专利名称：具有降低的bmp拮抗剂敏感性的骨形成蛋白2(bmp2)变体的制作方法
具有降低的BMP拮抗剂敏感性的骨形成蛋白2(BMP2)变体本发明的目的是取代骨形成蛋白2 (Bone Morphogenic Protein 2，BMP2)的中央残基和结构域，其对于BMP2与其抑制剂的特异性相互作用最为重要，所述抑制剂例如头蛋白(NOGGIN)。这些改变的目的是将该蛋白改变为具有增强的生物活性的拮抗剂抗性的变体。新蛋白可用于BMP相关的疾病或病症。骨形成蛋白(BMPs)和相关的生长与分化因子(Growth & Differentiation Factors,⑶Fs)是系统发生上保守的信号蛋白，其属于转化生长因子(Transforming Growth Factor，TGF) β超家族。最初确定其功能为诱导骨，随后显示其参与身体形态形成(body patterning)禾口形态建成(morphogenesis)的多个方面(Kishigami S, Mishina YQ005)BMP 信号和早期胚胎图式形成(BMP signaling and early embryonic patterning).细胞因子和生长因子的评论(Cytokine Growth Factor Rev) 16 :265-278.)。 迄今，已经识别了超过20种不同的BMP，其在胚胎发育和组织内稳态过程中具有不同的时空表达情况及不同的功能。尽管它们功能不同，但所有BMI^s具有相同的信号机制。它们被翻译为由前结构域构成的前体蛋白，其在枯草杆菌蛋白酶样前体蛋白转化酶家族成员的特异切割后蛋白水解释放。高度保守的成熟结构域以七个半胱氨酸(Cys)残基为特征，其中六个形成胞内Cys结(Cys knot)，而七个Cys中的第四个对于骨形成蛋白的二聚化是重要的。骨形成蛋白是分泌的肽，以同源或异源二聚体存在，与两种主要类型的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体——I型和II型受体结合。骨形成蛋白与预先形成的异源聚体受体 (heteromeric receptor)复合物结合，导致SMAD和其他胞内途径的活化。BMP信号由大量的拮抗剂精确调节，它们在细胞外、膜水平上以及细胞内起作用。越来越多与骨形成蛋白结合进而阻止受体活化的胞外拮抗剂得到鉴别。这些拮抗剂包括头蛋白(Noggin，NOG)、腱蛋白(Chordin，CHRD)、CHRD 样蛋白(CHRD-like proteins, CHRDL)和包括成神经细胞瘤中差异筛选的基因异常(Differential screening-selected gene Aberrant in Neuroblastoma, DAN)的 DAN 家族、赛伯乐 1 (Cerberus 1，CER1)、COCO、 与 DAN 和 CER 相关蛋白(Protein Related to DAN and CER，PRDC)、戈兰林(Gremlin) (GREM)、子宫致敏相关基因(Uterine Sensitization-Associated Gene 1，USAG1)、硬化蛋白(Sclerostin, S0ST)、卵泡抑素(Follistatin, FST)、FST 样蛋白(FST-like proteins, FSTL)、生长与分化因子相关血清蛋白 1 (Growth & differentiation factor-Associated Serum Protein 1，GASP1)和扭曲原肠形成(Twisted Gastrulation) (TffSG) (Yanagita M 000 BMP拮抗剂它们在发育和病理生理学相关方面的用途(BMP antagonists their roles in development and involvement in pathophysiology).细胞因子禾口生长因子的评论(Cytokine Growth Factor Rev) 16 :309-317.)。所述抑制剂表现出不同的表达模式， 因此很可能在体内有不同的生物学作用。此外，拮抗剂对各种骨形成蛋白以及其他因子具有不同的亲和力。例如，NOG以高亲和力与BMP2、BMP4、⑶F5及⑶F6结合，但对于BMP7却只具有低亲和力。另一方面，最初FST被认为是激活素(Activins)(ACVs)的拮抗剂，但也发现它结合骨形成蛋白。各种BMP拮抗剂可能与BMP分子中相似的结构域相互作用，已知 NOG 与 CER、GREM1 及 DAN 竞争结合 BMP2(Canalis Ε,Economides AN,Gazzerro E (2003)骨形成蛋白、它们的拮抗齐Ll禾口骨骼(Bone morphogenetic proteins, their antagonists, and the skeleton).内分泌物评价(Endocr Rev) 24 :218-235.)。还发现SOST具有多效作用 (pleiotrophic effects)，一方面作为BMP拮抗剂阻断BMP活性，另一方面，也结合并中和 NOG 的活性，导致BMP 活性的激活(Winkler DG, Yu C, Geoghegan JC, Ojala Eff, Skonier JE, Shpektor D, Sutherland MK, Latham JA. 2004头蛋白和硬化蛋白骨形成蛋白拮抗剂形成互助才￠$!1 复合物(Noggin and sclerostin bone morphogenetic protein antagonists form a mutually inhibitory complex).生物化学杂志(J Biol Chem) 279 (35) :36四3_8)。因此，大量不同的骨形成蛋白与大致相同数量的胞外拮抗剂旗鼓相当，但是还不清楚其生物学重要性的详尽知识。目前为止，已获得至少两个骨形成蛋白与拮抗剂形成的复合物中的三维结构(BMP7-N0G(PDB :1M4U)，以及BMP-2与Crossveinless_2的C型第一冯·威利布兰德病结构域(PDB :3BK3) (The First Von Willebrand Domain Type C Of Crossveinless-2 (PDB :3BK3))。这些结构提供了物理上相互作用位点的重要信息，但没有揭示在生物学上哪些氨基酸对相互作用是关键的。只有少数拮抗剂，如NOG、GREMU FST和 S0ST，得到了对它们在骨骼发育和再生中的功能的研究。通过Nog基因敲除小鼠的研究表明，NOG在软骨内骨化中具有核心作用。这些小鼠显示出所有软骨原基(cartilaginous anlagen)和一定数量的其他神经管的大规模扩张，以及脑缺陷。通过指关节粘连和多个骨性愈合(多发性关节融合)综合征患者中NOG突变的鉴定，显示出NOG对关节发育的重要性。以骨形成增加为特征的两种疾病——硬化性骨化病(sclerosteosis)和范布切姆病 (Van Buchem disease)的患者中SOST发生了突变(Kornak U, Mundlos S.骨骼的遗传紊乱发育途径(Genetic disorders of the skeleton -.a developmental approach).美国人类遗传学杂志(Am J Hum Genet.) 2003Sep ；73 (3) :447-74.)。自从他们发现了这些，就打算利用骨形成蛋白的骨诱导性质来促进骨折愈合过程中的骨生成或者切除术后的骨再生。然而，在体外和动物模型中骨形成蛋白在诱导骨中的高潜能只有部分能在人类患者中再现(Groeneveld，Ε. H. and Ε. H. Burger. 2000.在人骨再生中的骨形成蛋白(Bone morphogenetic proteins in human bone regeneration).内分泌学欧洲杂志(Eur J Endocrinol) 142 :9-21. )。BMP效应可能由几种因素调节，比如生物利用度、稳定性或组织中抑制骨形成蛋白的局部相互作用因子。本发明的目的是克服或减轻现有技术中的一个或多个问题。本发明的目的特别是提供了具有BMP2活性的抗头蛋白(Noggin)的肽。根据第一个方面，本发明提供了分离的肽，其包含具有与具有SEQ ID No. 1的成熟人BMP2相比至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列或者由具有与具有SEQ ID No. 1的成熟人BMP2相比至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列组成，其特征在于，所述的氨基酸序列包含至少两个氨基酸取代，其中第一氨基酸取代发生在相应于SEQ ID No. 1的N59、S88、E94、 V99、KlOl和/或N102的位置。根据第二个方面，本发明提供了分离的核酸，其特征在于，所述的核酸包含i)编码本发明的分离的肽的核酸序列；或ii)在标准条件下与编码本发明的分离的肽的核酸杂交的核酸序列。令人惊讶地发现，本发明的分离的肽显示出BMP2活性，但实质上却耐受BMP2的天然拮抗剂Noggin的抑制作用。本发明的分离的肽特征在于，对通过Noggin的抑制作用的敏感性降低，在机体中，尤其是在人体中，比天然产生的BMP2更稳定，和/或具有改进或改变的生物活性。有趣的是，已经发现BMP2的C-端区域至少两个氨基酸的取代导致分离的肽实质上耐受通过Noggin的抑制作用，同时基本上保持BMP2的生物活性。此处使用的术语“肽”包括包含由通过肽键连接自然和/或人工氨基酸形成的直链的任何分子。因此，“肽”的表述，包括寡肽、多肽和/或蛋白质片段，以及整个蛋白质，其中所述肽的一个或多个氨基酸可以被修饰。此处指代特定氨基酸是基于氨基酸单字母代码。“分离的”肽实质上是区别于其他肽分子的肽，其他肽分子存在于分离的肽的天然来源中(例如，天然来源的蛋白质组的其他多肽)。例如，重组表达的肽被认为是分离的。 通过人为干预而改变，或者通过并非其天然来源的生物表达的肽也被认为是分离的。此外， “分离的”肽，可以从与它天然相关联的一些其他细胞物质，或重组技术生产时的培养基，或化学合成时的化学前体或其他化学物中分离出来。从“分离的肽”的定义中明确排除的是 自然产生的、未纯化的肽混合物或组合物、天然产生来源的全细胞制品(包括机械剪切或酶消化的全细胞制品)。本发明也涉及分离的核酸。本发明的核酸可以包括DNA、RNA、它们的混合物和/或它们的功能取代物，特别是 cDNA、基因组DNA和/或RNA，可全部或部分合成。本发明的核酸包含单链和/或全部或部分双链多核苷酸序列。术语“分离的”包含了所有这些可能性。对于本发明的目的，DNA序列是特定的，例如参照特定的SEQ ID No.，除非另有所指，相应的RNA(RNA equivalent)也包含在其中，其出现时用U替换T。本发明的核酸可以通过任何方法产生，包括基因组制备、 cDNA制备、体外合成、PCR、RT-PCR和/或在体外或体内转录。“分离的”核酸实质上是与存在于所述核酸天然来源中的其他核酸分子相区别的核酸(例如，编码其他多肽的序列)。优选地，“分离的”核酸去除了在其天然复制子中天然位于所述核酸两翼(例如，位于所述核酸的5'和3'末端的序列)的一些序列。例如，克隆的核酸被认为是分离的。在不同的实施方式中，本发明的分离的核酸可以含有少于约51Λ、 4kb,3kb,2kbUkb,0. 5kb或0. Ikb的核苷酸序列，该序列天然位于所述核酸所来源的细胞的基因组DNA中核酸分子的两侧。如果已经被人为干预改变，或放置在非其天然位点的基因座或位置，或者其被导入细胞，核酸也被认为是分离的。此外，“分离的”核酸，如cDNA分子，可以从与其天然相关联的一些其他细胞物质，或重组技术生产时的培养基，或化学合成时的前体化学物或其他化学物中分离出来。明确从“分离的核酸”的定义中排除的是天然产生的染色体(如染色体分散(chromosome spreads))、基因组文库、以及天然产生来源的全细胞基因组DNA或全细胞RNA制品(包括机械剪切或消化酶的全细胞制品)。技术人员熟知遗传密码的简并性，允许一些不同的核酸序列编码相同的氨基酸序列，且对于确定给定的核酸序列是否编码本发明的分离的肽没有困难。本发明的分离的肽和/或核酸可以以分离的形式提供，例如，从它们的天然环境中纯化，优选基本上纯的和/或同质的形式和/或除了目的序列外去除或基本上去除所来源物种的肽、核酸和/或基因。本发明的分离的肽包含具有与具有SEQ ID No. 1的成熟人BMP2相比至少90% 氨基酸同一性的氨基酸序列或由具有与具有SEQ ID No. 1的成熟人BMP2相比至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列组成，优选地所述氨基酸同一性至少是93%，更加优选地至少 95 %，进一步更优选地至少98 %，最优选地至少99 %。优选的实施方式中，本发明的分离的肽包含具有与具有SEQ ID No. 11的全长人BMP2至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列或由具有与具有SEQ ID No. 11的全长人BMP2至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列组成，优选地所述氨基酸同一性至少是93 %，更加优选地至少95 %，进一步更优选地至少98 %，最优选地至少99%。所述同一性分别基于SEQ ID No. 1或SED ID No. 11的全长，通过忽略(排除)本发明的分离的肽中存在的至少两个氨基酸取代计算。登录号为NP_001 191且序列为SEQ ID No. 11的全长人BMP2蛋白(hBMP2)由396 个氨基酸组成。N-端氨基酸1至观2，其序列为SEQ ID No. 10的所谓前结构域，为了实现完全的加工，其在全长肽的加工过程中被切除，有活性的hBMP2，此处也称其为成熟hBMP2， 其序列为SEQ ID No. 1。因此，成熟hBMP2的氨基酸序列起始于全长hBMP2的第283位氨基酸(即氨基酸Q)，包含随后的113个氨基酸。本文中成熟hBMP2是指SEQ ID No. 1的氨基酸序列，其由完全加工的氨基酸序列组成，有活性的hBMP2全长为114个氨基酸。SEQ ID No. 1的第1个氨基酸即SEQ ID No. 11的第观3个氨基酸，第114个氨基酸即SEQ ID No. 11 的第396个氨基酸。下文中，特定的氨基酸或氨基酸位置通过首先以单字母代码指出hBMP2的相应的氨基酸，随后是以SEQ ID No. IN-端开始读向C-端方向的氨基酸序列中的位置编号的方式来指明。例如，SEQ ID No. IN-端的第1个氨基酸表示为Ql (与SEQ ID No. 11的Q283 — 致)，而SEQ ID No. IC-端最后1个氨基酸表示为Rl 14 (与SEQ ID No. 11的R396 —致)。由于历史原因，在本申请的实验部分，特定的氨基酸位置通过全长人BMP2的氨基酸序列SEQ ID No. 11从N-端开始读向C-端方向的位置编号来标明。通过简单地将全长BMP2(SEQ ID No. 11)的特定氨基酸或氨基酸位置数字减去观2，可以容易地转换成相对于成熟BMP2(SEQ ID No. 1)的氨基酸位置。例如SEQ ID No. 11的N341与SEQ ID No. 1的N59 —致。两个氨基酸序列之间的同一性或同源性理解为意味着各情形中在全序列长度范围内相应序列的同一性(本文中术语同一性和同源性互换使用)。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，序列以最优比较目标进行比对(例如为了与第二氨基酸或核酸序列进行最优比对，缺口(gap)可以被引入第一氨基酸或核酸序列)。两个序列间的同一性百分数是序列享有一致位置的数量的函数(例如，同源性％ =—致位置的#/位置的总计#X100)。可以使用数学算法来实现两个序列间同源性百分数的确定。优选地，用于比较两个序列的数学算法的非限制性例子是Karlin和Altschul算法(1990)美国科学院院刊(Proc. Natl. Acad. ScL USA) 87 :2洸4_68，修订形式如 Karlin 和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. ScL USA 90 :5873_77。这种算法并入了 Altschul，等人(1990)分子生物学杂志 (J. MoI. Biol.) 215 :403-10 的 NBLAST 和 XBLAST 程序。BLAST 核酸搜索可以通过 NBLAST 程序执行，分值=100，字长=12。BLAST蛋白搜索可以通过XBLAST程序执行，分值=50，字长=3。为了得到比较目的的缺口 (gapped)的比对，可以用如Altschul et al，(1997)核酸研究(Nucleic Acids Research) 25 (17) :3389-3402 描述的缺口 BLAST (gapped BLAST)。 当使用BLAST和缺口 BLAST程序时，可以采用相应程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。 可替代地，同一性或同源性的测定也可以通过使用软件包Bioedit(可获自http://VWW. mbio. ncsu. edu/BioEdit/bioedit. html)中默认设置的 ClustalW_Bioedit 算法(ThompsonJD et al. (1994)Nucleic Acids Res 22:4673-4680)来进行比较。优选地，本发明的分离的肽显示BMP2活性。本发明的分离的肽如果保留了至少 25%的野生型BMP2的活性，则归类该分离的肽显示了 BMP2活性，即，所述野生型BMP2的活性为加工后的活性，有活性的SEQ ID No. 1的BMP2。优选地，本发明的分离的肽具有至少 50%的野生型BMP2的活性；更优选地，至少75%;进一步优选地，至少85%;最优选地，至少 95%。BMP2活性可以通过很多不同的方法测定。只要在一个及同样测试(same test)中测定本发明的分离的肽的BMP2活性以及对照(有活性的人BMP2)的活性即可，BMP2活性测试的确切性质较不重要。技术人员熟知适合于测定BMP2活性的多种不同的测试。优选地通过使用鸡微团培养系统(chMM)测试来测定BMP2的活性。鸡微团培养系统(chMM)是软骨分化的体外模型(DeLise AM, Stringa Ε, Woodward WA, MeIIo MA, Tuan RS 2000 胚胎肢间充质微团培养作为软骨形成和软骨成熟的体外模型(Embryonic limb mesenchyme micromass culture as an in vitro model for chondrogenesis and cartilage maturation). 生物学方法(Methods Mol Biol.) 137 :359-75.) (Seemann P, Schwappacher R, Kjaer Kff, Krakow D,Lehmann K, Dawson K, Strieker S, Pohl J, Pl omicronger F, Staub E, NickelJ, Sebald W, Knaus P，Mundlos S. 2005在GDF5的受体相互作用位点激活和灭活突变引起 A2 型指关节丰占连或失fif旨(Activating and deactivating mutations in the receptor interaction site of GDF5 cause symphalangism or brachydactyly type A2).临床石if 究杂志(J Clin Invest. )2005 Sep ； 115 (9) :2373-81.)。此处，从鸡肢芽中制备的原代间充质细胞分化为软骨细胞。细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)的生成作为早期软骨细胞产生的标志，且可以通过3至7天孵育后进行阿尔辛蓝(Alcian blue)染色得到定量。 为了测试该系统中的特定基因，可以用掺入了感兴趣基因的复制型禽肉瘤(implication competent adenovirus, RCAS)病毒感染所述细胞。已知chMM中hBMP2的过表达会引起细胞增殖以及软骨基质显著产生(Duprez DM,Coltey Μ,Amthor H,Brickell PM,Tickle C. 1996 骨形成蛋白-2(BMPD在鸡肢芽培养中抑制肌发育并促进软骨发育(Bone morphogenetic protein-2(BMP-2)inhibits muscle development and promotes cartilage formation in chick limb bud cultures).发育生物学(Dev Biol. )Mar 15 ；174(2) :448-52.)。相比之下，Noggin和hBMP2的共表达则引起所述分化效应的完全抑制。除了与SEQ ID No. 1和/或SEQ ID No. 11比较的序列同一性外，本发明的分离的肽进一步的特征在于所述的氨基酸序列包含至少两个氨基酸取代，其中第一氨基酸取代发生在相应于SEQ ID No. 1的N59、S88、E94、V99、KlOl和/或附02的位置。此处所述的术语氨基酸取代是指给定位置特定氨基酸的缺失和/或替换。特别优选的方式，术语氨基酸取代可以理解为仅仅是指给定位置特定氨基酸的替换。为了表达具体，每个取代至少以被取代的氨基酸类型来描述，优选地以单字母代码描述，并且给出所述的氨基酸基于SEQ ID No. 1的精确位置。特定取代可进一步通过指出用于替换被取代氨基酸的氨基酸命名来明确描述。任何情况下，特定取代只有名称在位置数字之前的所述指定的氨基酸被取代。取代可能导致所述氨基酸从所述序列中缺失，正好一个其他的氨基酸替换所述氨基酸，和/或多于一个的其他氨基酸替换所述氨基酸，优选地，不超过三个其他氨基酸，更优选地，两个其他氨基酸替换所述氨基酸。优选地，本发明的分离的肽的特征在于所述的第一氨基酸取代选自N59K、N59T、N59V、N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、KlOlI、K101L、N102S、N102V、N102W 和 / 或 N102YH。更优选地，本发明的分离的肽包含在N59、E94、K101和/或附02位置的至少一个取代，最优选地在N59或m02位置。在另一更加优选的实施方式中，本发明的分离的肽的特征在于所述的第一氨基酸取代选自 N59K、N59T、N59V、N59E、E94P、K101I、K101L、N102S、N102V、N102W 和 / 或 N102YHo在另一优选的实施方式中，本发明的分离的肽其特征在于所述分离的肽包含第二氨基酸取代，其中所述第二氨基酸取代不同于第一氨基酸取代，并发生在相应于SEQ ID No. 1 的 D22、S24、V26、N29、D30、V33、A34、P36、G37、H39、F41、H44、P48、A52、D53、L55、N59、 S88、E94、V99、KlOl和/或附02的位置。更优选地，本发明的分离的肽的特征在于所述的第二氨基酸取代选自 D22R、D22S、D22H、S24G、S24H、S24E、S24Q、V26L、N29T、N29Q、D30A、 D30T、V33I、V33R、A34Y、A34D、P36K、P36R、P36S、G37T、H39A、F41N、H44D、P48S、A52N、D53A、 D53Y、L55M、N59K、N59T、N59V、N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、K101I、K101L、N102S、N102V、 N102W 和 / 或 m02YH。在另一优选的实施方式中，本发明的分离的肽的特征在于所述第二氨基酸取代发生在相应于 SEQ ID No. 1 的 D22、S24、N29、D30、V33、A34、P36、G37、D53、N59、S88、E94、V99、 KlOl和/或附02的位置。更优选地，本发明的分离的肽的特征在于所述的第二氨基酸取代选自 D22R、D22S、D22H、S24G、S24H、S24E、N29T、D30A、D30T、V33R、A34Y、A34D、P36K、P36R、 P36S、G37T、D53Y、N59K、N59T、N59V、N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、K101I、K101L、N102S、 N102V、N102W 和 / 或 N102YHo在另一优选的实施方式中，本发明的分离的肽的特征在于所述分离的肽包含第三氨基酸取代，其中所述的第三氨基酸取代不同于第一和第二氨基酸取代，且发生在相应于 SEQ ID No. 1 的 D22、S24、N29、D30、V33、A34、P36、G37、D53、N59、S88、E94、V99、K101 和 / 或 N102的位置。更优选地，本发明的分离的肽的特征在于所述的第三氨基酸取代选自D22R、 D22H、S24G、S24H、S24E、N29T、D30A、D30T、V33R、A34Y、A34D、P36K、P36R、P36S、G37T、D53Y、 N59K、N59T、N59V、N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、K101I、K101L、N102V、N102YH、N102S 和 / 或 N102W。在另一优选的实施方式中，本发明的分离的肽的特征在于所述分离的肽包含第四氨基酸取代，其中所述的第四氨基酸取代不同于第一、第二和第三氨基酸取代，且发生在相应于 SEQ ID No. 1 的 D22、S24、N29、D30、V33、A34、P36、G37、D53、N59、S88、E94、V99、K101 和/或附02的位置。更优选地，本发明的分离的肽的特征在于所述的第四氨基酸取代选自 D22R、D22H、S24G、S24H、S24E、N29T、D30A、D30T、V33R、A34Y、A34D, P36K、P36R、P36S、G37T、 D53Y、N59K、N59T、N59V、N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、KlOlI、K101L、N102V、N102YH、N102S 和/或m02W。本发明分离的肽可以包含下面的氨基酸序列或者由下面的氨基酸序列组成SEQ ID No. 2，其基于 SEQ ID No. 1 并且 N59K 和 V99T 取代；SEQ ID No. 3，其基于 SEQ ID No. 1 并且 N59K 和 m02YH 取代；SEQ ID No. 4，其基于 SEQ ID No. 1 并且 N59T 和 V99T 取代；SEQ ID No. 5，其基于 SEQ ID No. 1 并且 N59T 和 m02YH 取代；SEQ ID No. 6，其基于 SEQ ID No. 1 并且 V99T 和 m02YH 取代。
SEQIDNo.7，其基于SEQ ID No. 1并且N59T和S24E取代；
SEQIDNo.8，其基于SEQ ID No. 1并且N59K和P36K取代；
SEQIDNo.9，其基于 SEQ ID No.]_ 并且 N59K、N102YH 和 S24E 取代；
SEQIDNo.12，其基于SEQIDNo.11并且N59K和V99T取代；
SEQIDNo.13，其基于SEQIDNo.11并且N59K和N102YH取代；
SEQIDNo.14，其基于SEQIDNo.11并且N59T和V99T取代；
SEQIDNo.15，其基于SEQIDNo.11并且N59T和m02YH取代；
SEQIDNo.16，其基于SEQIDNo.11并且V99T和m02YH取代。
SEQIDNo.17，其基于SEQIDNo.11并且N59T和S24E取代；
SEQIDNo.18，其基于SEQIDNo.11并且N59K和P36K取代；和/或
SEQIDNo.19，其基于SEQIDNo.11 并且 N59K、N102YH 和 S24E 取代本发明的分离的肽除上面定义的至少两个氨基酸取代之外还可以包含其他的氨基酸取代。本发明的分离的肽可以含有进一步的修饰，例如改变蛋白质另外性质的突变。 这些性质可以包括BMP2活性、对Noggin和/或其他抑制剂或BMP2拮抗剂的抗性，以及诸如稳定性或者免疫原性，或者赋予或阻止翻译后修饰如聚乙二醇(PEGylation)化或糖基化的性质。本发明的分离的肽可以被共翻译或翻译后修饰，包括但不限于一个或更多个侧链或末端的合成衍生、糖基化、PEG化、循环排列(circular permutation)、环化 (cyclization)、融合蛋白质或蛋白质结构域，以及添加肽标记(tag)或标签(label)。本发明的分离的肽可以根据已知的方法制备。这些方法包括这些分离的肽的从头合成和/或由编码分离的肽的核酸表达本发明的分离的肽。在特别优选的方式中，通过表达本发明的分离的核酸来制备本发明的分离的肽。本发明也涉及分离的核酸，其包含编码本发明的分离的肽的核酸序列或由编码本发明的分离的肽的核酸序列组成，或者包含在标准条件下与编码本发明的分离的肽的核酸序列杂交的核酸序列或由在标准条件下与编码本发明的分离的肽的核酸序列杂交的核酸序列组成。术语标准杂交条件应该被广义地理解，意思是严格和/或略低严格杂交条件。该杂交条件在 Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T 等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual (分子克隆-A 实验室手册)，aid edition (第 2 版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港实验室出版社)，1989，第9. 31-9. 57页，或者现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley & Sons,纽约 (N. Y.) (1989),6. 3. 1-6. 3. 6中特别描述。例如，洗涤步骤中的条件可以选自那些低严格性限制(大约2XSSC，50°C )和高严格性限制(大约0.2父55(，501，优选65°0(20\55(: 0.3M柠檬酸钠、3M NaCl, pH 7.0)的条件范围内。此外，洗涤步骤中的温度可以从室温、大约22°C的低严格性条件，到大约65°C的更严格条件。盐浓度和温度两个参数可以同时变化，或者可以所述两个参数中的一个保持恒定，仅另一个变化。在杂交中可以使用变性剂， 例如甲酰胺或十二烷基硫酸钠(SDS)。在50%甲酰胺存在下的杂交优选地在42°C进行。杂交和洗涤步骤的一些示例性的条件如下(1)杂交条件例如a) 4 X SSC, 65"C ；或
b)6XSSC，0. 5% SDS,100y g/ml 变性的片段化的鲑鱼精 DNA，65°C ；或c)4XSSC，50% 甲酰胺，42°C ；或d)2X或4XSSC，50°C (低严格性条件)；或e)2X或4XSSC，30-40%甲酰胺，42°C (低严格性条件)，或f)6XSSC，45°C ；或，g) 0. 05M 磷酸钠缓冲液 pH 7. 0, 2mM EDTA, 1% BSA ^P 7% SDS。(2)洗涤步骤例如a)0. 1XSSC，65°C ；或b)0. 1XSSC，0. 5% SDS，68°C ；或c) 0. 1XSSC，0. 5% SDS，50% 甲酰胺，42°C ；或d)0. 2XSSC，0. 1% SDS，42°C ；或e)2XSSC,65°C (低严格性条件)，或f) 40mM 磷酸钠缓冲液 pH 7. 0,1% SDS, 2mM EDTA。本发明的分离的核酸可以根据本领域中已知的方法制备。优选的方式，本发明的分离的核酸，可以通过全部基因合成，或通过定点突变编码野生型或修饰的BMP的核酸来制备。可以利用的方法包括模板引导的连接(template-directed ligation)、递归 PCR(recursive PCR)、盒式诱变(cassette mutagenesis)、定点突变或其他本领域熟知的技术(参见例如Mhzhov等人.美国科学院院刊(PNAS) 93 :15012-15017(1996) ,Prodromou 和 Perl，蛋白质工程(Prot. Eng.) 5 :827-829(1992)、Jayaraman 和 Puccini，生物技术 (Biotechniques) 12 :392-398 (1992)，以及 Chalmers 等人·生物技术(Biotechniques) 30 249-252(2001))ο本发明的分离的核酸可以进一步包括向本发明的分离的核酸添加了另外的功能的另外的核酸序列。例如，这些另外的核酸序列可以包含允许本发明的分离的肽适当表达的核酸序列，且可以包含启动子序列、调节序列、终止信号、复制起点及诸如此类的序列。技术人员熟知这些功能的核酸序列，以及为了获得具有期望性质的核酸分子如何来排列它们。本发明也涉及表达本发明的分离的肽的转基因生物或细胞。优选地所述转基因生物或细胞的特征在于所述生物或细胞包含本发明的分离的核酸。因而，本发明涉及瞬时或稳定地转化或转染了至少一个分离的核酸或至少一个转基因表达盒或至少一个编码本发明的分离的肽的载体的转基因生物或细胞，或这些转基因生物或细胞的后代。此外，本发明涉及细胞、细胞培养物、组织和/或本发明的转基因生物的部分。为了本发明的目的，术语转基因生物应该理解为不仅包括瞬时或稳定地引入了本发明所述核酸的生物，也涉及这些生物的后代，而不考虑代的距离(generation distance)，例如，只要这些生物仍然包含本发明的核酸和/或表达本发明的分离的肽，第1代的后代和第X代的后代一样。优选地，转基因生物或细胞是原核或真核来源的，优选地，转基因生物是微生物。 优选的微生物是细菌、酵母、藻类或真菌。转化的生物或转化的细胞的制备需要向合适的宿主生物或细胞导入合适的 DNA。许多方法可用于此转化过程(也参见Keown等人.1990酶学方法(Methods in Enzymology) 185 :527-537)。因此，例如，所述DNA可以通过微注射或轰击DNA包被的微粒或纳米粒子而直接导入。所述细胞也可以通过化学方法渗透，例如用聚乙二醇，使得DNA可以通过扩散进入细胞。DNA还可以通过与其他含有DNA的单位例如小细胞(minicell)、细胞、溶酶体或脂质体的原生质体融合来进行。其他导入DNA的合适的方法是电穿孔，其中细胞通过电脉冲可逆地渗透。本发明也涉及本发明的分离的肽和/或本发明的分离的核酸在治疗疾病或病症中的应用，例如，治疗BMP-相关的疾病或病症，其中这些疾病或病症包括-骨、软骨、非矿化的骨骼或结缔组织的形成；-代谢性疾病，例如治疗代谢性骨疾病中骨量(bonemass)损失和/或增加的治疗 (US 5，674，844)；在诸如破裂、骨折和/或撕裂的损伤部位处的骨和/或软骨更换或修复(US 5，733，878)，例如脊柱或椎骨修复；牙周组织再生(US5，733，878)；肝再生(US5，849，686)；慢性肾功能衰竭(US 6，861，404)；促进中枢神经系统缺血或外伤后功能恢复(US 6，407，060)；树枝状生长(US6，949，505)；神经细胞粘连(neuralcell adhesion) (US 6，800，603)；帕金森症(US6，506，729)。此处所使用的术语“治疗”，是指扭转、减轻或抑制了疾病、紊乱或病症的进程，或一个或更多个该疾病、紊乱或病症的症状。本文所用“治疗”，也可以指与未被治疗的对照群体相比，或与相同的哺乳动物的治疗前相比，降低了哺乳动物中疾病、紊乱或病症发生的可能性或几率。例如，如本文所述，“治疗”可以是指预防疾病、紊乱或病症，且可以包括推迟或预防疾病、紊乱或病症的发作，或推迟或预防与这些疾病、紊乱或病症相关的症状。如本文所述，“治疗”还可以是指在哺乳动物遭受疾病、紊乱或病症的折磨之前，减轻疾病、紊乱或病症或与这些疾病、紊乱或病症相关的症状的严重性。所述在折磨之前预防或减轻疾病、 紊乱或病症的严重性，与向不在用药时间的、承受疾病、紊乱或病症的折磨的患者给药如本文所述的本发明的组合物有关。此处使用的“治疗”，也可以指预防疾病、紊乱或病症，或者一个或更多个与所述疾病、紊乱或病症相关的那些症状的复发。本文使用的术语“治疗”和 “治疗地”，是指如上面所定义的“治疗”的行为。本发明的肽和/或分离的核酸可以用于制备药物，优选地制备治疗BMP相关的疾病或病症的药物，其中这些疾病或病症包括骨、软骨、非矿化的骨骼或结缔组织的形成； 代谢性疾病；在诸如破裂、骨折和/或撕裂的损伤部位处的骨和/或软骨更换或修复；牙周组织再生；肝再生；慢性肾功能衰竭；促进中枢神经系统缺血或外伤后功能恢复；树枝状生长；神经细胞粘连；帕金森症。本发明还涉及包含本发明的肽和/或分离的核酸以及可选地一种或更多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。当用于人类治疗时，本发明的分离的肽或核酸和/或其药学上可接受盐类通常以与一种或更多种药学上可接受的赋形剂相结合的制剂的形式给药。术语“赋形剂”此处用来描述除了本发明的化合物之外的任何成分。赋形剂的选择将很大程度上依赖于所给药的特定方式。
本发明的化合物可以口服给药。口服给药可以包括吞咽，以便化合物进入消化道， 或者采用口腔或舌下给药，由此化合物直接从口进入血流。适于口服给药的制剂包括诸如片剂的固体制剂；含有微粒、液体或粉末的胶囊；锭剂(包括充液的)；以及咀嚼物；多微粒及纳米微粒；凝胶；固体溶液(solid solutions)；脂质体；膜、胚珠(ovule)、喷雾剂和液体制剂。液体制剂包括悬液、溶液、糖浆和酏剂。这些制剂可以作为软胶囊或硬胶囊的填充剂，且通常包含载体，例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、或合适的油，以及一种或更多种乳化剂和/或悬浮剂。液体制剂也可以通过固体重建来制备，例如从囊剂 (sachet)0本发明的化合物也可以以诸如本领域中所描述的那些快速溶解、快速崩解剂型使用。对于片剂剂型，根据剂量，所述药物可以占到剂型的1重量％至80重量％，更通常地，占到剂型的5重量％至60重量％。除了药物，片剂通常含有崩解剂。崩解剂的例子包括羟基乙酸淀粉钠(sodium starch glycolate)、羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose)、羧甲基纤维素 丐(calcium carboxymethyl cellulose)、交联羧甲基纤维素钠(croscarmellose Sodium)、交联聚维酮(crospovidone)、聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinylpyrrolidone)、甲基纤维素、微晶纤维素、低烷基_取代羟丙基纤维素、淀粉、预胶化淀粉(pregelatinised-starch)和海藻酸钠。一般来说，崩解剂占剂型的1重量％至 25重量％，优选5重量％至20重量％。粘合剂通常用于将粘结物(cohesive qualities)制成片剂。合适的粘合剂包括微晶纤维素、明胶、糖、聚乙二醇、天然和合成胶、聚乙烯吡咯烷酮、预胶化淀粉、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。片剂中还可以包含稀释剂，例如乳糖(一水合乳糖，喷雾干燥的一水合乳糖，无水乳糖等等)、甘露醇、木糖醇、葡萄糖(dextrose)、蔗糖、山梨醇、微晶纤维素、淀粉和磷酸氢钙二水合物(dibasic calcium phosphate dihydrate)。片剂也可以可选地包括表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠和聚山梨醇酯80，以及诸如二氧化硅和滑石等的助流剂。目前，表面活性剂可以占片剂的0. 2重量％至5重量％， 且助流剂可以占片剂的0. 2重量％至1重量％。片剂中还可能含有润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酰延胡索酸钠 (sodium stearyl fumarate)、以及硬脂酸镁与十二烷基硫酸钠的混合物。润滑剂一般占片剂的0. 25重量％至10重量％，优选占片剂的0. 5重量％至3重量％。其他可能的成分，包括抗氧化剂、色素、调味剂、防腐剂和味道掩盖剂。示例性的片剂含有高达约80%的药物，约10重量％至约90重量％的粘合剂，约0 重量％至约85重量％的稀释剂，约2重量％至约10重量％的崩解剂，以及约0. 25重量％ 至约10重量％的润滑剂。片剂混合物可以被直接压制或者借助辊轮压制形成片剂。片剂混合物或片剂混合物的部分在制成片剂前可以是湿的、干的或熔化颗粒状的、融化凝结的或挤出的。最终的制剂可以包含一层或更多层，且可以被包衣或未被包衣；其甚至可以是装入胶囊的。片剂的配制在本领域是标准的。人类使用的一次性的口腔膜(consumable oral film)通常是柔韧的水溶性或水膨胀性的薄膜剂型，其可迅速溶解或粘膜粘附，并且通常包含分离的肽或核酸、成膜聚合物、粘合剂、溶剂、保湿剂、增塑剂、稳定剂或乳化剂、粘度改性剂和溶剂。制剂的一些组分可以发挥不止一个功能。本发明分离的肽或核酸可以是水溶性的或者不溶性的。水溶性化合物通常包含1 重量％至80重量％，更通常地包含20重量％至50重量的所述溶质。低溶解性的化合物可以包含较高比例的所述成分(composition)，通常可包含高达88重量％的所述溶质。可选地，本发明分离的肽或核酸可以是多微粒小珠(bead)形式。成膜聚合物，可以选自天然多糖、蛋白质或人工合成的水胶体(hydrocolloid)，通常存在的范围是0. 01重量％至99重量％，更典型地，范围是30重量％至80重量％。其他可能的成分包括抗氧化剂、着色剂、调味剂和增味剂、防腐剂、唾液刺激剂、 冷却剂、共助溶剂(co-solvents)(包括油)、软化剂、膨化剂(bulking agent)、防沫剂、表面活性剂和味道掩盖剂。根据本发明的薄膜通常可以通过蒸发干燥涂覆在可剥离的背后支持物或纸张上的薄的含水膜来制备。这可在烘箱或管道中完成，通常是复合式涂布干燥机(coater dryer)，或冷冻干燥或真空。用于口服给药的固体制剂可以配制成即时和/或改性控制释放(modified release)。改性控制释放制剂包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程序化释放。对本发明目的合适的改性控制释放制剂描述于US 6，106，864。其他合适的释放技术的细节，如高能量分散和渗透以及包覆颗粒能在本领域找到。WO 00/35298中描述了利用口香糖实现改性控制释放。本发明的化合物也可以被直接给药入血流、肌肉，或内部器官。肠胃外给药的合适方式包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内和皮下。肠胃外给药的合适设备包括针(包括微针)注射器、无针注射器和输液技术。肠胃外制剂通常是水性溶液，其可以含有赋形剂，如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选地PH值从3到9)，但对于某些应用，它们可能更适合配制成无菌的非水溶液或以干燥的形式，用来与合适的赋形物(vehicle)，如无菌的无热原水，一起使用。肠胃外制剂通过借助本领域技术人员所熟知的标准制药技术，在无菌条件下，例如借助冷冻真空干燥法，可以容易地制备。可以通过使用合适的配制技术，例如加入溶解性增强剂，来提高用于制备肠胃外溶液的本发明的分离的肽或核酸的溶解性。肠胃外给药的制剂，可以配制成即时和/或改性控制释放。改性控释制剂制剂包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程序化释放。因此本发明的化合物可以配制成固体、半固体或者触变液体，以作为植入的库(Cbpot)给药，该库提供活性化合物的控制释放。这种制剂的实例包括药物涂层支架和PGLA聚(dl-乳酸-乙醇酸)酸(PGLA) (PGLApoly (dl-lactic-coglycolic) acid, PGLA)微球。本发明的化合物，也可以局部地施用于皮肤或粘膜，也就是皮肤地或经皮地给药。 用于该目的的典型制剂包括凝胶、水凝胶、乳液、溶液、霜、软膏(Ointment)、喷粉(dusting powder)、敷料、泡沫、薄膜、皮肤贴片(skin patch)、晶片(wafer)、植入物、海绵、纤维，绷带和微乳液。也可以用脂质体。典型的载体包括酒精(alcohol)、水、矿物油、液体凡士林、白凡士林、甘油、聚乙二醇和丙二醇。也可以包括渗透促进剂。局部给药的其他方式包括通过电穿孔递送、离子导入、超声透入 (phonophoresis)、超声促渗(sonophoresis)和微针或无针(如 Powderject(TM)， Bioject(TM)等)注射。局部给药的制剂，可以配制成即时和/或改性控制释放。改性控制释放制剂包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程序化释放。本发明的化合物也可以鼻内或吸入给药，在使用或不使用合适的推进剂，如1，1， 1,2-四氟乙烷(1,1,1, 2-tetrafluoroethane)或 1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(1,1,1,2,3, 3, 3-heptaf luoropropane)的情况下，通常以来自干粉吸入器的干粉的形式(单独或作为混合物，例如，与乳糖的干燥混合物，或作为混合的组分颗粒，例如，与诸如磷酸卵磷脂的磷脂混合)，或者作为来自于加压容器、泵、喷雾、雾化器(优选使用电液压动力产生细水雾的雾化器)或喷雾器的气溶胶喷射的形式给药。对于鼻腔内使用，粉末可以包含生物黏附剂， 例如，壳聚糖或环糊精。装有本发明分离的肽或核酸的溶液或悬液的压力容器、泵、喷雾、雾化器或喷雾器包含例如，乙醇、含水乙醇或合适的用于分散、增溶或延长活性释放的替代剂，作为溶剂的推进剂和可选的表面活性剂，诸如山梨醇三油酸酯、油酸或低聚乳酸。吸入/鼻内给药制剂可以借助于例如聚乙交酯-丙交酯(PGLA)，配制成即时和/ 或改性控制释放。改性控制释放包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程序化释放。为了提高其溶解度、溶出速率、味道掩盖性、生物利用度和/或使用的稳定性，在上面提到的任何方式的给药中，本发明的化合物可以结合水溶性高分子实体，例如环糊精及其合适的衍生物或包含聚乙二醇的聚合物。已经发现，例如药物-环糊精复合体通常对于大部分的剂型和给药途径是有用的，包埋以及非包埋复合体均可以使用。作为与药物直接络合的备选物，环糊精可以用作为辅助添加剂，即作为载体、稀释剂或增溶剂。最常用于这些目的的是α-、β-和Υ-环糊精，其实例可以在国际专利公开号为WO 91/11172、WO 94/02518和WO 98/55148的专利中找到。施用给人类患者，本发明的化合物的每日总剂量通常在0. OOlmg至5000mg的范围内，当然，这根据给药的方式而定。例如，静脉注射每日剂量可能只需要0. OOlmg至40mg，每日总剂量可以以单次或分次的剂量进行，并且该剂量可以根据医生的考虑，落在此处给出的通常范围以外。这些剂量基于体重为约65kg至70kg的一般人类患者。医生将能够容易地确定体重落入该范围外的患者，例如婴儿和老年人的剂量。另一方面，本发明提供了治疗BMP相关的疾病或病症的方法，其中这些疾病或病症包括骨、软骨、非矿化的骨骼或结缔组织的形成，代谢性疾病，在诸如破裂、骨折和/或撕裂的损伤部位处的骨和/或软骨更换或修复，牙周组织再生，肝再生，慢性肾功能衰竭， 促进中枢神经系统缺血或外伤后功能恢复，树枝状生长，神经细胞粘连，帕金森症，其特征在于对需要上述治疗的受试者给药有效剂量的本发明的分离的肽和/或本发明的分离的核酸，可选地与一种或更多种药学上可接受的赋形剂同时给药。根据本发明，分离的肽、分离的核酸和/或包含它们作为活性成分的药物，优选地以有效剂量给药。“有效剂量”是给药至患者活性成分，得到对目的疾病可测量的治疗效果的剂量。在本发明中，有效剂量是给药至患有上述一种或多种特定疾病或病症的患者所述分离的肽或核酸，得到上述的特定疾病或病症的治疗效果的剂量。优选地，每次治疗或给药，所述的分离的肽或核酸以不超过5mg/kg体重的剂量施用。特别地，本发明所述的分离的肽或核酸，以每次治疗或给药lng/kg体重至lg/kg体重的剂量施用，优选地，以每次治疗或给药0. 01 μ g/kg体重至5000 μ g/kg体重施用。为了防止出现急性副作用，建议所述分离的肽或核酸以每日累积剂量最大不超过10mg/kg体重给药。在下面的实例部分，将借助于附图和实施例更详细地解释本发明。贯穿实验部分和附图，特定的氨基酸和氨基酸位置是相对于SEQ ID No. 11提及的。这些氨基酸和氨基酸位置可以简单地通过从位置数字中减去观2，容易地转换成相对于 SEQ ID No. 1的氨基酸和氨基酸位置。附图
图1表示chMM实验中，在存在或不存在Noggin的情况下，具有Ν384 1取代的BMP2 对软骨形成的影响；(A)表示在鸡微团中阿尔辛蓝染色的间质前体细胞的软骨胞外基质； (B)显示量化结果。图2表示chMM实验中，在存在或不存在Noggin的情况下，具有S306E+N341T取代的BMP2对软骨形成的影响；(A)表示在鸡微团中阿尔辛蓝染色的间质前体细胞的软骨胞外基质；(B)显示量化结果。图3表示chMM实验中，在存在或不存在Noggin的情况下，具有P318K+N341K取代的BMP2对软骨形成的影响；(A)表示在鸡微团中阿尔辛蓝染色的间质前体细胞的软骨胞外基质；(B)显示量化结果。图4表示chMM实验中，在存在或不存在Noggin的情况下，具有N341T+N384YH取代的BMP2对软骨形成的影响；(A)表示在鸡微团中阿尔辛蓝染色的间质前体细胞的软骨胞外基质；(B)显示量化结果。图5表示chMM实验中，在存在或不存在Noggin的情况下，具有N341K+N384YH取代的BMP2对软骨形成的影响；(A)表示在鸡微团中阿尔辛蓝染色的间质前体细胞的软骨胞外基质；(B)显示量化结果。图6表示chMM实验中，在存在或不存在Noggin的情况下，具有 S306E+N341T+N384ra取代的BMP2对软骨形成的影响；(A)表示在鸡微团中阿尔辛蓝染色的间质前体细胞的软骨胞外基质；(B)显示量化结果。图7表示chMM实验中，在存在或不存在Noggin的情况下，具有S306E取代的BMP2 对软骨形成的影响；(A)表示在鸡微团中阿尔辛蓝染色的间质前体细胞的软骨胞外基质； (B)显示量化结果。图8表示chMM实验中，在存在或不存在Noggin的情况下，具有P318K取代的BMP2 对软骨形成的影响；(A)表示在鸡微团中阿尔辛蓝染色的间质前体细胞的软骨胞外基质； (B)显示量化结果。图9表示chMM实验中，在存在或不存在Noggin的情况下，具有N341T取代的BMP2 对软骨形成的影响；(A)表示在鸡微团中阿尔辛蓝染色的间质前体细胞的软骨胞外基质； (B)显示量化结果。图10表示chMM实验中，在存在或不存在Noggin的情况下，具有N34IK取代的BMP2对软骨形成的影响；(A)表示在鸡微团中阿尔辛蓝染色的间质前体细胞的软骨胞外基质； (B)显示量化结果。图11表示chMM实验中，在存在或不存在Noggin的情况下，具有V38IT取代的BMP2 对软骨形成的影响；(A)表示在鸡微团中阿尔辛蓝染色的间质前体细胞的软骨胞外基质； (B)显示量化结果。图 12 表示具有单取代的 BMP2 变体(S306E、P318K、N341T、N341K、V381T 和 N384YH) 与具有两个或更多个取代的BMP2变体(S306E+N341T、P318K+N341K、N341T+N384YH, N341K+N384YH、S306E+N341K+N384YH)的效果的定量比较。
实施例材料和方法通过比对蛋白数据库(Protein Data Bank，PDB)中的人BMP2序列和N0G:BMP7结构(PDB 入口 1 M4U(PDB entry 1M4U))中的 BMP7 二聚体的同等物(coordinates)，模拟了 BMP2-N0G复合体的结构，其通过X射线晶体学来获得(Groppe J，GreenwaldJ, Wiater E， Rodriguez-Leon J, Economides AN, Kwiatkowski W, Affolter Μ, Vale WW, Belmonte JC, Choe S.，2002，通过胱氨酸结蛋白头蛋白抑制BMP信号的结构基础(Structural basis of BMP signaling inhibition by the cystine knot protein Noggin).自然(Nature) 12 ； 420(6916) :636-42)。BMP2-BMPR1A-ACVR2 复合体也已获得(PDB entry 2goo) (Allendorph GP, Vale WW, Choe S. 2006, TGF-β超家族成员三元信号复合体的结构(Structure of the ternary signaling complex of a TGF-beta superfamily member).美国禾斗学院院干丨J (Proc Natl Acad Sci U S A) 16 ； 103 (20) :7643-8)。分子结构图由旧金山加利福尼亚大学嵌合体软件包(UCSF Chimera package) (http://www. cgl. ucsf. edu/chimera/)产生。 Nog与I型和Il型受体结合位点已经使用PP_SITE(Gao Y, Lai U2004)用于分析蛋白-蛋白界面的基于结构的方法(Structure-based method for analyzing protein-protein interfaces).分子模型杂志(J MoI Model) 10 :44-54)确定。我们使用鸡微团培养系统来获得BMP2变体的功能特征。微团培养系统是软骨形成的体外模型，允许在存在或不存在BMP抑制剂Noggin的条件下，筛选具有生物活性的 BMP2 或 BMP2 变体(Duprez DM, Coltey Μ, Amthor H, Brickell PM, Tickle C，1996，骨形成蛋白-2(BMPD在鸡肢芽培养中抑制肌发育并促进软骨发育(Bone morphogenetic protein-2(BMP-2)inhibits muscle development and promotes cartilage formation in chick limb bud cultures).发育生物学(Dev Biol). 15 ； 174(2) :448-52)。人BMP2的编码序列(cds)使用5'-相容的Ncol-悬突和BamHI位点克隆进穿梭载体pSLAX-13 (Morgan ΒΑ, Fekete DM.，1996，用可复制逆转录病毒操纵基因表达 (Manipulating gene expression with replication-competent retroviruses).细胞生物学方法(Methods Cell Biol.) 1996 ；51 :185-218)。通过使用下列的诱变引物对，体外诱变人BMP2 pSLAX13载体生产BMP2的变体V381T_fwd ctgtaccttgacgagaatgaaaaggttacgttaaagaactatcaggacatggttgtg (S EQ ID NO. 20)V381T_rev cacaaccatgtcctgatagttctttaacgtaaccttttcattctcgtcaaggtacag (SEQ ID NO. 21)S306E_fwd ccctttgtacgtggacttcgaggacgtggggtggaatgact(SEQ ID NO. 22)S306E_fw agtcattccaccccacgtcctcgaagtccacgtacaaaggg(SEQ ID NO. 23)P318K_fwd ctggattgtggctcccaaggggtatcacgccttt(SEQ ID NO. 24)P318K_rev aaaggcgtgataccccttgggagccacaatccag(SEQ ID NO. 25)N341K_fwd gctgatcatctgaactccactaagcatgccattgttca(SEQ ID NO. 26)N341K_rev tgaacaatggcatgcttagtggagttcagatgatcagc(SEQ ID NO. 27)N341T_fwd gatcatctgaactccactcatgccattgttcag(SEQ ID NO. 28)N341T_rev gtctgaacaatggcatgagtagtggagttcagatga(SEQ ID NO. 29)N384YH_fwd gaatgaaaaggttgtattaaagtaccactatcaggacatggttgtggagg (SEQ ID NO. 30)N384YH_rev cctccacaaccatgtcctgatagtggtactttaatacaaccttttcattc(SEQ ID NO. 31)获得的含突变的人BMP2的载体转化入化学感受态E. coli ToplO细胞中，通过测序挑选阳性克隆。插入物通过CIaI亚克隆到禽特异逆转录病毒载体RCASBP-A(Morgan ΒΑ, Fekete DM. ,1996, Manipulating gene expression with replication-competent retroviruses. Methods Cell Biol. 1996 ;51 :185—218)。鸡 Noggin 的 cds 通过 Ncol-相容的5'悬突和BamHI先克隆到穿梭载体pSLAX_13，并借助CIaI亚克隆到RCASBP-B，使得 BMP2和Noggin在相同细胞中共感染。为了生产病毒，鸡成纤维细胞系DF-I在37°C生长至覆盖(confluence) 70%时，根据制造商的说明，用3yg RCAS构建体和ΙΟμΙ ExGene 500 (Fermentas)转染。细胞使用 DF-I标准培养基(lg/L葡萄糖、不含(w/o) L-Gln的DMEM ；10%胎牛血清(FCS) ；2% CS ；2mM L-Gln，青霉素/链霉素)传代多次，直到Φ 15cm的6孔细胞培养板100%覆盖。随后，培养基换成DF-I饥饿培养基(lg/L葡萄糖、不含(w/o)L-Gln的DMEM ；1%FCS ；0. 2% CS ；2mM L-Gln,青霉素/链霉素)，使得病毒颗粒在培养基中累积。连续3天，收获含有病毒颗粒的上清，在液氮中冷冻，并在-80°C保存，直至进一步处理。冷冻的上清在37 V解冻，并在冰上用0. 45 μ m Durapore滤器(密理博 (Millipore))过滤。随后，通过在 4°C 以 22000rpm(Rotor Sff-32, Beckman)超速离心 3 小时，病毒颗粒成球状沉淀(pellet)。弃去上清，并通过在冰上摇动1小时重新悬浮剩余培养基中的小球。最后，病毒在液氮中冷冻，并在_80°C保存。通过以7. 6xl04细胞/孔的密度在M孔培养皿板上接种DF-I细胞，并且培养至 70-80%覆盖，来测定病毒的滴度。将浓缩的病毒上清从1χ10_3至1χ10_6稀释，所述稀释液以1 μ 1/孔和10 μ 1/孔分别感染DF-I细胞。被RCAS病毒感染的细胞用单克隆抗体3C2 和Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories he.)标记，并确定各病毒的感染单位数目。在存在或不存在Noggin的条件下，病毒用来与BMP2或BMP2变体共感染鸡微团培养物。受精的鸡蛋获自Tierzucht Lohmann(德国Cuxhafen)，在加湿鸡蛋孵化器中37. 5°C 孵化4. 5天。分离汉堡/汉密尔顿阶段M (Hamburger/Hamilton stage 24)的肢芽(limb bud)，并通过在HBSS中与分散酶(dispase) (3mg/ml)孵育来去除外胚层。通过用0. 1% Ia型胶原酶和0. 胰蛋白酶消化，接着通过40 μ m滤器(BD Falcon)过滤细胞悬液，将细胞从所述肢芽中分离出来。微团培养物以每10 μ 1 2X IO5细胞的接种密度滴于M孔组织培养板的中心。在细胞铺板前加入浓缩的复制型禽肉瘤(RCAQ病毒上清含有野生型人ΒΜΡ2 或ΒΜΡ2变体cds的RCASBP-A以及含有野生型鸡Nog cds的RCASBP-B直接进行感染。细胞允许在37°C，5% CO2，加湿的环境中贴附浊，随后补充培养基(DMEM-F12、10%FBS、0. 2% 鸡血清、4mM L-Gln、青霉素/链霉素)。每2天更换一次培养基。5天后，在用凯氏固定液 (Kahles fixative) (28. 9% (ν/ν)乙醇、0. 37% 甲醛、3. 9% (ν/ν)乙酸)固定，且用 IN HCl 中0. 05%的阿尔辛蓝染色后，通过将阿尔辛蓝掺入胞外基质，其产生反应富含蛋白聚糖的软骨基质，微团培养物被染色。染色的量化通过在室温下用6Μ盐酸胍过夜提取实现。在 OD 595nm下通过分光光度计测定染色浓度。对了比较不同实验的结果，在每个数据集中， 未与Noggin共转染的野生型hBMP2的值标准化为1。在存在或不存在Noggin的条件下， 不同变体和对照的测定数据与该值相关联。对于每个条件平行进行了 4个重复(Seemarm P, Schwappacher R, Kjaer Kff, Krakow D, Lehmann K, Dawson K, Strieker S, Pohl J, Pl omicronger F, Staub Ε, Nickel J, Sebald W, Knaus P, Mundlos S. 2005，在 GDF5 的受体相互作用位点激活和灭活突变引起A2型指关节粘连或短指(Activating and deactivating mutations in the receptor interaction site of GDF5 cause symphalangism or brachydactyly type A2.)，临床研究杂志(J Clin Invest.) 115(9) :2373-81)。结果对预测的BMP2-N0G复合体的分析表明，BMP2中的下列氨基酸位置对于NOG抑制 BMP2 是必需的D304、S306、N311、D312、V315、A316、P318、G319、D335、N341、S370、E376、 V381、K383、N384。我们使用 FoldX 算法(Guerois R, Nielsen JE, Serrano L(2002)蛋白质和蛋白质复合物的稳定性中的预测变化超过1000突变的研究(Predicting changes in the stability of proteins and protein complexes -.a study of more than lOOOmutations.)分子生物学杂志(J MoI Biol) 320 :369-387)进行硅片上的诱变(in silico mutagenesis)，来识别降低了 BMP2与Nog的结合亲和力，而同时仅仅微弱影响BMP2 与其受体结合的BMP2氨基酸取代。我们发现了以下在上文提及位置的氨基酸取代D304(SEQ ID No. 1 的 D22)D304是NOG中的R210可能的相互作用对象。这些氨基酸取代可能阻止侧链的结合。BMP7在同源位置具有丝氨酸，且由于NOG能够与BMP7结合，认为D304S对于BMP2-N0G 复合体仅有微小的影响。理论分析预测的BMP2-N0G复合体给了该方向的暗示氨基酸取代为精氨酸或组氨酸，与D304S相比，更加降低复合物的稳定性。因此，优选的取代是D304R/ D304S/D304H。S306 (SEQ ID No. 1 的 S24)S306在BMP2-N0G模型中匹配且朝向D304和N311。所述三个侧链均能与R210相互作用。另外，环307-311通过所述侧链的匹配(coordinate)而稳定。该环，尤其是W210， 对于BMP2-BMPRla的相互作用是重要的。因此，该环的改变将干扰1型受体结合。在BMP7 中的同源位置是精氨酸，其与BMP7:N0G复合体中的Q318形成氢键。该相互作用似乎对 BMP-NOG接触位点是重要的。由于BMP2在318位置具有脯氨酸，BMP2-N0G复合体中相似的相互作用是不可能的。所有提出的氨基酸取代都可能阻止BMP2变体与NOG在该位置的任何相互作用。因此，优选的取代是S306G/S306H/S306E。N311 (SEQ ID No. 1 的 N29)N311，与D304和S306相似，靠近R210。其突变为苏氨酸应阻止与Nog的相互作用，但是将保持W310的必要的定向，这对于BMP2和BMPRlA的相互作用是重要的，原因在于结合于S306的氢键。因此，优选的取代是N311T。D312(SEQ ID No. 1 的 D30)D312可能与NOG的Q208相互作用，取代为丙氨酸或苏氨酸可能阻止该相互作用。 因此，优选的取代是D312A/D312T。V315(SEQ ID No. 1 的 V33)V315连同L372和A316形成了对NOG和ACVR2的疏水接触面。突变为精氨酸应允许结合2型受体，但是阻止了 NOG的结合。精氨酸将与ACVR2的T63相互作用，但是NOG的 R204将导致位阻。因此，优选的取代是V315R。A316(SEQ ID No. 1 的 A34)A316 连同 L372、V315、P317、P318 和 L382 形成了对 NOG 的 L46 和 ACVR2 的 W79 的疏水接触位点。A316氨基酸取代为酪氨酸或天冬氨酸应对BMP2与NOG或ACVR2的相互作用产生负面影响，但是A316Y不如A316D突变显著。因此，优选的取代是A316Y/A316D。P318(SEQ ID No. 1 的 P36)P318以及P317是主肽链的重要残基，尤其对于向ACVR2和NOG接触位点的弯曲。 这个位点的每个氨基酸取代应对NOG和2型受体的结合产生负面的影响。取代为赖氨酸、 精氨酸或丝氨酸将能具有最强的负面影响。因此，优选的取代是P318K/P318R/P318S。G319(SEQ ID No. 1 的 G37)G319对于主链向其曲面的接触位点的弯曲是重要的。突变为苏氨酸将干扰主链的弯曲，从而以负面的方式间接影响BMP2与2型受体或NOG的相互作用。直接影响是不可能的，因为侧链指向受体的相反方向。因此，优选的取代是G319T。D335(SEQ ID No. 1 的 D53)D335侧链通过NOG N-端的M27和Y30与NOG的主链直接接触。D355建立了结合 BMPRlA的T78的氢键。氨基酸取代为酪氨酸应对与NOG的相互作用的影响将大于与BMPRlA 的相互作用。因此，优选的取代是D335Y。N341 (SEQ ID No. 1 的 N59)N341对于BMP2 二聚体的稳定性以及BMPRlA的接触位点是重要的。N341通过朝向主链的双氢键指向NOG的N-末端穴。该相互作用被氨基酸取代为赖氨酸或苏氨酸所阻止。所述稳定性降低效应对与NOG的结合的影响将大于与BMPRlA的结合。因此，优选的取代是 N341K/N341T/N341V/N341E。S370 (SEQ ID No. 1 的 S88)S370构建了结合ACVR2主链的L80或NOG的V44的氢键。此外，它匹配S370N384 的侧链，并且参与NOG的N-端臂的排列。氨基酸取代为丙氨酸不影响ACVR2的相互作用， 因为符合疏水相互作用。另一方面，丙氨酸取代将能影响NOG N-端臂的排列(alignment)， 且因此干扰BMP2-N0G结合。因此，优选的取代是S370A。E376 (SEQ ID No. 1 的 E94)
E376可能构建了与NOG的R34和Q28结合的氢键，其稳定了 NOG的N末端臂。 E376可能也构建了与BMPRlA的Kill和R126结合的氢键(其未见于BMP2-RI/RII模型)。 因此，提出氨基酸取代为脯氨酸对于BMPRlA相互作用仅有微小的效果，但是同时干扰主链 (374-377)的环，从而降低NOG的N-端臂的稳定性。因此，优选的取代是E376P。V381 (SEQ ID No. 1 的 V99)V381侧链仅在BMP2单体内相互作用。但是其主链处于对NOG与β - β主链相互作用而言最优的位置。因此，提出氨基酸取代为苏氨酸或酪氨酸应能干扰主链的几何形状， 减弱NOG和ΒΜΡ2的相互作用。因此，优选的取代是V381T/V381Y。Κ383 (SEQ ID No. 1 的 Κ101)Κ383能间接影响Ν341(ΒΜΡ2)和E104(R1)的定向与结合。K383具有与D39相互作用的侧链，且因此影响NOG的N-端臂。突变为异亮氨酸或亮氨酸应能阻止这种相互作用， 而不影响BMPRlA相互作用。因此，优选的取代是K383I/K383L。N384 (SEQ ID No. 1 的 N102)NOG的N-端臂覆盖N384。BMP9在此具有额外的氨基酸，以便NOG N-端臂的剪切失去作用。这被认为是BMP9不被NOG抑制的主要原因之一。因此，我们将所述BMP9序列中的酪氨酸和组氨酸类似物引入BMP2。氨基酸取代为丝氨酸、缬氨酸或色氨酸，阻止了结合NOG的氢键，因此也干扰BMP2-N0G的结合。因此，优选的取代是N384YH/N384S/N384V/ N384W。NOG在BMPs中具有大的接触位点，因为其为了抑制BMP活性，需要阻止两对受体结合位点。我们认为单氨基酸取代的影响仅仅是微小的(marginal)，需要同时结合两个或更多个氨基酸取代，以获得具有完全的Noggin不敏感性的BMP2变体。使用鸡肢芽微团系统在体外系统定义的孔中分析hBMP2变体诱导软骨产生的功能能力，获得了概念的证据(图1-12)。通过在胞外基质中加入阿尔辛蓝，测定了富含蛋白聚糖的软骨基质的产生。因此，在鸡微团中的间质前体细胞的软骨细胞分化能够可视化和量化。因而hBMP2变体诱导软骨细胞的潜力得到有效地测试。用表达hBMP2的病毒逆转录感染微团培养物，来表达野生型蛋白或其变体。当进行变体对拮抗剂的敏感性测试时，同时，Noggin在细胞中共表达。经过5天的培养后，鸡微团培养物用阿尔辛蓝染色。如预期的那样，与非感染对照细胞相比，野生型hBMP2感染鸡微团细胞导致大量诱导产生软骨。然而，当Noggin共表达时，野生型则完全被阻止。像野生型一样，在没有Noggin的情况下，所有变体都能够有效诱导软骨形成。唯一的例外是含有N384YH取代的变体，其与对照相比没有诱导软骨形成。此外，除具有P318K 的变体之外，没有一个单突变能够诱导出Noggin抗性。该点突变导致对拮抗剂的一些抗性。然而，两个或三个单突变的组合则导致了 Noggin抗性的显著增强。这尤其可以在变体Ν341Τ+Ν384ΥΗ、Ν341Κ+Ν384 1和Ρ318Κ+Ν341Κ中观察到。当它们与Noggin共表达，且其成软骨能力是不存在拮抗剂的情况下，野生型活性的50% -75%。含有S306E+N341T和 S306E+N341K+N384YH取代的变体与单突变Ρ318Κ的Noggin抗性相当。它们显示出与观察到的野生型单转染相比大约三分之一的活性。
总之，本申请表明两个或三个特定的点突变的组合显著地增强了 hBMP2的Noggin 抗性，引起了甚至在其主要的拮抗剂存在下的成软骨效应。
权利要求
1.分离的肽，其包含具有与具有SEQID No. 1的成熟人BMP2相比至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列或由具有与具有SEQ ID No. 1的成熟人BMP2相比至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列组成，其特征在于，所述的氨基酸序列包含至少两个氨基酸取代，其中第一氨基酸取代发生在相应于SEQ ID No. 1的N59、S88、E94、V99、KlOl和/或附02的位置。
2.根据权利要求1所述的分离的肽，其特征在于，所述的第一氨基酸取代选自N59K、 N59T、N59V、N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、K101I、K101L、N102S、N102V、N102W 和 / 或 N102YH。
3.根据权利要求1或2所述的分离的肽，其特征在于，所述分离的肽包含第二氨基酸取代，其中所述的第二氨基酸取代不同于所述的第一氨基酸取代，并发生在相应于SEQ ID No.1 的 D22、S24、V26、N29、D30、V33、A34、P36、G37、H39、F41、H44、P48、A52、D53、L55、N59、 S88、E94、V99、KlOl 和 / 或 N102 的位置。
4.根据权利要求3所述的分离的肽，其特征在于，所述的第二氨基酸取代选自D22R、 D22S、D22H、S24G、S24H、S24E、S24Q、V26L、N29T、N29Q、D30A、D30T、V33I、V33R、A34Y、A34D、 P36K、P36R、P36S、G37T、H39A、F41N、H44D、P48S、A52N、D53A、D53Y、L55M、N59K、N59T、N59V、 N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、K101I、K101L、N102S、N102V、N102W 和 / 或 N102YH。
5.根据权利要求3所述的分离的肽，其特征在于，所述第二氨基酸取代发生在相应于 SEQ ID No. 1 的 D22、S24、N29、D30、V33、A34、P36、G37、D53、N59、S88、E94、V99、KlOl 和 / 或附02的位置。
6.根据权利要求3或5所述的分离的肽，其特征在于，所述的第二氨基酸取代选自 D22R、D22S、D22H、S24G、S24H、S24E、N29T、D30A、D30T、V33R、A34Y、A34D、P36K、P36R、P36S、 G37T、D53Y、N59K、N59T、N59V、N59E、S88A、E94P、V99T、V99Y、K101I、K101L、N102S、N102V、 N102W 和 / 或 m02YH。
7.根据权利要求5所述的分离的肽，其特征在于，所述的氨基酸序列包含其他的氨基酸取代，优选地所述氨基酸序列包含3或4个氨基酸取代。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的分离的肽，其特征在于，所述的分离的肽包含具有与具有SEQ ID No. 11的全长人BMP2相比至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列或者由具有与具有SEQ ID No. 11的全长人BMP2相比至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的肽，其特征在于，所述的分离的肽显示 BMP2活性。
10.分离的核酸，其特征在于，所述的分离的核酸包含i)编码权利要求1-9中任一项所述的肽的核酸序列；或 )在标准条件下与编码权利要求1-9中任一项所述的肽的核酸杂交的核酸序列。
11.表达权利要求1-9中任一项所述的分离的肽的转基因生物或细胞，其特征在于，所述的生物或细胞包含权利要求10所述的分离的核酸。
12.权利要求1-9中任一项所述的分离的肽和/或权利要求10所述的分离的核酸用于治疗BMP相关的疾病或病症，其中所述疾病或病症包含骨、软骨、非矿化骨骼或结缔组织的形成，代谢性疾病，在诸如破裂、骨折和/或撕裂的损伤部位处的骨和/或软骨更换或修复，牙周组织再生，肝再生，慢性肾功能衰竭，促进中枢神经系统缺血或外伤后功能恢复，树枝状生长，神经细胞粘连，帕金森症。
13.包含权利要求1-9中任一项所述的肽和/或权利要求10所述的分离的核酸以及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
14.权利要求1-9中任一项所述的肽和/或权利要求10所述的分离的核酸在药物制备中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述药物用于治疗BMP相关的疾病或病症，其中所述疾病或病症包含骨、软骨、非矿化骨骼或结缔组织的形成，代谢性疾病，在诸如破裂、骨折和/或撕裂的损伤部位处的骨和/或软骨的更换或修复，牙周组织再生，肝再生， 慢性肾功能衰竭，促进中枢神经系统缺血或外伤后功能恢复，树枝状生长，神经细胞粘连， 帕金森症。
全文摘要
本发明涉及包含具有与具有SEQ ID No.1的成熟人BMP2相比至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列或由具有与具有SEQ ID No.1的成熟人BMP2相比至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列组成的分离的肽以及其应用，其特征在于，所述的氨基酸序列包含至少两个氨基酸取代，其中第一氨基酸取代发生在相应于SEQ ID No.1的N59、S88、E94、V99、K101和/或N102的位置。
文档编号C07K14/51GK102369212SQ201080011605
公开日2012年3月7日 申请日期2010年3月11日 优先权日2009年3月12日
发明者卡斯滕·赖斯纳, 尤利娅·齐默尔, 彼得拉·泽曼, 斯特凡·蒙德洛斯, 格奥尔格·杜达 申请人:生物技术拉比特有限公司