他有机分子；优选地，根据本发明，上文提到的ELISA测试用于使用包含SEQIDNO2和4或备选地包含SEQIDNO9和10的抗体或其片段检测特异性抗原。ELISA测试，具体而言，可包括使用两种抗体，其中一种固定在ELISA板上，选择性针对目标分子——抗原。此抗体优选地为根据本发明的一种抗体。加入可能含有目标分子，甚至是在复合物基质如细胞或组织裂解物之内包含目标分子的混合物，使其孵育一段合适且足够的时间，然后进行第一次洗涤以移除未结合物质。进一步加入偶联于酶的二抗，其特异性针对目标分子与一抗之间形成的复合物。接着进行ELISA板的第二步洗涤步骤并加入显色底物。所得的颜色变化可通过光谱光度测量技术评估并通过比色标准曲线与所形成的复合物的量直接相关，因此与样品中目标分子浓度相关。要通过上文的本发明的免疫测定法测试的样品为，例如，在梗死事件发生后立即分离自患者的不稳定型冠脉斑块的样品，即，如前文所述的所谓“新鲜”样品，或在取得后已经在液氮下保藏的样品；备选地，样品可由全血、血清、培养的细胞(即，细胞系或其裂解物)构成。有用的细胞系为例如，H印2(ATCC号CCL-23)、U87(ATCC号HTB14)、MRC5(ATCC号CCL-171)，这些细胞或受到病原体(S卩，病毒如CMV)感染或未受感染，或者受暴露出合成肽的分子文库或暴露出病原物抗原的文库。细胞系用于抗体筛选的用途已经在例如^ckU.等人AnnNYAcadSci.2009Sep；1173:166-73中描述。还可根据上文的实施方式进行免疫组织化学测定法来研究本发明中鉴定和公开的配体在斑块内部存在情况。如上文所述的，本发明的免疫测定法可设计用于竞争性地鉴定涉及与冠脉疾病相相关的动脉粥样硬化斑块的发展的抗原。根据本发明的免疫测定法代表了用于在动脉粥样硬化斑块中鉴定抗原的极其重要的工具，其代表了在筛选具有发展急性冠脉综合征(ACQ或其他冠脉疾病的风险的人群中有价值的诊断或预后工具。根据本发明的一个进一步的实施方式，公开了一种治疗组合物，其包含本发明的抗体或其任何片段，以及与其共价相连的治疗部分。所述治疗组合物选择性地将治疗试剂靶向冠状动脉粥样硬化斑块位点。所述靶向的组合物的熟知优势包括，减少要施用的活性要素的量的可能性，这样减少了其潜在的副作用等等。为了所述的目的，治疗部分可包括，作为非限制性实例，放射性核素、药物、前体药物、激素、激素拮抗剂、受体可溶性受体、受体拮抗剂、酶或由另一种试剂激活的原酶、细胞因子、抗微生物试剂或毒素。本发明一个进一步的实施方式涉及诊断组合物，其包含连接于诊断部分的本发明的抗体或其任何片段，用于观察冠脉斑块位点。根据本发明的诊断组合物包含根据本发明的抗体或其任何片段，其共价连接于至少一种能够选择性靶向冠脉斑块位点进行定位的诊断部分。因此，有可能精确地定位冠脉斑块发展的位点及甚至更好地理解管壁上发生的病灶程度。此外，其可为手术移除斑块之前的非常有用的工具。诊断部分使得能够通过医学领域使用的可视化技术进行检测，例如，MRI(磁共振成像)、CT(计算机断层成像)、超声、描述生态学、X-光以及其他在本领域技术人员知识之内的诊断技术。诊断部分会根据所选择的诊断技术而选择。根据本发明的免疫测定法的一个实施方式，本发明已经使得能够鉴定配体，所述配体定义为结合于靶标抗体或其任何片段的任何表面或内部序列或构象结构域或任何其他部分的试剂，且可包含除了能够结合目的靶标之外没有明显生物学功能的试剂。在一个优选的实施方式中，本发明的配体为寡肽，优选地包含4-12个氨基酸，更优选地为包含4-10个氨基酸的肽，甚至更优选地为包含6-8个氨基酸的肽，在SEQIDNO5_8(人工抗原)之内或对应着具有所述序列的肽。备选地，所述肽可用于免疫测定法以竞争性地鉴定涉及与冠脉疾病相相关的动脉粥样硬化斑块发展的抗原。给出以下实施例以更好地理解本发明而不对其产生任何限制。实验部分实施例1样品收集从患有急性冠脉综合征并经历了冠状动脉斑块旋切术的患者的动脉粥样硬化斑块中获得足够量的组织(通常大约1-2毫克)，并储存于液氮中。实施例2:mRNA提取将根据实施例1取得的斑块均质化并根据传统方法学提取总mRNA，根据制造商提供的说明书使用mRNA提取的商业化试剂盒(foieasykit,Qiagen,Germany)进行。实施例3:mRNA逆转录得到患者知情同意后，根据制造商说明书使用mRNA逆转录的商业化试剂盒SuperscriptIIIRT(Sigma-Aldrich,StLouis，Missouri)，对如实施例2中获得的冠脉斑块样品进行mRNA的逆转录。根据标准步骤以寡(dT)为引物从总mRNA进行cDNA的合成。实施例4:cDNA序列扩增将1μ1获自实施例3的cDNA用于多聚酶链式反应。将逆转录引物设计为分别与编码重链和轻链恒定区的序列片段退火。正向引物为“家族特异性的”，并且设计为对应于第一框架区中重链和轻链基因的5’末端；见Phagedisplay,ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor,NewYork.ThirdEdition2001,作为参考。对于重链，使用的是特异性针对IgGl和IgG2同种型的引物，而对于轻链则使用了特异性针对K同种型的引物。用以下的温控形式进行扩增轮94°C以15秒，52°C以1分钟及72°C以90秒。反应进行35个循环。每个反应中包括了阴性对照(不含DNA的相同混合物)以及阳性对照(插入已知序列)。通过电泳在含有溴化乙啶的2%的琼脂糖胶中对PCR产物进行分析。反应产生了对应轻链的Ξ650bp条带，以及对应重链的700bp条带。根据制造商的说明书使用DNA提取的商业化试剂盒(QIAquickgelextractionkit；Qiagen,Germany)从胶中提取扩增子(即，PCR过程的产物)。最后，根据标准方法回收PCR产物。实施例5分子克隆及组合抗体Fab片段噬菌体展示微型库将根据前一实施例扩增自人冠脉斑块的构成Fab的重链和轻链的PCR产物(可变区和CHl结构域)克隆入噬菌体载体(PRB32)，这使得重链和轻链对组合产生并将由含在病毒颗粒内的DNA编排的Fab片段暴露(噬菌体展示)至外部噬菌体表面。这是通过将重链片段与噬菌体M13膜蛋白融合获得的。这样能够产生组合的抗体Fab片段噬菌体展示微型库。实施例6细胞裂解物制备在用HCMV(Μ0Ι0，1)感染5天后，获得感染的和非感染的MRC5及H印_2细胞裂解物。H印-2(ATCCCCL-23)细胞在补充有Antibiotic/AntimycoticSolution(Invitrogen,Antibiotic/AntimycoticSolution,liquid15240—062)禾口10%FBS的E-Mem(Invitrogen0820234DJ)中生长。细胞规律地每5天以110分盘。将五百万个细胞在PBS中洗涤并通过使用RIPA缓冲液(50mMTrisHCLpH8+150mMNaCl+1%NP-40+0.5%NAdeossicolate+0.1%SDS)进行裂解。糕仿丨丨7:^抛料勿、λ工·卜搬纏碰行免疫亲和力诜择在生物筛查前一夜，于4°C以50μL/孔的溶于包被缓冲液中(0.IM碳酸氢盐ρΗ=8.6)的抗原(IOOng/孔)溶液包被ELISA板0/N。用3%的PBS/BSA将用去离子H2O洗涤过的孔完全封闭，将其密封并在湿润的容器中于37°C孵育1小时。将50μL的噬菌体悬液加入各孔(总共大约IO11PFU)并在板密封后于37°C孵育至少2小时。从各孔移除噬菌体(并保存用于滴定)，用0.05%的PBS/Tween洗涤10次。在充分洗涤后，通过用50μ1的洗脱缓冲液(0.IMHC1，甘氨酸调整至pH=2.2，BSAlmg/ml)并向洗脱液中加入3μ1的2ΜTris碱，洗涤各孔而洗脱结合于抗原的噬菌体。洗脱后，用洗脱的噬菌体感染2ml新鲜的XL-Iblue。在37°C孵育15min后，加入IOml的37°C预热的Superbroth(SB)(20μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml四环素)。在37°C于摇床上孵育1小时后，将IOOml含有100μg/mlAmp和10μg/mlTet的SB加入每份IOml培养物中，并在37°C于摇床上孵育1小时后。使用辅助噬菌体VCSM13(总共IO12PFU)感染培养物并在37°C于摇床上孵育2小时。在加入卡那霉素(μg/ml)后，将培养物在30°C于摇床上孵育0/N。第二天，在4°C以6000RPM(SorvallSS34)，15分钟离心下细胞，并将PEG8000(Sigma-Aldrich)加入上清至终体积20ml。使噬菌体在冰上沉淀30分钟，然后在4°C以11，000RPM(SorvallSS34)离心20min。然后在2ml的PBS/BSA中重悬噬菌体，并储存于4°C用于随后的生物筛查轮。在每次洗脱和每轮选择后，通过将以1μ1和0.1μ1的噬菌体感染的细菌群体涂布于LB平板(总量的10_4和10_5稀释)上来滴定洗脱的噬菌体。通过在每轮选择后滴定洗脱的噬菌体，能够估计富集步骤的效力。将此步骤重复四次使得能够对所选择群体的进行富集。结果显示于图5。实施例8=Hep-2即人工抗原上的生物筛杳步骤后对所选择的克隆的分析在所有生物筛查步骤中，本发明的Fab被选择，并且其在第四轮后回收的噬菌体群体中占主导。实施例9测序对根据前面实施例获得的克隆进行测序用于定量和定性分析。9.1)重链和轻链样品加工挑选获自冠脉斑块样品(根据实施例4获得)的重链和轻链克隆的样品，以使用BigDye化学测序并使用ABIPRISM3100测序仪进行分析。使用在ImMunoGeneTics(通过网址http://imgt.cines.fr可得)可得的数据库将所获得的序列各自与种系片段比对，以分别鉴定重链和轻链的V、D、J及V和J基因的复发情况、其与种系的同源性水平以及体细胞突变的程度。将CDR3的序列同一性用于鉴定克隆；如上文提到的，具有相同CDR3序列被视为衍生自相同的克隆。来自根据上文实施例4获得冠脉斑块样品的多核苷酸序列，对于重链对应于SEQIDNO:1且编码对应于SEQIDNO:2的氨基酸序列。来自根据上文实施例4获得冠脉斑块样品的多核苷酸序列，对于轻链对应于SEQIDNO3且编码对应于SEQIDNO4的氨基酸序列。9.2)β-球蛋白序列内部参考物对五个克隆的分析显示所获得的球蛋白序列与数据库中存在的序列相同，这样表明了此过程没有引入突变事件。9.3)来自冠脉斑块样品的轻链来自根据实施例4的冠脉斑块样品的克隆测序的结果显示于下文表I。对于每个克隆，V、D和J基因栏分别报告了被认为是编码了重链的V、D和J可变部分的序列类型。同源性百分比指的是克隆自冠脉斑块样品的序列和如上文公开的对应种系序列之间的同源性的百分比。表I权利要求1.用于鉴定冠状动脉粥样硬化斑块中的抗原的重组抗体，其包含氨基酸SEQIDNO2和4，或其任何片段。2.根据权利要求1的重组抗体，其中所述氨基酸序列片段为SEQIDNO:9或SEQIDNO:10。3.用于制备根据权利要求1-2中任一项的重组抗体的方法，其包含步骤a)制备用于宿主细胞的表达系统，其包含编码SEQIDNO:2和4或其任何片段，优选地多核苷酸SEQIDNO:1和3或其任何片段的两条多核苷酸分子；b)在合适的生长条件下培养所述宿主细胞；c)回收及纯化包含SEQIDN02和4，或其任何片段的抗体。4.权利要求3的方法，其进一步包含步骤d)，其中确定了对选自以下的样品的结合情况分离的动脉粥样硬化斑块、细胞系、细胞系裂解物或生物学样品。5.权利要求4的方法，其中所述细胞系选自H印2(ATCC号CCL-23)、U87(ATCC号HTB14)、MRC5(ATCC号CCL-171)，其受或不受病原体感染。6.根据权利要求3-5中任何一项的方法，其中步骤c)中，所述的片段分别是SEQIDNO9或10。7.根据权利要求3-6中任何一项的方法，其中宿主细胞选自原核、酵母和真核细胞。8.根据权利要求7的方法，其中原核细胞选自肠杆菌属、埃希氏菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、铜绿假单胞菌。9.根据权利要求6的方法，其中酵母细胞选自糖酵母属，毕赤酵母，克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母、脆弱克鲁维酵母、保加利亚克鲁维酵母、维克拉姆克鲁维酵母、K.waltii、果蝇克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母、以及马克斯克鲁维酵母，裂殖酵母属如裂殖酵母，耶子囊菌酵母属，汉逊酵母属，瑞氏木霉，粗糙链孢霉，许旺酵母属如西方许旺酵母，链孢霉属，青霉属，弯颈霉属，曲霉属如构巢曲霉，假丝酵母属，球拟酵母属和红酵母属。10.根据权利要求7的方法，其中真核细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)、SV40转化的猴肾CVI系(C0S-7，ATCCCRL1651)、人胚肾系、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR、小鼠支持细胞、人肺细胞(W138，ATCCCCL75)；人肝细胞OfepG2，HB8065)；以及小鼠乳腺瘤(MMT060562，ATCCCCL51)；植物分离的重组宿主细胞如根癌农杆菌和烟草；昆虫重组的分离细胞如果蝇S2和斜纹夜蛾Sf9。11.根据权利要求1-2中任何一项的抗体在免疫测定法中用于检测冠状动脉粥样硬化斑块中相关抗原的用途。12.根据权利要求11的用途，其中所述的免疫测定法选自RIA(放射免疫测定法)、Western印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、免疫染色、免疫沉淀、免疫电泳、免疫荧光、发光免疫测定法(LIA)、免疫组织化学。13.根据权利要求11-12中任何一项的用途，用于在分离自患者的样品中诊断急性冠脉综合征(ACQ或筛查患有急性冠脉综合征(ACQ风险的群体。14.用于鉴定结合于根据权利要求1-2中任何一项的重组抗体或其任何片段的配体的方法，包括以下步骤a)将所述抗体或其任何片段结合至固相；b)通过一次或多次洗涤步骤移除未结合的物质；c)将候选的配体与步骤a)中制备的固相接触，并使所述候选配体和固相孵育一段合适的时间；d)通过一次或多次洗涤步骤移除未结合的物质；e)加入特异性针对步骤a)的抗体与结合于其上的候选配体的复合体的二抗；及f)鉴定与步骤a)的抗体结合的配体。·14.权利要求14的方法，其中候选配体包含在生物学样品之内。15.根据权利要求15的方法，其离体或在体外进行，其中所述样品选自全血、血清、冠脉斑块活检组织、全细胞或其裂解物。16.根据权利要求14的方法，其中候选配体包含于分子库之内。17.权利要求15的离体或体外方法，用于诊断患者中的急性冠脉综合征(ACS)或筛查患有急性冠脉综合征(ACQ风险的群体。全文摘要本发明公开了能够结合于分离的冠脉斑块样品的抗体或其片段，以及使用含有编码所述抗体或其片段的DNA序列的宿主细胞生产其的方法。还描述了用于筛选所述分离的样品的配体的方法，并且也提供了含有所述抗体的组合物。文档编号C07K16/18GK102317317SQ201080007471公开日2012年1月11日申请日期2010年3月17日优先权日2009年3月19日发明者M·科勒蒙提,R·布廖尼申请人:伯拉考成像股份公司