专利名称：用于生产高纯度神经毒素的手段和方法
用于生产高纯度神经毒素的手段和方法本发明涉及特异性结合未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽的抗体，或者特异性结合由具有如SEQ ID NO :1-16的任一项所示氨基酸序列的肽组成的表位的抗体。此外，本发明涉及用于生产神经毒素多肽的方法，包括以下步骤将含有蛋白水解加工的、部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽的混合物的溶液与特异性结合未加工的或部分加工的神经毒素多肽、但不结合加工的神经毒素多肽的试剂在允许所述试剂与未加工的或部分加工的神经毒素多肽结合的条件下接触，从而形成抗原-试剂复合物，并去除所形成的抗原-试剂复合物，从而获得含有加工的神经毒素多肽而不含未加工的或部分加工的神经毒素多肽的溶液。本发明还涉及上述抗体用于分离蛋白水解加工的神经毒素多肽与未加工的或部分加工的神经毒素多肽的用途。本发明涉及用于生产药物的方法，包括上述方法的步骤，以及将蛋白水解加工的神经毒素多肽配制成药物的其他步骤。此外，本发明涉及包含可通过上述方法可获得的蛋白水解加工的神经毒素多肽的组合物。肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)分别产生高效价的神经毒素，即肉毒毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素 (CNT)特异性结合神经元细胞，破坏神经递质释放。每种毒素都作为无活性的未加工的约 150kDa的单链蛋白质合成。翻译后加工涉及二硫键的形成和细菌蛋白酶的有限的蛋白水解作用(产生切口)。活性的双链神经毒素由两条链组成，由二硫键连接的约50kDa的N端轻链和约IOOkDa的重链。CNT结构上包括3个结构域，S卩，催化轻链、包含易位结构域(N端一半)和受体结合结构域(C端一半)的重链，参见Krieglstein 1990，Eur J Biochem 188， 39 ；Krieglstein 1991, Eur T Biochem202,41；Krieglstein 1994， J Protein Chem 13， 49。肉毒梭菌分泌7种抗原性不同的血清型，命名为肉毒杆菌神经毒素(BoNT)A至G。 所有的血清型与由破伤风梭菌分泌的相关的破伤风神经毒素(TeNT)，都是Si2+-内切蛋白酶，通过切割SNARE蛋白来阻断突触的胞吐。CNT导致在肉毒中毒和破伤风中可见的弛缓性肌肉麻痹，见 Fischer 2007，PNAS 104,10447。不论其毒性效应，肉毒杆菌毒素复合物已用作多种疾病的治疗剂。肉毒杆菌毒素A型血清型已于1989年被美国批准用于人类用途，治疗斜视、眼睑痉挛和其他病症。其可作为肉毒杆菌毒素A蛋白制剂商购，例如商标名BOTOX(Allergan Inc)、商标名 DYSP0RT(Ipsen Ltd)。对于治疗应用，复合物被直接注射到待治疗的肌肉中。在生理pH下， 毒素从蛋白质复合物中释放，产生所希望的药理学作用。不含复合蛋白质的改良的BoNT/A 制剂可以商标名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)获得。肉毒杆菌毒素的效应只是暂时的，这是维持治疗效果需要重复施用肉毒杆菌毒素的原因。梭菌神经毒素减弱随意肌肌力，是斜视、灶性张力障碍包括颈肌张力障碍和良性自发性睑痉挛的有效疗法。其还进一步表现出缓解偏侧面肌痉挛和局部痉挛，并且对广泛的其他适应症有效，例如胃肠道功能障碍、多汗和美容纹校正，见Jost 2007, Drugs 67， 669。为了生产梭菌神经毒素，对含神经毒素的发酵溶液的纯化是特别重要的。在本上下文中，通常在不同的沉淀和提取步骤后使用浓缩步骤和其他不同的层析步骤，从而获得纯化的神经毒素，见 DasGupta 1984, Toxicon 22,415 ；Sathyamoorthy 1985， J Biol Chemistry 260,10461.目前，可获得的神经毒素制剂除理想的活性(加工的)神经毒素外， 还包括蛋白水解未加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽。蛋白水解未加工的前体或部分加工的多肽仅在少数氨基酸的序列上不同于活性(加工的)神经毒素多肽。因此，基于其化学和物理性质它们是难以区分的。另一方面，蛋白水解未加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽占总蛋白质的比例在此类制剂中仍然是显著的。所述比例是由于生物学系统，并且是由生物合成和发酵过程的条件决定的。因而，神经毒素制剂中不需要的蛋白水解未加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽的量是预先确定的，且目前是难以降低的。用于降低未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽，以及从而改善神经毒素制剂的质量的的手段和方法是非常必需但仍不可得的。因而，本发明潜在的技术问题可视为通过满足上述需要，提供改善神经毒素多肽生产的手段和方法。所述技术问题是由权利要求和下文表征的实施方案解决的。本发明涉及特异性结合由具有如SEQ ID NO :1_16的任一项所示氨基酸序列的肽组成的表位的抗体。本文所用的术语“抗体”涵盖了单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、人的、人源化的、灵长类化的或嵌合的抗体、双特异性抗体、合成抗体、化学或酶促修饰的衍生物、任意所述抗体的片段或由天然存在的和/或化学修饰的核酸组成的适体。所述抗体的片段包括 F(ab' )2、F(ab)、Fv或scFv片段，或任意这类片段的化学或酶促修饰的衍生物。本发明的抗体应该特异性结合由上述肽组成的表位，如果所述肽包含在部分加工的或未加工的神经毒素多肽之内。根据本发明的术语“表位”涉及被本发明的抗体识别的抗原决定簇。其由具有如 SEQ ID NO :1-16的任一项所示氨基酸序列的肽组成。在本发明的一个方面，前述表位代表了这样的肽，所述肽的侧翼是神经毒素加工酶的切割位点或覆盖了所述切割位点，见下表1 和2。在本发明的一个方面，表位包含在蛋白水解未加工的神经毒素多肽或在部分加工的神经毒素多肽中。部分加工的神经毒素多肽可以是用SEQ ID NO :1-8的任一项所示肽序列延伸的神经毒素多肽的轻链，或者是用SEQ ID NO :1-8的任一项所示肽序列延伸的神经毒素多肽的重链。由于存在所述表位，未加工的或部分加工的神经毒素多肽可以被抗体特异性的结合。表1 神经毒素血清型的表位和全长多肽的氨基酸序列
权利要求
1.特异性结合由具有SEQID NO :1至16所示氨基酸序列的肽组成的表位的抗体。
2.权利要求1的抗体，其是单克隆或多克隆抗体。
3.权利要求1的抗体，其中所述表位包含在蛋白水解未加工的或部分加工的神经毒素多肽中。
4.权利要求3的抗体，其中所述神经毒素多肽来自梭菌属。
5.生产特异性结合未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽的抗体的方法，包括步骤a)将来自用包含SEQID NO :25所示的氨基酸序列的肽免疫原免疫过的非人动物的多克隆抗血清与具有SEQ ID NO :25的肽在允许形成包含前述肽和特异性结合未加工的或部分加工的神经毒素多肽的抗体的复合物的条件下接触；b)从抗血清中去除步骤a)中形成的复合物；和c)从所述复合物中释放与未加工的或部分加工的神经毒素多肽特异性结合的抗体。
6.权利要求5的方法，其中所述方法在步骤a)之前进一步包括步骤i)将所述来自用包含SEQ ID NO :25所示的氨基酸序列的肽免疫原免疫过的非人动物的多克隆抗血清与下列捕获肽SLD、LDK和YNK在如下条件下接触，所述条件允许形成包含多克隆抗血清中包含的非特异性抗体和捕获肽的捕获复合物；和 )从多克隆抗血清中去除捕获复合物。
7.权利要求5或6的方法，其中所述免疫原还包含KLH。
8.权利要求7的方法，其中所述KLH通过接头Ν-[γ-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)与具有SEQ ID NO 25的肽连接。
9.权利要求5-8任一项的方法，其中步骤a)至c)是通过亲和层析进行的。
10.权利要求6-9任一项的方法，其中步骤i)至ii)是通过亲和层析进行的。
11.可通过权利要求5-10任一项的方法获得的抗体。
12.权利要求11的抗体，其是多克隆抗体。
13.权利要求1_4、11或12任一项的抗体，其中所述抗体与固相支持体偶联。
14.权利要求1-4或11-13任一项的抗体的用途，用于从加工的神经毒素多肽中去除部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽。
15.权利要求1-4或11-13任一项的抗体的用途，用于检测样品中部分加工的和/或未加工的肉毒杆菌A型神经毒素(BoNT/A)。
16.用于生产加工的神经毒素多肽的方法，包括步骤a)将含有加工的和部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽的混合物的溶液与权利要求1-4或11-13的抗体在允许所述抗体与未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽结合的条件下接触，从而形成包含所述抗体和部分加工的或未加工的神经毒素多肽的复合物， 和b)去除步骤a)中形成的所述复合物，从而获得含有加工的神经毒素多肽且不含未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽的溶液。
17.权利要求16的方法，其中步骤a)和b)是通过亲和层析进行的。
18.权利要求16或17的方法，其中所述方法还包括离子交换层析。
19.用于生产药物的方法，包括权利要求16-18任一项方法的步骤以及将所述溶液配制成药物的另一步骤，所述溶液含有加工的神经毒素多肽且不含未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽。
20.包含可通过权利要求16-18任一项的方法获得的蛋白水解加工的神经毒素多肽的组合物。
全文摘要
本发明涉及特异性结合未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽的抗体，或者特异性结合由具有如SEQ ID NO1-16任一项所示氨基酸序列的肽组成的表位的抗体，并涉及生产此类抗体的方法。此外，本发明涉及包含加工的神经毒素多肽的组合物，所述组合物不含未加工的或部分加工的神经毒素多肽，以及基于本发明的抗体，生产所述神经毒素多肽的方法。本发明还涉及前述抗体用于分离加工的神经毒素多肽与未加工的或部分加工的神经毒素多肽，或者用于测定未加工的或部分加工的神经毒素多肽的用途。本发明涉及生产药物的方法。
文档编号C07K14/33GK102325792SQ201080008525
公开日2012年1月18日 申请日期2010年2月17日 优先权日2009年2月19日
发明者C·布林, H·V·泰勒, J·弗里德里希, K-H·艾泽勒, M·普法伊尔 申请人:莫茨制药有限及两合公司