双特异性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗体的制作方法

专利名称：双特异性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗体的制作方法
双特异性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗体本发明涉及针对人ErbB-3和针对人c_Met的双特异性抗体，制备它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，及其用途。
背景技术：
ErbB蛋白质家族ErbB蛋白质家族由4个成员组成ErbB-Ι，也称为表皮生长因子受体(EGFR)， ErbB-2，在人中也称为HER2和在啮齿动物中也称为neu，ErbB_3，也称为HER3，和ErbB_4， 也称为HER4。ErbB-3 和抗 _ErbB_3 抗体ErbB-3 (也已知为V_erb_b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3(禽类)， ERBB3, HER3 ；SEQ ID NO :46)是膜结合蛋白，其具有神经调节蛋白结合结构域但是没有活性激酶结构域(Kraus, M. H，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.) 86 (1989) 9193-7 ；Plowman, G. D.，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. )87(1999)4905-9 ；Katoh, Μ.，等，生物化学生物物理学研究通讯(Biochem. Biophys. Res. Commun.) 192(1993) 1189-97)。因此，其可以结合该配体，但是不通过蛋白磷酸化将信号传送到细胞中。然而，其的确与确实具有激酶活性的其它EGF受体家族成员形成异二聚体。异二聚化导致引起细胞增殖或分化的途径的激活。该基因的扩增和/或其蛋白的过表达已在多种癌症中得以报道，包括前列腺肿瘤、膀胱肿瘤、和乳腺肿瘤。已经表征了编码不同同种型的可变转录剪接变体。一种同种型缺少膜间区，并且分泌到细胞外。这种形式起作用调节膜结合形式的活性(Corfas，G.，等，7 (6) (2004) 575-80)。认为ERBB3被活化时成为二聚化的底物并且随后被ERBBl，ERBB2和ERBB4磷酸化。与多种受体酪氨酸-激酶相似，ERBB3被细胞外配体激活。已知结合ERBB3的配体包括调蛋白。例如，由WO 97/35885, WO 2007/077028 或 WO 2008/100624 可知用于抗癌治疗的抗-ErbB-3抗体。c-Met 和抗-c-Met 抗体MET(间充质-上皮转变因子)是一种原癌基因，其编码蛋白质MET，(也已知为c-Met ；肝细胞生长因子受体HGFR ； HGF受体；分散因子受体；SF受体；SEQ ID NO 45) (Dean, Μ·，等，自然(Nature) 318 (1985) 385-8 (1985) ； Chan, A.M.，等，癌基因 (Oncogene) 1 (1987) 229-33 ；Bottaro, D. P.，等，科学(Science) 251 (1991) 802-4 ；Naldini, L.，等，EMBO 杂志(ΕΜΒ0 J.) 10 (1991) 2867-78 ；Maulik, G.，等，细胞因子生长因子综述 (Cytokine Growth Factor Rev.) 13 (2002) 41-59)。MET 是胚胎发育和伤口愈合必需的膜受体。肝细胞生长因子(HGF)是MET受体仅有的已知配体。MET被上皮来源的细胞正常表达， 而HGF的表达局限于间充质来源的细胞。经HGF刺激，MET诱导数种生物学反应，它们共同产生已知为侵袭性生长的程序。癌症中异常的MET活化与差的预后相关，在此异常活性的 MET引发肿瘤生长，形成向肿瘤供应营养素的新血管(血管生成)，以及癌症扩散到其它器官(转移)。MET在许多类型的人恶性肿瘤中下调，所述人恶性肿瘤包括肾癌、肝癌、胃癌、 乳腺癌和脑癌。通常，仅有干细胞和祖细胞表达MET，其允许这些细胞侵袭性生长以便在胚胎中产生新组织或在成人中再生受损伤的组织。然而，认为癌症干细胞劫持了正常干细胞表达MET的能力，因此成为癌症持续和扩散到身体中的其它部位的原因。原癌基因MET产物是肝细胞生长因子受体并且编码酪氨酸-激酶活性。初级单链前体蛋白质被翻译后分解以产生α和β亚基，其被二硫键连接以形成成熟的受体。MET基因的多种突变与乳头状肾癌相关。抗-C-Met抗体是已知的，例如，从 US 5686292，US 7476724, WO 2004072117， WO 2004108766， WO 2005016382， WO 2005063816， WO 2006015371， WO 2006104911， WO 2007126799，或 WO 2009007427 中得知。C-Met结合肽是已知的，例如，从Matzke，A.，等，癌症研究(Cancer Res) 2005 ；65 (14)和 Tam，E.M，等，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 385 (2009) 79-90 中得知。双特异性抗体最近已经开发了广泛多样的重组抗体形式，例如通过融合例如IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如Coloma，Μ. J.，等，自然生物技术(Nature Biotech) 15 (1997) 159-163 ；WO 2001/077342 ；和 Morrison, S. L.，等，自然生物技术 (Nature Biotech)25 (2007) 1233-1234)。此外，开发了能够结合两种以上抗原的若干其他新型形式，其中抗体核心结构(IgA，IgD, IgE, IgG或IgM)不再保持，诸如双抗体(diabodies)、三链抗体或四链抗体(tetrabodies)、微型抗体(minibodies)、若干单链形式(scFv，双-scFv) (HoiIiger P，等，自然生物技术(Nature Biotech) 23 (2005) 1126-1136 ；Fischer, N.，和 Leger, 0.，病理学(Pathobiology) 74 (2007) 3-14 ；Shen, J，等，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods) 318 (2007) 65-74 ；ffu, C.,等，自然生物技术(Nature Biotech.)25 (2007) 1290-1297)。所有这样的形式使用接头将抗体核心(IgA，IgD, IgE, IgG或IgM)与其他结合蛋白(例如scFv)融合或融合例如两个Fab片段或scFvs (Fischer, N.，Leger, 0.，病理学 (Pathobiology) 74 (2007) 3-14)。人们一直希望可以通过保持与天然存在的抗体的高度相似性而保持效应子功能，诸如例如通过Fc受体结合介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在WO 2007/024715中，报道了双重可变的结构域免疫球蛋白作为改造的多价和多特异性结合蛋白。在US 6，897，044中报道了用于制备生物活性的抗体二聚体的方法。在 US 7，129，330中报道了具有至少四个彼此通过肽接头连接的可变结构域的多价FV抗体构建体。在US 2005/0079170中报道了二聚体和多聚体抗原结合结构。在US 6，511，663中报道了三价或四价单特异性抗原结合蛋白，其包含通过连接结构彼此共价结合的三个或四个Fab片段，所述蛋白不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中报道了这样的四价双特异性抗体，其可以在原核细胞和真核细胞中有效表达，并且用于治疗和诊断方法中。在US 2005/0163782中报道了在包含两种类型的多肽二聚体的混合物中，将通过至少一个链间二硫键连接的二聚体与不通过至少一个链间二硫键连接的二聚体分离或优先合成通过至少一个链间二硫键连接的二聚体的方法。在US 5，959，083中报道了双特异性四价受体。在 WO 2001/077342中报道了具有三个或多个功能性抗原结合位点的改造的抗体。在WO 1997/001580中报道了多特异性和多价抗原结合多肽。WO 1992/004053报道了均缀合物(homoconjugate)，其典型地由结合相同抗原决定簇的IgG类的单克隆抗体制备，其通过合成交联共价连接。在WO 1991/06305中报道了对于抗原具有高抗体亲抗原性的低聚单克隆抗体，其中分泌典型地是IgG类的低聚物，其具有缔合在一起的两种以上的免疫球蛋白单体，以形成四价或六价IgG分子。在US 6，350，860中报道了绵羊来源的抗体和改造的抗体构建体，其可以用于治疗其中Y干扰素活性是致病性的疾病。在US 2005/0100543中，报道了可靶向的构建体，所述构建体是双特异性抗体的多价载体，即可靶向的构建体的每个分子可以作为两种以上双特异性抗体的载体。在WO 1995/009917中报道遗传改造的双特异性四价抗体。在WO 2007/1092M中，报道了由稳定的scFv组成或包含稳定的scFv的稳定的结合分子。US 2007/0274985涉及包含单链Fab(ScFab)片段的抗体形式。W02009111707 (Al)涉及使用 Met 和 HER拮抗剂的联合治疗。W02009111691 (A2A3) 涉及使用Met和EGFR拮抗剂的联合治疗。WO 2008/100624涉及具有增加的ErbB_3受体内在化的抗_ErbB_3抗体及其特别与作为第二抗原的c-Met在双特异性抗体中的应用。发明概述本发明第一方面是特异性结合人ErbB-3和人c_Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，当在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量时，与不存在抗体时ErbB-3的内在化相比较，所述双特异性抗体显示不超过15%的ErbB-3的内在化。在本发明的一个实施方案中，所述抗体是特异性结合人ErbB-3和人c_Met的二价或三价、双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的一个或两个抗原结合位点和特异性结合人c-Met的一个抗原结合位点。在本发明的一个实施方案中，所述抗体优选是特异性结合人ErbB-3和人c_Met 的三价、双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的两个抗原结合位点和特异性结合人 c-Met的第三抗原结合位点。在本发明的一个实施方案中，所述抗体是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的二价、双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的一个抗原结合位点和特异性结合人 c-Met的一个抗原结合位点。本发明的一个方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，i)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 53的⑶R3H区， SEQ ID NO :54的⑶R2H区和SEQ ID NO :55的⑶RlH区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO 56 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 57 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 58 的 CDRlL 区或 SEQ ID NO 59 的 CDRlL 区；禾口所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 66的⑶R3H区，SEQ ID NO :67的CDR2H区和SEQ ID NO :68的CDRlH区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO: 69 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 71 的 CDRlL 区；ii)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 60的⑶R3H区，SEQ ID NO :61的⑶R2H区和SEQ ID NO 62的⑶RlH区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO 63 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 64 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 65 的 CDRlL 区或 SEQ ID NO 66 的 CDRlL 区；禾口所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 66的⑶R3H区，SEQ ID NO :67的CDR2H区和SEQ ID NO :68的CDRlH区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO: 69 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 71 的 CDRlL 区。所述双特异性抗体优选地特征在于，i)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 47和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 48 ；和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的序列 SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的序列SEQ ID NO 4 ；ii)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO :49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 50 ；和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 4 ；iii)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :51，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 4 ；iv)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :52，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 4 ；或ν)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO :1和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :2，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 4 ；或优选地，所述双特异性抗体特征在于所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :51，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 4 ；在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体特征在于包含IgGl或IgG3亚类的恒定区。在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体特征在于所述抗体在Asn297用糖链糖基化，其中所述糖链内岩藻糖的量为65 %以下。本发明另一方面是编码所述双特异性抗体的链的核酸分子。本发明的其它方面是包含本发明所述的双特异性抗体的药物组合物，所述组合物用于治疗癌症，所述双特异性抗体用于制备用于治疗癌症的药物的应用，治疗患有癌症的患者的方法，所述方法通过给需要所述治疗的患者施用所述双特异性抗体而进行。本发明所述的抗体表现出高度有价值的特性，如表达两种受体<ErbB3>和 <c-Met>的癌细胞的生长抑制，给患有癌症的患者带来益处的抗肿瘤功效。本发明所述的双特异性<ErbB3-c-Met>抗体在与它们的亲本单特异性<ErbB3>抗体相比较时，在表达这两种受体<ErbB3>和<c-Met>的癌细胞上，其表现出减少的ErbB3/抗体复合物的内在化。发明详述
本发明的第一方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，当在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量时，与不存在所述双特异性抗体时ErbB-3的内在化相比较，所述双特异性抗体显示不超过15%的ErbB_3的内在化。因此，本发明涉及特异性结合人ErbB-3和人c_Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其中通过流式细胞术测定法测量，在A431细胞-抗体温育1小时后测量时，与不存在抗体时在A431细胞上ErbB-3的内在化相比，所述双特异性抗体引起不超过15%的A431细胞上 ErbB-3的内在化的增加。 在一个实施方案中，所述特异性结合人ErbB-3和人c_Met的双特异性抗体包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，当在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量时，与不存在所述双特异性抗体时ErbB-3的内在化相比较，所述双特异性抗体显示不超过10%的ErbB-3的内在化。在一个实施方案中，所述特异性结合人ErbB-3和人c_Met的双特异性抗体包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，当在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量时，与不存在所述双特异性抗体时ErbB-3的内在化相比较，所述双特异性抗体显示不超过7%的ErbB-3的内在化。在一个实施方案中，所述特异性结合人ErbB-3和人c_Met的双特异性抗体包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，当在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量时，与不存在所述双特异性抗体时ErbB-3的内在化相比较，所述双特异性抗体显示不超过5%的ErbB-3的内在化。术语“ErbB-3的内在化”指与不存在抗体时ErbB_3的内在化相比较，在A431细胞 (ATCC No. CRL-1555)上的抗体-诱导的ErbB-3受体内在化。ErbB-3受体的这种内在化由本发明所述的双特异性抗体诱导，并且如在实施例8中所述，在流式细胞术测定法(FACS) 中2小时后测量。与不存在抗体时ErbB-3的内在化相比较，本发明所述的双特异性抗体在抗体暴露2小时后表现出在A431细胞上不超过15%的ErbB-3内在化。在一个实施方案中，所述抗体表现出不超过10%的ErbB-3内在化。在一个实施方案中，所述抗体表现出不超过7%的ErbB-3内在化。在一个实施方案中，所述抗体表现出不超过5%的ErbB-3内在化。为了确定双特异性ErbB3/cMet抗体在A431细胞上2小时后是否表现出10%以下的 ErbB-3内在化，可以在流式细胞术测定法(FACS)中与下述双特异性ErbB3/cMet抗体MH_ TvAb24进行比较。为了确定双特异性ErbB3/cMet抗体在A431细胞上2小时后是否表现出5%以下的ErbB-3内在化，可以在流式细胞术测定法(FACS)中与下述双特异性ErbB3/ cMet抗体MH_TvAb29进行比较。本发明的另一方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，与由(相对应的)单特异性亲本ErbB-3抗体诱导的ErbB-3内在化相比，当在流式细胞术测定中在A431细胞(ATCC No. CRL-1555)上2小时后测量时，所述双特异性抗体将 ErbB-3内在化减少50%以上(在一个实施方案中，减少60%以上；在另一个实施方案中， 减少70%以上，在一个实施方案中，减少80%以上)。ErbB-3内在化的减少计算(使用在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量的值)如下100x(由单特异性亲本ErbB-3 抗体诱导的％ ErbB3内在化-由双特异性ErbB-3/cMet抗体诱导的％ ErbB3内在化)/由单特异性亲本ErbB-3抗体诱导的％ ErbB3内在化。例如a)双特异性ErbB-3/cMet抗体MH_ TvAb21表现出1 %的ErbB-3内在化，并且单特异性亲本ErbB_3抗体Mab 205表现出40% 的ErbB-3内在化。因此，双特异性ErbB-3/cMet抗体MH_TvAb21表现出IOOx (40-1) /40% =97. 5%的ErbB-3内在化减少；b)双特异性ErbB-3/cMet抗体MH_TvAb25表现出11%的 ErbB-3内在化，并且单特异性亲本ErbB-3抗体Mab 205表现出40%的ErbB-3内在化。因此，双特异性 ErbB-3/cMet 抗体 MH_TvAb21 表现出 IOOx(40-11)/40% = 72. 5% 的 ErbB-3 内在化减少；或c)双特异性ErbB-3/cMet抗体HER3/Met_C6表现出11%的ErbB-3内在化， 并且单特异性亲本ErbB-3抗体HER3克隆29表现出54%的ErbB-3内在化。因此，双特异性 ErbB-3/cMet 抗体 HER3/Met_C6 表现出 IOOx (54-6) /40 % = 88. 9 % 的 ErbB-3 内在化减少。(参见在实施例8中在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量的内在化值)。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的三价、双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的两个抗原结合位点和特异性结合人 c-Met的第三抗原结合位点。在本发明的一个实施方案中，所述抗体是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的二价、双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人 c-Met的第二抗原结合位点。在本发明的一个实施方案中，所述抗体是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的四价、双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的两个抗原结合位点和特异性结合人 c-Met的两个抗原结合位点，其中所述特异性结合人c-Met的抗原结合位点抑制c_Met 二聚化(如例如在WO 2009007427中所述)。用于本文时，“抗体”指包含抗原结合位点的结合蛋白。术语“结合位点”或“抗原结合位点”用于本文时，指配体实际上结合的抗体分子的区域，所述位点源自抗体。术语“抗原结合位点”包含抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)或VH/VL配对，并可源自完整抗体或抗体片段如单链Fv、VH结构域和/或VL结构域、Fab或(Fab) 2。 在本发明的一个实施方案中，每个抗原结合位点包含抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)，和优选地由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH) 组成的配对形成。对抗体来源的抗原结合位点进一步看来，例如，Matzke, A.，等，癌症研究(Cancer Res) 652005(14). 2005年7月15日中所述的结合肽也可以特异性结合抗原(例如，c_Met)。 因此，本发明的另一方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性结合分子，其包含特异性结合人ErbB-3的抗原结合位点和特异性结合人c-Met的结合肽。因此，本发明的另一方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性结合分子，其包含特异性结合人 c-Met的抗原结合位点和特异性结合人ErbB-3的结合肽。ErbB-3 (也已知为V_erb_b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3(禽类)， ERBB3, HER3 ；SEQ ID NO :46)是膜结合蛋白，其具有神经调节蛋白结合结构域但是没有活性激酶结构域(Kraus, M. H，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.) 86 (1989) 9193-7 ；Plowman, G. D.，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad.Sci.U. S. Α.) 87 (1990) 4905-9 ；Katoh, Μ.，等，生物化学生物物理学研究通讯(Biochem. Biophys. Res. Commun.) 192(1993) 1189-97)。因此，其可以结合该配体，但是不通过蛋白磷酸化将信号传送到细胞中。然而，其的确与确实具有激酶活性的其它EGF受体家族成员形成异二聚体。异二聚化导致引起细胞增殖或分化的途径的激活。该基因的扩增和/或其蛋白的过表达已在多种癌症中得以报道，包括前列腺肿瘤、膀胱肿瘤、和乳腺肿瘤。已经表征了编码不同同种型的可变转录剪接变体。一种同种型缺少膜间区，并且分泌到细胞外。这种形式起作用调节膜结合形式的活性(Corfas，G.，等，7 (6) (2004)575-80)。认为ERBB3被活化时成为二聚化的底物并且随后被ERBBl，ERBB2和ERBB4磷酸化。与多种受体酪氨酸-激酶相似，ERBB3被细胞外配体激活。已知结合ERBB3的配体包括调蛋白。 特异性结合人ErbB-3的抗原结合位点，且特别是重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)可以来源于a)已知的抗-ErbB-3抗体，如例如在WO 97/35885, WO 2007/077028或WO 2008/100624中所述，b)通过使用特别是人ErbB_3蛋白或核酸或其片段的从头(de novo)免疫法或通过噬菌体展示获得的新的抗_ErbB_3抗体。MET(间充质-上皮转变因子)是一种原癌基因，其编码蛋白质MET，(也已知为c-Met ；肝细胞生长因子受体HGFR ；HGF受体；分散因子受体；SF受体；SEQ ID NO 45) (Dean, Μ.,等，自然(Nature) 318 (1985) 385-8 ;Chan，Α· Μ·，等，癌基因 (Oncogene) 1 (1987) 229-33 ；Bottaro, D. P.，等，科学(Science) 251 (1991) 802-4 ；Naldini, L.，等，EMBO 杂志(ΕΜΒ0 J.) 10 (1991) 2867-78 ；Maulik, G.，等，细胞因子生长因子综述 (Cytokine Growth Factor Rev.) 13 (2002) 41-59)。MET 是胚胎发育和伤口愈合必需的膜受体。肝细胞生长因子(HGF)是MET受体仅有的已知配体。MET被上皮来源的细胞正常表达， 而HGF的表达局限于间充质来源的细胞。经HGF刺激，MET诱导数种生物学反应，它们共同产生已知为侵袭性生长的程序。癌症中异常的MET活化与差的预后相关，在此异常活性的 MET引发肿瘤生长，形成向肿瘤供应营养素的新血管(血管生成)，以及癌症扩散到其它器官(转移)。MET在许多类型的人恶性肿瘤中下调，所述人恶性肿瘤包括肾癌、肝癌、胃癌、 乳腺癌和脑癌。通常，仅有干细胞和祖细胞表达MET，其允许这些细胞侵袭性生长以便在胚胎中产生新组织或在成人中再生受损伤的组织。然而，认为癌症干细胞劫持了正常干细胞表达MET的能力，因此成为癌症持续和扩散到身体中的其它部位的原因。特异性结合人c-Met的抗原结合位点，且特别是重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)，可以来源于a)已知的抗-c-Met抗体，如例如在US 5686292， US 7476724， WO 2004072117， WO 2004108766， WO 2005016382， WO 2005063816， WO 2006015371，WO 2006104911, WO 2007126799，或 WO 2009007427 中所述的抗体，b)例如通过使用特别是人抗-c-Met蛋白或核酸或其片段的从头免疫法或通过噬菌体展示获得的新的抗-c-Met抗体。本发明的另一个方面是选择本发明所述的双特异性抗体的方法，其包括下述步骤a)与不存在抗体时ErbB-3的内在化相比较，在流式细胞术测定(FACS)中2小时后，测量由双特异性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗体诱导的A431细胞(ATCC No. CRL-1555)上的ErbB-3内在化，b)在不存在抗体时，在流式细胞术测定(FACS)中测量A431细胞(ATCCNo. CRL-1555)上的 ErbB_3 内在化，c)选择与不存在抗体时ErbB-3的内在化相比，在抗体暴露2小时后在A431细胞上表现出不超过15%的ErbB-3内在化的双特异性抗体。在一个实施方案中，选择表现出不超过10%的ErbB-3内在化的双特异性抗体。在一个实施方案中，选择表现出不超过7%的ErbB-3内在化的双特异性抗体。在一个实施方案中，选择表现出不超过5%的ErbB-3内在化的双特异性抗体。本发明的另一个方面是选择本发明所述的双特异性抗体的方法，其包括下述步骤a)与不存在抗体时ErbB-3的内在化相比较，在流式细胞术测定(FACS)中2小时后，测量由双特异性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗体诱导的A431细胞(ATCC No. CRL-1555)上的ErbB-3内在化，b)在流式细胞术测定(FACS)中2小时后测量由相对应的单特异性抗_ErbB_3抗体诱导的A431细胞(ATCC No. CRL-1555)上的ErbB-3内在化，c)选择与由相对应的单特异性亲本ErbB-3抗体诱导的ErbB_3的内在化相比， (在A431细胞上2小时后)将ErbB-3内在化减少50%以上的双特异性抗体。在一个实施方案中，选择与相对应的单特异性亲本ErbB-3抗体诱导的ErbB_3的内在化相比，将ErbB-3内在化减少60%以上的双特异性抗体。在一个实施方案中，选择与相对应的单特异性亲本ErbB-3抗体诱导的ErbB-3的内在化相比，将ErbB-3内在化减少 70%以上的双特异性抗体。在一个实施方案中，选择与相对应的单特异性亲本ErbB-3抗体诱导的ErbB-3的内在化相比，将ErbB-3内在化减少80%以上的双特异性抗体。本发明的另一方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，i)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 53的⑶R3H区， SEQ ID NO 54的⑶R2H区和SEQ ID NO 55的⑶RlH区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO 56 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 57 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 58 的 CDRlL 区或 SEQ ID NO 59的⑶RlL区；和所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 66的 CDR3H区，SEQ ID NO 67的CDR2H区和SEQ ID NO 68的CDRlH区，和在轻链可变结构域中包含 SEQ ID NO 69 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 71 的 CDRlL 区；ii)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 60的⑶R3H区， SEQ ID NO 61的⑶R2H区和SEQ ID NO 62的⑶RlH区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO 63 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 64 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 65 的 CDRlL 区或 SEQ ID NO 66的⑶RlL区；和所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 66的 CDR3H区，SEQ ID NO 67的CDR2H区和SEQ ID NO 68的CDRlH区，和在轻链可变结构域中包含 SEQ ID NO 69 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 71 的 CDRlL 区。本发明的另一个方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 53的⑶R3H区，SEQID NO :54的CDR2H区和SEQ ID NO :55的CDRlH区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO: 56 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 57 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 58 的 CDRlL 区或 SEQ ID NO 59 的 ⑶RlL区；和所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 66的⑶R3H区， SEQ ID NO 67的⑶R2H区和SEQ ID NO 68的⑶RlH区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO 69 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 71 的 CDRlL 区。

本发明的另一个方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 60的⑶R3H区，SEQ ID NO :61的⑶R2H区和SEQ ID NO :62的⑶RlH区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO 63 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 64 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 65 的 CDRlL 区或 SEQ ID NO 66的⑶RlL区；和所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 66的⑶R3H 区，SEQ ID NO 67的⑶R2H区和SEQ ID NO 68的⑶RlH区，和在轻链可变结构域中包含 SEQ ID NO 69 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 71 的 CDRlL 区。所述双特异性抗体优选地特征在于i)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 47和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :48，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 4 ；ii)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID N0:49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :50，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 4 ；iii)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :51，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 4 ；iv)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :52，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 4 ；或ν)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO :1和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :2，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 4 ；或优选地，所述双特异性抗体特征在于所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :51，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :4。抗体特异性指抗体对于抗原特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。根据本发明所述的“双特异性抗体”是具有两种不同的抗原结合特异性的抗体。如果抗体具有超过一种的特异性，识别的表位可以与单抗原或多于一种的抗原相关。本发明的抗体特异于两种不同的抗原，即作为第一抗原的ErbB-3和作为第二抗原的c-Met。用于本文时，术语“单特异性”抗体指具有一个或多个分别结合于相同抗原的相同表位的结合位点的抗体。术语“价”在本申请中使用时指在抗体分子上存在的结合位点的具体数量。因此， 术语“二价”、“四价”、和“六价”分别指在抗体分子上存在两个结合位点、四个结合位点、和六个结合位点。本发明所述的双特异性抗体是至少“二价的”，并且可以是“三价”或“多价” 的(例如(“四价”或六价)的)。本发明的抗体的抗原结 合位点可包含六个互补性决定区(CDRs)，其在不同程度上有助于结合位点对于抗原的亲和力。存在三个重链可变结构域CDRs (CDRH1，CDRH2和 ⑶RH3)和三个轻链可变结构域⑶Rs (⑶RL1，⑶RL2和⑶RL3)。⑶R和构架区(FRs)的程度通过与氨基酸序列的汇编数据库进行比较来确定，所述氨基酸序列中那些区域根据序列之间的可变性来确定。此外，还包括在本发明范围内的是包含更少CDRs的功能性抗原结合位点(即，在结合特异性由三个、四个或五个CDRs决定的情形中)。例如，少于6个CDRs的完整组对于结合可能是足够的。在一些情形中，VH或VL结构域是足够的。如例如，在EP 申请号 07024867. 9，EP 申请号 07024864. 6，EP 申请号 07024865. 3 或 Ridgway，J. B.，蛋白质工程(Protein Eng.) 9 (1996) 617-621 ；WO 96/027011 ；Merchant, A.M，等，自然生物技术(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681 ；Atwel 1, S.，等，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 270 (1997) 26-35 和 EP 1870459A1 中所述，可以使用针对人 ErbB_3 和人 c-Met的包含免疫球蛋白恒定区的IgG样双特异性、二价抗体。术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单一氨基酸组成的抗体分子制剂。术语“嵌合抗体”指这样的抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区， 以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是这样的那些，其中恒定区已经被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生本发明所述的特性，特别是关于Clq结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性。也将这种嵌合抗体称作“类别转换抗体”。嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包括编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。制备嵌合抗体的方法包括目前在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见，例如，Morrison，S. L.，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 81 (1984) 6851-6855 ；US 5，202，238 和 US5, 204，244。术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中的构架或“互补性决定区”(CDR)已经被修饰为包括与亲本免疫球蛋白相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在一个优选实施方案中， 将鼠⑶R移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。见，例如，Riechmann, L.，等，自然 (Nature) 332 (1988) 323-327 ；和 Neuberger，Μ. S.，等，自然(Nature) 314 (1985) 268-270。特别优选的CDRs对应于识别以上指出的关于嵌合抗体的抗原的那些代表性序列。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是这样的那些，其中恒定区已经另外被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生本发明所述的特性，特别是关于Clq结合和/或Fc受体(FcR) 结合的特性。用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel, J. G., 当前化学生物学观点(Curr. Opin. Chem. Biol.) 5 (2001) 368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生人抗体的全部所有组成成分或选择部分(selection)。在所述种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(见，例如JakobovitsA.， 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院学报)90 (1993) 2551-2555 Jakobovits, A.，等，Nature (自然)362 (1993) 255-258 ；Bruggemann, M. D.，等，Year Immunol.(免疫学年度)7 (1993) 33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H. R.，和 Winter, G.，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.，等，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)222 (1991) 581-597)。Cole, Α.，等和Boerner, P.，等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole，Α.，等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (单克隆抗体和癌症治疗)，Liss, A. L.，ρ· 77(1985)；和 Boerner, P.，等，J. Immunol.(免疫学杂志)147 (1991) 86-95)。如已经对本发明所述的嵌合和人源化抗体所提及地，术语“人抗体”用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区内进行修饰以产生本发明所述的特性，特别是关于Clq结合和/或FcR结合的特性，例如通过“类别转换”即改变或突变Fc部分(例如由IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4突变)进行。用于本文时，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NSO或CHO细胞的抗体或分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。 这种重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。本发明所述的重组人抗体已经经历了体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，所述序列尽管源自并涉及人种系VH和VL序列，但在体内可能不天然存在于人抗体种系所有组成成分中。“可变结构域”(轻链的可变结构域(VL)，重链的可变区(VH))用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链对。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补性决定区，⑶Rs)相连接。构架区采用β-折叠构象且⑶Rs可以形成连接 β-折叠结构的环。每条链中的CDRs通过构架区以其三维结构保持并与来自另一条链的 CDRs 一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在本发明所述的抗体的结合特异性 /亲和力方面发挥特别重要的作用并因此提供本发明的另一个目的。用于本文时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分或抗原结合位点”指抗体负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”或“CDRs”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N端到C端包括结构域FRl、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3和FR4。各条链上的⑶Rs 通过所述构架氨基酸分开。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。按照Kabat 等，免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版，公众健康服务，全国卫生研究所(Public Health Service, National Institutes of Health)，Bethesda, MD (1991))的标准定义来确定CDR和FR区域。用于本文时，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，优选地在使用纯化的野生型抗原的等离振子共振测定(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，瑞典)中，抗体与抗原(人ErbB-3或人c-Met)的表位的结合。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义。结合或特异性结合意为10_8mol/l以下，优选地10_9M到10_13mol/l的结合亲和力(Kd)。因此，本发明所述的双特异性<ErbB3-C-Met>抗体特异性结合每种抗原，对于每种抗原其是特异性的，具有10_8mol/ 1以下，优选地10、到10_13mOl/l的结合亲和力(Kd)。抗体与FcyRIII的结合可以通过 BIAcore测定法(GE-Healthcare，Uppsala，瑞典)进行研究。结合的亲和力由术语ka (来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，kD (解离常数)和KD(kD/ ka)定义。术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面分组(groupings)，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和或特定的带电特征。表位是被抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，将该抗体称为与抗原特异性结合。术语“恒定区”用于本申请时指除了可变区之外的抗体的结构域的总和。恒定区不直接参与抗原的结合，但是显示不同的效应子功能。取决于它们重链的恒定区的氨基酸序列，抗体被分为下述类别IgA，IgD, IgE, IgG和IgM，并且这些中的一些可以被进一步分为亚类，如IgGl，IgG2，IgG3，和IgG4，IgAl和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、Y和μ。可以在所有5种抗体种类中发现的轻链恒定区被称为 κ (kappa)禾口 λ (lambda)。术语“来自人来源的恒定区”在本申请中使用时，指亚类IgGl，IgG2，IgG3，或IgG4 的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区域。这样的恒定区是现有技术中公知的并且例如由Kabat, Ε. Α.，描述(见，例如Johnson, G.和ffu, Τ. T.，核酸研究(Nucleic Acids Res.) 28 (2000) 214-218 ;Kabat，Ε. Α.，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)72(1975)2785-2788)。在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体包含IgGl或IgG3亚类(优选 IgGl亚类)的恒定区，其优选地来自人来源。在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体包含IgGl或IgG3亚类(优选IgGl亚类)的Fc部分，其优选地来自人来源。抗体的恒定区直接参与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用)和CDC(补体依赖的细胞毒性)。补体激活(CDC)由补体因子Clq与大多数IgG抗体亚类的恒定区结合而起始。Clq与抗体的结合由在所谓的结合位点的定义的蛋白-蛋白相互作用所导致。这样的恒定区结合位点在现有技术中是已知的，并且例如由Lukas，Τ. J.，等，免疫学杂志(J. Immunol.) 127 (1981) 2555-2560 ；Brunhouse, R.，和 Cebra, J. J.，分子免疫学 (Mol. Immunol.) 16(1979)907-917 ；Burton, D. R.,等，自然(Nature)288(1980)338-344 ； Thommesen, J.E.，等，分子免疫学(Mol. Immunol.) 37 (2000) 995-1004 ；Idusogie, Ε. E.， 等，免疫学杂志(J. Immunol.) 164(2000)4178-4184 ；Hezareh, Μ.，等，病毒学杂志 (J. Virol.) 75 (2001) 12161-12168 ；Morgan, Α.，等，免疫学(Immunology) 86 (1995) 319-324 ； 和EP 0307434所描述。例如，所述恒定区结合位点特征在于氨基酸L234，L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331，和 P329 (根据 Kabat 的 EU 索引编号)。术语“抗体依赖性细胞毒作用(ADCC) ”指在存在效应细胞时，由本发明所述的抗体裂解人靶细胞。ADCC优选地通过用本发明所述的抗体在存在效应细胞时处理表达ErbB3和c-Met的细胞的制备物进行测量，所述效应细胞如新鲜分离的PBMC或来自暗黄覆盖层的纯化的效应细胞，如单核细胞或天然杀伤(NK)细胞或永久生长的NK细胞系。术语“补体依赖的细胞毒性(CDC) ”指由补体因子Clq与大多数IgG抗体亚类的Fc部分结合而起始的过程。Clq与抗体的结合由在所谓的结合位点的限定的蛋白-蛋白相互作用所导致。这些 Fc部分结合位点是现有技术已知的(见上)。例如，这些Fc部分结合位点特征在于氨基酸 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331，和 P329 (根据 Kabat 的 EU 索引编号)。亚类IgGl，IgG2，和IgG3的抗体通常显示包括Clq和C3结合的补体激活，而IgG4不激活补体系统并且不结合Clq和/或C3。单克隆抗体的细胞介导的效应子功能可以通过改造它们的寡糖成分而得以增强，如在 Umana, P.，等，自然生物技术(Nature Biotechnol.) 17(1999) 176-180， 和US 6，602，684中所述。IgGl型抗体是最常用的治疗性抗体，其是在每个CH2结构域的Asn297处具有保守的N-连接的糖基化位点的糖蛋白。与Asn297附着的两个复合双分支(biantermary)寡糖包埋在CH2结构域之间，形成了与多肽主链的广泛接触，并且它们的存在对于抗体介导效应子功能诸如抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)是必要的(Lifely，Μ. R.，等，糖生物学(Glycobiology) 5 (1995) 813-822 ； Jefferis, R.,等，免疫学综述(Immunol Rev.) 163 (1998) 59-76 ；Wright, Α.,和 Morrison, S. L.，生物技术趋势(Trends Biotechnol.) 15(1997)26-32)。Umana, P.， 等，自然生物技术(Nature Biotechnol.) 17 (1999) 176-180 和 WO 99/54342 显示， β (1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III( “GnTIII”)，一种催化平分型(bisected)寡糖形成的糖基转移酶，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过量表达，显著增加了抗体的体外ADCC活性。在Asn297糖的组成上的改变或其消除也影响Fc γ R和Clq的结合(Umana, P.，等，自然生物技术(Nature Biotechnol.) 17 (1999) 176-180 ；Davies, J., 等，生物技术生物工程(Biotechnol. Bioeng.) 74 (2001) 288-294 ；Mimura, Y.， 等，生物化学杂志(J. Biol. Chem.) 276 (2001) 45539-45547 ；Radaev, S.，等，生物化学杂志(J. Biol. Chem.) 276 (2001) 16478-16483 ；Shields, R. L.，等，生物化学杂志 (J. Biol. Chem.) 276 (2001) 6591-6604 ；Shields, R. L.，等，生物化学杂志(J.Biol. Chem.) 277 (2002) 26733-26740 ；Simmons, L. C.，等，免疫学方法杂志(J. Immunol. Methods)263(2002)133-147)。通过降低岩藻糖的量增强单克隆抗体的细胞介导的效应子功能的方法例如记述在 WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735， WO 2005/027966, WO 1997/028267， US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739, Niwa, R.，等，免疫方法杂志 (J. Immunol. Methods) 306 (2005) 151-160 ；Shinkawa,T.，等，生物化学杂志(J Biol Chem), 278(2003)3466-3473 ；WO 03/055993 或 US 2005/0249722 中。令人吃惊地，本发明所述的双特异性<ErbB3-c-Met>抗体与其亲本<ErbB3>和/ 或<c-Met>抗体相比表现出ErbB-3受体内在化的强烈减少。(见

图18，实施例8和表格)。 因此，在本发明的一个优选实施方案中，所述双特异性抗体是在Asn297处用糖链糖基化的 (IgGl或IgG3亚类)，其中在所述糖链中的岩藻糖的量是65%以下(根据Kabat的编号)。 在另一个实施方案中，在所述糖链中的岩藻糖量在5% -65%，优选地20%-40%o根据本发明所述的“Asn297”意为在Fc区域中位于约位置297的氨基酸天冬酰胺。基于抗体的微小序列变化，Asn297也可以在定位在位置297上游或下游的一些氨基酸上(通常不超过士3 个氨基酸)，即在位置294-300之间。所述糖改造的抗体在本文中也称为异常岩藻糖基化的抗体。人IgGl或IgG3在 Asn297发生糖基化，该糖基化作为核心岩藻糖基化的双分支复合寡糖糖基化，末端为多至两个Gal残基。IgGl或IgG3亚类的人恒定重链区由 Kabat, Ε· A. ， ·， 贞目的胃白；^歹Ij (Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版.公众健康服务(Public Health Service)，全国卫生研究所 (National Institutes of Health), Bethesda, MD. (1991),禾口由 Bruggemann, Μ.,等， 实验医学杂志(J. Exp. Med.) 166 (1987) 1351-1361 ；Love, Τ. W.，等，酶学方法(Methods Enzymol.) 178 (1989) 515-527中详细报道。根据末端Gal残基的量，将这些结构称为GO， Gl (α-1，6-或 0-1，3-)，或62聚糖残基(Raju, Τ. S.，Bioprocess Int. 1(2003)44-53)。 例如，抗体Fc部分的CHO型糖基化由Routier，F. H.，糖缀合物杂志(Glycoconjugate J.) 14(1997) 201-207描述。在未进行糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体通常以至少 85%的量在Asn297进行岩藻糖基化。全长亲本抗体的修饰的寡糖可以是杂合型的或复合型的。优选地，所述平分型的、减少的/未-岩藻糖基化的寡糖是杂合型的。在另一个实施方案中，所述平分型的、减少的/未_岩藻糖基化的寡糖是复合型的。根据本发明，“岩藻糖的量”意为与在Asn297附着的所有糖结构的总和(例如， 复合型、杂合型和高甘露糖型结构)相比的在Asn297的糖链中所述糖的量，所述糖的量通过MALDI-T0F质谱测量并且计算为平均值。岩藻糖的相对量是包含岩藻糖的结构相对于在 N-糖苷酶F处理的样品中由MALDI-T0F鉴定的所有糖结构(例如，分别为复合型、杂合型和低聚_与高甘露糖型结构)的百分比(关于确定岩藻糖量的详细步骤，见实施例14)。本发明所述的异常岩藻糖基化双特异性抗体可以在糖修饰的宿主细胞中表达，所述糖修饰的宿主细胞被改造以足以部分岩藻糖基化Fc区中的寡糖的量表达至少一种编码具有GnTIII活性的多肽的核酸。在一个实施方案中，所述具有GnTIII活性的多肽是融合多肽。备选地，根据US 6，946，292，宿主细胞的α 1，6_岩藻糖基转移酶活性可以减少或消除，从而产生糖修饰的宿主细胞。抗体岩藻糖基化的量可以预先确定，例如，通过发酵条件(例如，发酵时间)或通过组合至少两种具有不同岩藻糖基化量的抗体预先确定。所述异常岩藻糖基化的抗体和各自的糖改造方法记述在WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875，Umana, P.，等，Nature Biotechnol.(自然生物技术)17 (1999) 176-180， WO 99/154342，WO 2005/018572，WO 2006/116260，WO 2006/114700，WO 2005/011735，WO 2005/027966， WO 97/028267， US 2006/0134709， US 2005/0054048, US 2005/0152894， WO 2003/035835，WO 2000/061739中。这些糖改造的抗体具有提高的ADCC。产生本发明所述的异常岩藻糖基化的抗体的其它糖改造法例如记述在Niwa，R.，等，J. Immunol. Methods (免疫学方法杂志)306 (2005) 151-160 ;Shinkawa，Τ·，等，J Biol Chem(生物化学杂志)， 278(2003)3466-3473 ；WO 03/055993 或 US 2005/0249722 中。一个实施方案是制备IgGl或IgG3亚类的双特异性抗体的方法，所述抗体在Asn297用糖链糖基化，其中所述糖链中的岩藻糖的量为65%以下，该方法使用在WO 2005/044859， WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana, P.，等，Nature Biotechnol.(自然生物技术)17(1999) 176-180，WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260， WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267，US 2006/0134709，US 2005/0054048，US 2005/0152894, WO 2003/035835 或 WO 2000/061739 中描述的程序。一个实施方案是制备IgGl或IgG3亚类的双特异性抗体的方法，所述抗体在 Asn297用糖链糖基化，其中所述糖链中的岩藻糖的量为65%以下，该方法使用在Niwa，R.， 等，免疫学方法杂志(J. Immunol. Methods) 306 (2005) 151-160 ；Shinkawa, Τ.，等，生物化学杂志(J Biol Chem), 278 (2003) 3466-3473 ；WO 03/055993 或US 2005/0249722 中描述的程序。在一个实施方案中，本发明所述的抗体在Α549细胞中抑制HGF-诱导的c_Met受体磷酸化(见实施例2中所述)。在一个实施方案中，本发明所述的抗体在MCF7细胞中以lyg/ml的浓度抑制 HRG(Herregulin)-诱导的Her3受体磷酸化至少70% (如在实施例3中所述)(与作为对照的HRG相比)。在一个实施方案中，本发明所述的抗体以12，5yg/ml的浓度抑制HGF-诱导的 HUVEC细胞增殖至少40% (如在实施例4中所述)(与作为对照的单独的HGF相比)。双特异性抗体形式本发明的抗体具有两个以上的结合位点，并且是双特异性的。即，即使是在存在多于两个结合位点(即，抗体是三价或多价的)的情形中，所述抗体可以是双特异性的。本发明的双特异性抗体包括，例如多价单链抗体、双抗体和三链抗体，以及具有全长抗体的恒定结构域结构的抗体，另外的抗原结合位点(例如单链Fv、VH结构域和/或VL结构域，Fab, 或(Fab)2)通过一个或多个肽接头连接所述全长抗体的恒定结构域结构。所述抗体可以是来自单一物种的全长抗体，或可以是嵌合化或人源化的。对于具有超过两个抗原结合位点的抗体，一些结合位点可以是相同的，只要所述蛋白具有对于两个不同抗原的结合位点。 即，当第一结合位点特异于ErbB-3时，第二结合位点特异于c-Met，反之亦然。在一个优选的实施方案中，根据本发明的特异性结合人ErbB-3和人c_Met的双特异性抗体包含抗体的Fc区。所述抗体保留特性这意味着在一个实施方案中全长的二价双特异性形式针对人ErbB-3和人c-Met的包含免疫球蛋白恒定区的双特异性、二价抗体可如，例如 WO 2009/080251，WO 2009/080252, WO 2009/080253 或 Ridgway, J. B.，蛋白质工程(Protein Eng.) 9 (1996) 617-621 ；WO 96/027011 ；Merchant, A.M.，等，自然生物技术(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681 ； Atwel 1, S.，等，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 270 (1997) 26-35 和 EP 1870459A1 中的描述进行使用。因此在本发明的一个实施方案中，本发明所述的双特异性<ErbB-3-c-Met>抗体是二价、双特异性抗体，其包含a)特异性结合人ErbB-3的全长抗体的轻链和重链；和b)特异性结合人c-Met的全长抗体的轻链和重链，其中恒定结构域CL和CH1、和/或可变结构域VL和VH被相互替换。在本发明的另一个实施方案中，本发明所述的双特异性<ErbB-3-c-Met>抗体是二价、双特异性抗体，其包含
a)特异性结合人c-Met的全长抗体的轻链和重链；和b)特异性结合人ErbB-3的全长抗体的轻链和重链，其中恒定结构域CL和CH1、和/或可变结构域VL和VH被相互替换。对于如下所述的“凸起-进入-孔洞(knob-into-holes)，，技术的示例性图解结构，参见图2a_c。为了提高这种异二聚体的二价的、双特异性的抗-ErbB-3/抗-c-Met抗体的产量，所述全长抗体的CH3结构域可以通过“凸起_进入-孔洞，，技术改变，该技术用例如WO 96/027011，Ridgway J. B.，等，Protein Eng (蛋白质工程)9 (1996) 617-621 ；和 Merchant， A.M.，等，Nat BiotechnoK自然生物技术)16 (1998) 677-681中的若干实例详细记述。在该方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面，以增加包含这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域之一可以是“凸起”，而另一个是“孔洞”。二硫键的引入稳定该异二聚体(Merchant, A.M，等，Nature Biotech(自然生物技术)16 (1998) 677-681 ；Atwell, S.，等·，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)270 (1997) 26-35) 并增加产率。因此，在本发明的一个方面，所述二价双特异性抗体进一步特征在于一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域分别在包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处相接；其中改变所述界面以促进二价双特异性抗体的形成，其中所述改变的特征在于a)改变一条重链的CH3结构域，由此，在与二价双特异性抗体内的另一条重链的CH3结构域的初始界面相接的一条重链的CH3结构域的初始界面内，氨基酸残基被替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在一条重链的CH3结构域的界面内生成突起，该突起可以定位在另一条重链的CH3结构域的界面内的凹洞中；并且b)改变另一条重链的CH3结构域，由此，在与二价双特异性抗体内的第一 CH3结构域的初始界面相接的第二 CH3结构域的初始界面内，氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在第二 CH3结构域的界面内生成凹洞，第一 CH3结构域的界面内的突起可以定位在该凹洞中。优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)， 酪氨酸(Y)，色氨酸(W)组成的组。优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)组成的组。在本发明的一个方面中，通过引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域相应位置处的氨基酸，进一步改变这两个CH3结构域，从而可以形成两个CH3结构域之间的二硫键。在优选实施方案中，所述二价双特异性抗体包含在“凸起链” CH3结构域中的T366W突变和在“孔洞链”CH3结构域中的T366S，L368A，Y407V突变。还可以使用在CH3结构域之间的另外的链间二硫键(Merchant，Α. Μ.，等，自然生物技术(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681)，例如，通过向“凸起链” CH3结构域中引入Y349C突变和向“孔洞链” CH3结构域中引入E356C突变或S354C突变。因此，在另一个优选的实施方案中，所述二价双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C，T366W突变，在这两个CH3 结构域中的另一个中包含E356C，T366S，L368A，Y407V突变，或所述二价双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C，T366S，L368A，Y407V突变(在一个CH3结构域中的另外的Y349C突变与在另一个CH3结构域中的另外的E356C或S354C突变形成链间二硫键)(总是根据Kabat的EU索引编号)。但是，也可以备选或者另外地使用EP 1870459A1所述的其它凸起-入-孔洞技术。所述二价、双特异性抗体的优选实例是在“凸起链”CH3结构域中的R409D ；K370E突变和在“孔洞链” CH3结构域中的D399K ；E357K突变(总是根据Kabat的EU索引编号)。在另一个优选的实施方案中，所述二价、双特异性抗体包含在“凸起链” CH3结构域中的T366W突变和在“孔洞链” CH3结构域中的T366S，L368A，Y407V突变，并且额外地， 包含在“凸起链” CH3结构域中的R409D ；K370E突变和在“孔洞链” CH3结构域中的D399K ； E357K突变。在另一个优选的实施方案中，所述二价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C，T366S, L368A, Y407V突变，或者所述二价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C， T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C，T366S, L368A, Y407V突变，并且额外地，包含在“凸起链” CH3结构域中的R409D ；K370E突变和在“孔洞链” CH3结构域中的 D399K ；E357K 突变。表达和纯化的以表5和图7所述的形式存在的二价双特异性抗体的实例记述在下述实施例中(例如，见表5和图7)。三价双特异性形式本发明的另一个优选方面是三价、双特异性抗体，其包含a)特异性结合人ErbB-3并且由两个抗体重链和两个抗体轻链组成的全长抗体； 和b)特异性结合人c-Met的一个单链Fab片段，其中b)中所述单链Fab片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链或轻链的 C-或N-末端融合到所述全长抗体。对于如下所述的“凸起-进入-孔洞”技术的示例性图解结构，参见图5a。本发明的另一个优选方面是三价、双特异性抗体，其包含a)特异性结合人ErbB-3并且由两个抗体重链和两个抗体轻链组成的全长抗体； 和b)特异性结合人c-Met的一个单链Fv片段，其中b)中所述单链Fv片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链或轻链的 C-或N-末端融合到所述全长抗体。对于如下所述的“凸起-进入-孔洞”技术的示例性图解结构，参见图5b。因此，表达并纯化具有表1中的scFv-Ab-命名的相对应的三价、双特异性抗体 (见下述实施例)。 在一个优选的实施方案中，所述结合人C-Met的单链Fab或Fv片段通过肽连接体在所述全长抗体的重链的C-末端融合到所述全长抗体。本发明的另一个优选方面是三价、双特异性抗体，其包含a)特异性结合人ErbB-3并且由两个抗体重链和两个抗体轻链组成的全长抗体； 和b)由下述组成的多肽 ba)抗体重链可变结构域(VH)；或bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1 (CHl)，其中所述多肽的VH结构域N端通过肽连接体融合到所述全长抗体的两条重链中的一条重链的C端；C)由下述组成的多肽ca)抗体轻链可变结构域(VL)，或cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)；其中所述多肽的VL结构域N端通过肽连接体融合到所述全长抗体的两条重链中的另一条重链的C端；并且其中b)中所述多肽的抗体重链可变结构域(VH)和C)中所述多肽的抗体轻链可变结构域(VL) —起形成特异性结合人c-Met的抗原结合位点。优选地，b)和C)中所述的肽连接体是相同的，并且是至少25个氨基酸的肽，优选在30和50个氨基酸之间的肽。对于示例性图解结构参见图3a_c。因此，表达并纯化具有表4中的VHVL-Ab-命名的相对应的三价、双特异性抗体 (见下述实施例和图3c)。任选地，b)中所述多肽的抗体重链可变结构域(VH)和C)中所述多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过链间二硫键连接并得以稳定，所述链间二硫键通过在下述位置之间引入二硫键形成i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100，ii)重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43，或iii)重链可变结构域位置101到轻链可变结构域位置100 (总是根据Kabat的EU 索引编号)。例如，引入用于稳定的非天然二硫键的技术记述在WO 94/029350，Rajagopal, V.，等，蛋白质工程(Prot. Engin.) (1997) 1453-59 ；Kobayashi, H.，等，核医学和生物学(Nuclear Medicine & Biology) Vol. 25，(1998) 387-393 ；或 Schmidt，Μ·，等，癌基因 (Oncogene) (1999) 18,1711-1721中。在一个实施方案中，在b)和c)中所述多肽的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，在b)和c)中所述多肽的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置105和轻链可变结构域位置43之间。(总是根据Kabat的EU索引编号)在一个实施方案中，优选在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间没有所述任选的二硫化物稳定的三价、双特异性抗体。通过将单链Fab、Fv片段融合到一条重链上(图5a或5b)或通过将不同多肽融合到全长抗体的两条重链上(图3a_c)，产生异二聚化的、三价双特异性抗体。为了提高这种异二聚化的三价的、双特异性的抗-ErbB-3/抗-c-Met抗体的产量，所述全长抗体的CH3结构域可以通过“凸起-进入-孔洞”技术改变，该技术用例如WO 96/027011， Ridgway J. B.，等，Protein Eng (蛋白质工程)9 (1996) 617-621 ；和 Merchant，A.M.，等， Nat BiotechnoK自然生物技术)16 (1998) 677-681中的若干实例详细记述。在该方法中， 改变两个CH3结构域的相互作用表面，以增加包含这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域之一可以是“凸起”，而另一个是“孔洞”。二硫键的引入稳定该异二聚体(Merchant, Α. M，等，Nature Biotech (自然生物技术)16 (1998) 677-681 ； Atwell，S.，等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270 (1997) 26-35)并增加产率。因此，在本发明的一个方面，所述三价双特异性抗体进一步特征在于全长抗体的一条重链的CH3结构域和该全长抗体的另一条重链的CH3结构域分别在包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处相接；其中改变所述界面以促进二价双特异性抗体的形成，其中所述改变的特征在于a)改变一条重链的CH3结构域，由此，在与二价双特异性抗体内的另一条重链的CH3结构域的初始界面相接的一条重链的CH3结构域的初始界面内，氨基酸残基被替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在一条重链的CH3结构域的界面内生成突起，该突起可以定位在另一条重链的CH3结构域的界面内的凹洞中；并且b)改变另一条重链的CH3结构域，由此，在与三价双特异性抗体内的第一 CH3结构域的初始界面相接的第二 CH3结构域的初始界面内，氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在第二 CH3结构域的界面内生成凹洞，第一 CH3结构域的界面内的突起可以定位在该凹洞中。优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)， 酪氨酸(Y)，色氨酸(W)组成的组。优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)组成的组。在本发明的一个方面中，通过引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域相应位置处的氨基酸，进一步改变这两个CH3结构域，从而可以形成两个CH3结构域之间的二硫键。在优选实施方案中，所述三价双特异性抗体包含在“凸起链” CH3结构域中的T366W突变和在“孔洞链”CH3结构域中的T366S，L368A，Y407V突变。还可以使用在CH3结构域之间的另外的链间二硫键(Merchant，Α. Μ.，等，自然生物技术(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681)，例如，通过向“凸起链” CH3结构域中引入Y349C突变和向“孔洞链”CH3结构域中引入E356C突变或S354C突变。因此，在另一个优选的实施方案中，所述三价双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个 CH3结构域中的另一个中的E356C，T366S，L368A，Y407V突变，或所述三价双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C，T366S，L368A，Y407V突变(在一个CH3结构域中的另外的Y349C突变与在另一个CH3结构域中的另外的E356C或S354C突变形成链间二硫键)(总是根据Kabat的EU索引编号)。但是，也可以备选或者另外地使用EP 1870459A1所述的其它凸起-入-孔洞技术。所述三价、双特异性抗体的优选实例是在“凸起链”CH3结构域中的R409D ；K370E突变和在“孔洞链” CH3结构域中的D399K ；E357K突变(总是根据Kabat的EU索引编号)。在另一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含在“凸起链” CH3结构域中的T366W突变和在“孔洞链” CH3结构域中的T366S，L368A，Y407V突变，并且额外地， 包含在“凸起链” CH3结构域中的R409D ；K370E突变和在“孔洞链” CH3结构域中的D399K ； E357K突变。在另一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C，T366S, L368A, Y407V突变，或者所述三价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C， T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C，T366S, L368A, Y407V突变，并且额外地，包含在“凸起链” CH3结构域中的R409D ；K370E突变和在“孔洞链” CH3结构域中的 D399K ；E357K 突变。本发明的另一个实施方案是三价、双特异性抗体，其包含a)全长抗体，其特异性结合人ErbB-3并且由下述组成aa)两个抗体重链，其在N-端至C-端方向由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定重链结构域1 (CHl)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2 (CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成；和ab)两个抗体轻链，其在N-端至C-端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL) (VL-CL)组成；和b) 一个特异性结合人c-Met的单链Fab片段，其中所述单链Fab片段由抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1 (CHl)，抗体轻链可变结构域(VL)，抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成，并且其中所述抗体结构域和所述接头在N-端至C-端方向具有下述顺序之一ba) VH-CHl-接头-VL-CL，或 bb) VL-CL-接头-VH-CH1 ；其中所述接头是至少30个氨基酸的肽，优选在32和50个氨基酸残基之间的肽；并且其中b)中所述单链Fab片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链或轻链的C-或N-末端(优选重链的C-末端)融合到所述全长抗体；其中所述肽连接体是至少5个氨基酸的肽，优选在10和50个氨基酸之间的肽。在这一实施方案中，优选地，所述三价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的T366S，L368A, Y407V突变，并且更优选地，所述三价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C (或E356C)，T366S, L368A, Y407V突变。任选地，在所述实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含在“凸起链”CH3结构域中的R409D ； K370E突变和在“孔洞链” CH3结构域中的D399K ；E357K突变。本发明的另一个实施方案是三价、双特异性抗体，其包含a)全长抗体，其特异性结合人ErbB-3并且由下述组成aa)两个抗体重链，其在N-端至C-端方向由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定重链结构域1 (CHl)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2 (CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成；和ab)两个抗体轻链，其在N-端至C-端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL) (VL-CL)组成；和b) 一个特异性结合人c-Met的单链Fv片段，其中b)中所述单链Fv片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链或轻链的 C-或N-末端(优选重链的C-末端)融合到所述全长抗体；其中所述肽连接体是至少5个氨基酸的肽，优选在10和50个氨基酸之间的肽。在这一实施方案中，优选地，所述三价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的T366S，L368A, Y407V突变，并且更优选地，所述三价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C (或E356C)，T366S, L368A, Y407V突变。任选地，在所述实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含在“凸起链”CH3结构域中的R409D ； K370E突变和在“孔洞链” CH3结构域中的D399K ；E357K突变。因此，优选的实施方案是三价、双特异性抗体，其包含a)全长抗体，其特异性结合人ErbB-3并且由下述组成aa)两个抗体重链，其在N-端至C-端方向由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定重链结构域1 (CHl)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2 (CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成；和ab)两个抗体轻链，其在N-端至C-端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL) (VL-CL)组成；和b) 一个特异性结合人c-Met的单链Fv片段，其中b)中所述单链Fv片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链的C-末端融合到所述全长抗体(产生两抗体重链_单链Fv融合肽)；和其中所述肽连接体是至少5个氨基酸的肽。在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ ID NO 26的多肽作为第一抗体重链_单链Fv融合肽，SEQ ID NO ,21的多肽作为第二抗体重链_单链Fv融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO :28ο在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ ID NO 29的多肽作为第一抗体重链_单链Fv融合肽，SEQ ID NO 30的多肽作为第二抗体重链-单链Fv融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO :31ο在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ ID NO :32的多肽作为第一抗体重链_单链Fv融合肽，SEQ ID NO 33的多肽作为第二抗体重链-单链Fv融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO :34ο在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ ID NO :35的多肽作为第一抗体重链_单链Fv融合肽，SEQ ID NO 36的多肽作为第二抗体重链-单链Fv融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO :37ο在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ ID NO 38的多肽作为第一抗体重链_单链Fv融合肽，SEQ ID NO 39的多肽作为第二抗体重链-单链Fv融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO :40ο
本发明的另一个实施方案是三价、双特异性抗体，其包含a)全长抗体，其特异性结合人ErbB-3并且由下述组成aa)两个抗体重链，其在N-端至C-端方向由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定重链结构域1 (CHl)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2 (CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成；和ab)两个抗体轻链，其在N-端至C-端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)组成；和b)由下述组成的多肽ba)抗体重链可变结构域(VH)；或bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1 (CHl)，其中所述多肽的VH结构域N端通过肽连接体融合到所述全长抗体的两条重链中的一条重链的C端(产生抗体重链-VH融合肽)，其中所述肽连接体是至少5个氨基酸的肽，优选在25和50个氨基酸之间的肽；c)由下述组成的多肽ca)抗体轻链可变结构域(VL)，或cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)；其中所述多肽的VL结构域N端通过肽连接体融合到所述全长抗体的两条重链中的另一条重链的C端(产生抗体重链-VL融合肽)；其中所述肽连接体与b)中所述肽连接体相同；并且其中b)中所述多肽的抗体重链可变结构域(VH)和C)中所述多肽的抗体轻链可变结构域(VL) —起形成特异性结合人c-Met的抗原结合位点。在这一实施方案中，优选地，所述三价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的T366S，L368A, Y407V突变，并且更优选地，所述三价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C (或E356C)，T366S, L368A, Y407V突变。任选地，在所述实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含在“凸起链”CH3结构域中的R409D ； K370E突变和在“孔洞链” CH3结构域中的D399K ；E357K突变。在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ ID NO 11的多肽作为抗体重链-VH融合肽，SEQ ID NO 12的多肽作为抗体重链-VL融合肽，和两个抗体轻链 SEQ ID NO :13ο在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ ID NO 14的多肽作为抗体重链-VH融合肽，SEQ ID NO 15的多肽作为抗体重链-VL融合肽，和两个抗体轻链 SEQ ID NO :16。在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ ID NO 17的多肽作为抗体重链-VH融合肽，SEQ ID NO 18的多肽作为抗体重链-VL融合肽，和两个抗体轻链 SEQ ID NO :19。在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ ID NO 20的多肽作为抗体重链-VH融合肽，SEQ ID NO :21的多肽作为抗体重链-VL融合肽，和两个抗体轻链 SEQ ID NO :22。
在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ ID NO :23的多肽作为抗体重链-VH融合肽，SEQ ID NO 24的多肽作为抗体重链-VL融合肽，和两个抗体轻链 SEQ ID NO :25。在本发明的另一个方面中，本发明所述的三价、双特异性抗体包含a)结合人ErbB-3的全长抗体，其由两个抗体重链VH-CH1-HR-CH2-CH3和两个抗体轻链VL-CL组成；(其中优选地，两个CH3结构域中的一个包含Y349C，T366W突变，并且这两个CH3 结构域中的另一个包含S354C (或E356C)，T366S, L368A, Y407V突变)；b)由下述组成的多肽ba)抗体重链可变结构域(VH)；或bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1 (CHl)，其中所述多肽的VH结构域N端通过肽连接体融合到所述全长抗体的两条重链中的一条重链的C端；c)由下述组成的多肽ca)抗体轻链可变结构域(VL)，或cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)；其中所述多肽的VL结构域N端通过肽连接体融合到所述全长抗体的两条重链中的另一条重链的C端；并且其中b)中所述多肽的抗体重链可变结构域(VH)和C)中所述多肽的抗体轻链可变结构域(VL) —起形成特异性结合人c-Met的抗原结合位点。四价双特异性形式在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体是四价的，其中特异性结合人 c-Met的抗原结合位点抑制c-Met 二聚化(例如，如在WO 2009/007427中所述)。因此，本发明的另一个优选方面是四价、双特异性抗体，其包含a)全长抗体，其特异性结合人ErbB-3并且由两个抗体重链和两个抗体轻链组成； 和b)特异性结合人c-Met的两个相同的单链Fab片段，其中b)中所述单链Fab片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链或轻链的 C-或N-末端融合到所述全长抗体。因此，本发明的另一个方面是四价、双特异性抗体，其包含a)全长抗体，其特异性结合人c-Met并且由两个抗体重链和两个抗体轻链组成； 和b)特异性结合人ErbB-3的两个相同的单链Fab片段，其中b)中所述单链Fab片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链或轻链的 C-或N-末端融合到所述全长抗体。对于示例性图解结构，参见图6a。因此，本发明的另一个优选方面是四价、双特异性抗体，其包含a)全长抗体，其特异性结合人ErbB-3并且由两个抗体重链和两个抗体轻链组成； 和
b)特异性结合人c-Met的两个相同的单链Fv片段，其中b)中所述单链Fv片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链或轻链的 C-或N-末端融合到所述全长抗体。因此，本发明的另一个优选方面是四价、双特异性抗体，其包含a)全长抗体，其特异性结合人C-Met并且由两个抗体重链和两个抗体轻链组成； 禾口b)特异性结合人ErbB-3的两个相同的单链Fv片段，其中b)中所述单链Fv片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链或轻链的 C-或N-末端融合到所述全长抗体。对于示例性图解结构，参见图6b。在一个优选的实施方案中，所述结合人c-Met或人ErbB-3的单链Fab或Fv片段通过肽连接体在所述全长抗体的重链的C-端融合到所述全长抗体。本发明的另一个实施方案是四价、双特异性抗体，其包含a)全长抗体，其特异性结合人ErbB-3并且由下述组成aa)两个相同的抗体重链，其在N-端至C-端方向由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定重链结构域1 (CHl)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2 (CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成；和ab)两个相同的抗体轻链，其在N-端至C-端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL) (VL-CL)组成；和b)特异性结合人c-Met的两个单链Fab片段，其中所述单链Fab片段由抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1 (CHl)，抗体轻链可变结构域(VL)，抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成，并且其中所述抗体结构域和所述接头在N-端至C-端方向具有下述顺序之一ba) VH-CHl-接头-VL-CL，或 bb) VL-CL-接头-VH-CH1 ；其中所述接头是至少30个氨基酸的肽，优选在32和50个氨基酸残基之间的肽；并且其中b)中所述单链Fab片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链或轻链的C-或N-末端融合到所述全长抗体；其中所述肽连接体是至少5个氨基酸的肽，优选在10和50个氨基酸之间的肽。当用在三价或四价形式中时，术语“全长抗体”指由两条“全长抗体重链”和两条 “全长抗体轻链”组成的抗体(见图1)。“全长抗体重链”是这样的多肽，其在N端到C端方向由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定重链结构域1 (CHl)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2 (CH2)，和抗体重链恒定结构域3 (CH3)组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3 ；并且在IgE亚类的抗体的情形中，任选地还包括抗体重链恒定结构域4(CH4)。优选地，“全长抗体重链”是在N端到C端方向由VH，CHI, HR, CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”是在N端到C端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽， 缩写为VL-CL。所述抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ (kappa)或λ (lambda) 0两条全长抗体链通过在CL结构域和CHl结构域之间的多肽间二硫键和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的实例是天然抗体如IgG(例如，IgGl和 IgG2)，IgM，IgA，IgDjP IgE。根据本发明所述的全长抗体可以来自单一物种，例如人，或它们可以是嵌合的或人源化的抗体。根据本发明所述的全长抗体包含分别由VH和VL配对形成的两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点都特异性结合于相同的抗原。所述全长抗体的重链或轻链的C端指在所述重链或轻链的C端的最后的氨基酸。所述全长抗体的重链或轻链的N端指在所述重链或轻链的N端的最后的氨基酸。术语“肽连接体”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成来源的。 这些本发明所述的肽连接体用于将单链Fab片段融合到全长抗体的C-或N-端，以形成本发明所述的多特异性抗体。优选地，b)中所述肽连接体是具有长度为至少5个氨基酸的氨基酸序列的肽，优选长度为5-100个、更优选长度为10-50个氨基酸的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽连接体是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘氨酸，S=丝氨酸，且(χ =3，η = 3，4，5 或 6，且 m = 0，1，2 或 3)或(χ = 4，η = 2，3，4 或 5 且 m = 0，1，2 或 3)， 优选地χ = 4且η = 2或3，更优选地χ = 4，η = 2。优选地，在三价、双特异性抗体中，其中VH或VH-CHl多肽和VL或VL-CL多肽(图7a_c)通过两个相同的肽连接体融合到全长抗体的C-端，所述肽连接体是至少25个氨基酸的肽，优选是30-50个氨基酸的肽，并且更优选地，所述肽连接体是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘氨酸，S=丝氨酸，且(χ = 3，n = 6，7 或 8，且 m = 0，1，2 或 3)或(χ = 4，n = 5，6，或7且111 = 0，1，2 或 3)，优选 χ = 4 且 η =5,6,7。“单链Fab片段”(见图2a)是由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定结构域 1 (CHl)，抗体轻链可变结构域(VL)，抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头从N端到C端方向具有下列顺序之一 a) VH-CHl-接头-VL-CL，b) VL-CL-接头-VH-CHl，c) VH-CL-接头-VL-CH1或d) VL-CHl-接头-VH-CL ；并且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽，优选地32-50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段a) VH-CHl-接头-VL-CL，b) VL-CL-接头-VH-CH1，c) VH-CL-接头-VL-CH1 和 d) VL-CHl-接头-VH-CL，通过在CL结构域和CHl结构域之间的天然二硫键稳定。术语“N-端”指N-端的最后的氨基酸。术语“C-端”指C-端的最后的氨基酸。术语“接头”在本发明中与单链Fab片段联系使用，并且指具有氨基酸序列的肽， 其优选地是合成来源的。将本发明所述的这些肽用于连接a)VH-CHl与VL-CL，b)VL-CL 与VH-CHl，c) VH-CL与VL-CHl或d) VL-CHl与VH-CL，从而形成下列本发明所述的单链 Fab 片段a) VH-CHl-接头-VL-CL，b) VL-CL-接头-VH-CH1，c) VH-CL-接头-VL-CH1 或 d) VL-CHl-接头-VH-CL。在所述单链Fab片段中的所述接头是具有至少30个氨基酸长度的氨基酸序列，优选地具有32-50个氨基酸长度的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述接头是(GxS)n，其中G =甘氨酸，S =丝氨酸，(χ = 3，η = 8，9或10和m = 0，1，2或3)或(χ =4禾口 η = 6，7或8和m = 0，1，2或3)，优选地其中χ = 4，n = 6或7和m = 0，1，2或3， 更优选地x = 4，n = 7和m = 2。在一个实施方案中，所述接头是(G4S) 6G2。在一个优选的实施方案中，在所述单链Fab片段中的所述抗体结构域和所述接头在N-端至C-端方向具有下述顺序之一a) VH-CHl-接头-VL-CL，或 b) VL-CL-接头-VH-CHl，更优选地 VL-CL-接头-VH-CHl。在另一个优选的实施方案中，在所述单链Fab片段中的所述抗体结构域和所述接头在N-端至C-端方向具有下述顺序之一
a) VH-CL-接头-VL-CH1 或 b) VL-CHl-接头-VH-CL。任选地，在所述单链Fab片段中，除了在CL-结构域和CHl结构域之间的天然二硫键之外，还通过在下列位置之间引入二硫键来对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)进行二硫化物稳定i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100，ii)重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43，或iii)重链可变结构域位置101到轻链可变结构域位置100 (总是根据Kabat的EU 索引编号)。单链Fab片段的这些另外的二硫化物稳定通过在单链Fab片段的可变结构域VH 和VL之间引入二硫键来实现。例如，引入非天然的二硫键来稳定单链Fv的技术描述在WO 94/029350, Rajagopal，V.，等，蛋白质工程(Prot. Engin.) (1997) 1453-59 ；Kobayashi，H.， 等，核医学和生物学(Nuclear Medicine & Biology), Vol. 25，(1998)387-393 ；或khmidt， Μ.，等，癌基因(Oncogene) (1999) 18，1711-1721中。在一个实施方案中，包含在本发明所述的抗体中的单链Fab片段的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，包含在本发明所述的抗体中的单链Fab 片段的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置105和轻链可变结构域位置43之间(总是根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，优选在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间不具有所述任选的二硫化物稳定的单链Fab片段。“单链Fv片段”(见图2b)是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体轻链可变结构域 (VL)、和单链Fv接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述单链Fv接头从N端到C端方向具有下列顺序之一 a) VH-单链Fv接头-VL，b) VL-单链Fv接头-VH ；优选a) VH-单链Fv 接头-VL，并且其中所述单链Fv接头是具有至少15个氨基酸长度的氨基酸序列的多肽，在一个实施方案中，是具有至少20个氨基酸长度的氨基酸序列的多肽。术语“N-端”指N端的最后的氨基酸。术语“ C-端，，指C端的最后的氨基酸。当用于单链Fv片段中时，术语“单链Fv接头”指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成来源的。所述单链Fv接头是具有至少15个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，在一个实施方案中，是具有至少20个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，且优选是具有15-30个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述单链接头是(fo^)n，其中G=甘氨酸， S =丝氨酸，(χ = 3 且 η = 4，5 或 6)或(χ = 4 且 η = 3，4，5 或 6)，优选 χ = 4，η = 3，4 或5，更优选χ = 4，η = 3或4。在一个实施方案中，所述单链Fv接头是(G4S)3或(G4S)40此外，所述单链Fv片段优选是二硫化物稳定的。单链抗体的这些另外的二硫化物稳定通过在单链抗体的可变结构域之间引入二硫键来实现，并且，例如，在WO 94/029350, Rajagopal, V.，等，蛋白质工程(Prot. Engin.) 10 (1997) 1453-59 ；Kobayashi, H.，等，核医学和生物学(Nuclear Medicine& Biology), Vol. 25 (1998) 387-393 ；或 khmidt，M.，等，癌基因(Oncogene) 18(1999) 1711-1721 中所述。在二硫化物稳定的单链Fv片段的一个实施方案中，对于每种单链Fv片段，包含在本发明所述的抗体中的单链Fv片段的可变结构域之间的二硫键独立地选自i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100，
ii)重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43，或iii)重链可变结构域位置101到轻链可变结构域位置100。在一个实施方案中，包含在本发明所述的抗体中的单链Fv片段的可变结构域之间的二硫键在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。本发明所述的抗体由重组方式产生。因此，本发明的一个方面是编码本发明所述的抗体的核酸，并且另一个方面是包含编码本发明所述的抗体的核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术中广泛已知的并且包括在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达， 以及随后的抗体分离和通常纯化为药用纯度。对于前述抗体在宿主细胞中的表达，将编码各个修饰的轻链和重链的核酸通过标准方法插入表达载体中。在适合的原核或真核宿主细胞如CHO细胞，NSO细胞，SP2/0细胞，HEK293细胞，COS细胞，PER. C6细胞，酵母， 或大肠杆菌(E. coli)细胞中进行表达，并且将所述抗体从细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收。用于抗体重组生产的一般方法是现有技术中公知的，并且例如在Makrides， S. C.，蛋白表达和纯化(Protein Expr. Purif.) 17 (1999) 183-202 ；Geisse, S.，等，蛋白表达和纯化(Protein Expr. Purif.) 8 (1996) 271-282 ；Kaufman, R.J.，分子生物技术(Mol. Biotechnol.) 16 (2000) 151-161 ；Werner, R. G.，药物研究(Drug Res.) 48 (1998) 870-880 的综述文章中描述。通过常规免疫球蛋白纯化方法，将双特异性抗体适当地从培养基中分离，所述纯化方法如，例如蛋白质A-琼脂糖，羟基磷灰石层析法，凝胶电泳，透析或亲和层析法。编码所述单克隆抗体的DNA和RNA容易地使用常规方法进行分离和测序。杂交瘤细胞可以充当所述DNA和RNA的来源。一旦被分离，可以将DNA插入表达载体中，所述表达载体接着被转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如HEK 293细胞、CHO细胞、或骨髓瘤细胞中，从而在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。双特异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)通过将适合的核苷酸变化引入抗体 DNA中，或通过核苷酸合成进行制备。然而，这样的修饰可以仅在例如如上述的非常有限的范围内进行。例如，修饰不改变上述提及的抗体特征如IgG同种型和抗原结合，但是可以提高重组生产的产率、蛋白稳定性或有利于纯化。术语“宿主细胞”用于本申请时是指可以被改造从而产生本发明所述的抗体的细胞系统的任何种类。在一个实施方案中，将HEK293细胞和CHO细胞用作宿主细胞。用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且全部这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和来源于其的培养物，而不考虑转移数。还理解，由于有意或无意的突变，所有的后代的DNA内容物可能不精确一致。包括具有与在最初转化的细胞中筛选的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的变体后代。在NSO细胞中的表达记述在，例如，Barnes, L. Μ.，等，细胞技术学 (Cytotechnology) 32 (2000) 109-123 ；Barnes, L. Μ.，等，生物技术和生物工程(Biotech. Bioeng. )73(2001)261-270中。瞬时表达记述在，例如，Durocher，Y.，等，核酸研究(Nuc 1. Acids. Res.) 30 (2002) E9中。可变结构域的克隆记述在Orlandi，R.，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 86 (1989) 3833-3837 ；Carter, P.，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 89 (1992) 4285-4289 ；和 Norderhaug，L.，等，免疫学方法杂志(J. Immunol. Method) 204 (1997) 77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK 293)记述在Schlaeger, E. -J.，和 Christensen，K.，细胞技术学(Cytotechnology) 30 (1999) 71-83 中和 Schlaeger, E. -J.，免疫学方法杂志(J. Immunol. Methods) 194 (1996) 191-199 中。适合用于原核生物的控制序列，例如包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。当核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中时，其是“可操作地连接的”。例如，前序列(pre-sequence)或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白(pre-protein)；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在阅读框中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适体或接头。通过标准技术，包括碱/SDS处理，CsCl分级(CsCl banding)，柱层析法，琼脂糖凝胶电泳，和其它本领域公知的技术，进行抗体的纯化从而消除细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白。见Ausubel，F.，等，编，现代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing 禾口 Wiley Interscience, (1987)。不同的方法是充分建立的并且广泛用于蛋白纯化，如用微生物蛋白进行的亲和层析法(例如，蛋白质A或蛋白质G亲和层析法)，离子交换层析法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换)，亲硫吸附(例如，用巯基乙醇和其它SH 配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析法(例如用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂， 或间-氨基苯基硼酸)，金属螯合亲和层析法(例如用Ni (II)-和Cu (II)-亲和性材料)， 大小排阻层析法和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)(Vijayalakshmi，Μ. Α.，应用生物化学生物技术(App 1. Biochem. Biotech.) 75 (1998) 93-102)。用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且全部这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和来源于其的培养物，而不考虑转移数。还理解，由于有意或无意的突变，所有的后代的DNA内容物可能不精确一致。包括具有与在最初转化的细胞中筛选的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的变体后代。在需要不同命名的情形中，其将从上下文中变得清楚。术语“转化”用于本文中时，指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果将不具有难以克服的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，则转染例如通过如Graham，F. L.，和 van der Eh, A.J.，Virology (病毒学)52 (1973) 456-467所述的磷酸钙沉淀法来进行。然而，还可以使用其他将DNA引入细胞的方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含实质细胞壁结构的细胞，例如一种转染方法是利用氯化钙的钙处理，如 Cohen, F. N，等，PNAS (美国国家科学院学报)· 69 (1972) 7110ff所述。用于本文中时，“表达”指将核酸转录为mRNA的过程和/或将转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和所编码的多肽共同称为基因产物。 如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。“载体”是一种核酸分子，特别是自体复制的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞之中和/或之间。该术语包括主要功能为将DNA或RNA插入细胞(例如，染色体整合)的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，和功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供多于一种上述功能的载体。“表达载体”是一种多核苷酸，其在引入到合适的宿主细胞中时能够被转录和翻译为多肽。“表达系统”通常指包括表达载体的适当宿主细胞，所述表达载体可以起作用产生所需的表达产物。药物组合物本发明的一个方面是包含本发明所述的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是本发明所述的抗体用于制备药物组合物的应用。本发明的另一个方面是制备包含本发明所述的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面中，本发明提供一种组合物，例如，一种药物组合物，其包含本发明所述的抗体，本发明所述的抗体与药物载体一起配制。本发明的一个实施方案是用于治疗癌症的本发明所述的双特异性抗体。本发明的另一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。本发明的另一个方面是本发明所述的抗体用于制备用于治疗癌症的药物的应用。本发明的另一个方面是治疗患有癌症的患者的方法，其通过向需要所述治疗的患者施用本发明所述的抗体进行。当用于本文时，“药物载体”包括生理相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、 抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，所述载体适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。本发明的组合物可以通过多种本领域已知的方法施用。如技术人员清楚地，施用的路径和/或方式将根据需要的结果变化。为了通过某些施用路径施用本发明的化合物， 可能需要用防止其失活的材料包被所述化合物，或使所述化合物与防止其失活的材料共同施用。例如，所述化合物可以在适合的载体或稀释剂中施用于受试者，所述载体例如是脂质体。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这些介质和药剂用于药物活性物质是本领域已知的。措辞“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”用于本文时意为除了肠和局部施用之外的施用方式，通常通过注射施用，并且包括，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下、脊内、硬膜外和胸骨内注射和输注。术语癌症用于本文时指增生性疾病，如淋巴瘤(lymphomas)，淋巴细胞白血病 (lymphocytic leukemias),月市癌(lung cancer),非小细胞肺(NSCL)癌(non small cell lung (NSCL) cancer),支气管月市泡细胞月市癌(bronchio loalvio Iar cell lung cancer),骨
(bone cancer)，月夷—(pancreatic cancer)，1 月夫· (skin cancer), ^JlKSIilS (cancer of the head or neck)，夫 $ 目艮内 11 ;) (cutaneous or intraocular melanoma)，〒宫癌(uterine cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，直肠癌(rectal cancer),月工区癌(cancer of the anal region)，胃· (stomach cancer), (gastric cancer),(colon
cancer),乳腺癌(breast cancer),子宫癌(uterine cancer),输卵管癌(carcinoma of the fallopian tubes),子宫内膜癌(carcinoma of the endometrium),子宫颈癌 (carcinoma of the cervix)，阴道癌(carcinoma of the vagina),夕卜阴癌(carcinomaof the vulva)，霍奇金病(Hodgkin' s Disease)，食管癌(cancer of the esophagus), 小肠癌(cancer of the small intestine),内分泌系统癌(cancer of the endocrine system)，甲状腺癌(cancer of the thyroid gland)，甲状旁腺癌(cancer of the parathyroid gland)，l^f 上—(cancer of the adrenal gland), ^1 ^ (sarcoma of soft tissue),尿道癌(cancer of the urethra)，阴莲癌(cancer of the penis),前列腺癌(prostate cancer),膀胱癌(cancer of the bladder),肾癌或输尿管癌(cancer of the kidney or ureter),肾细胞癌(renal cell carcinoma)，肾盂癌(carcinoma of the renal pelvis),间皮瘤(mesothelioma),肝细胞癌(hepatocellular cancer),胆管癌(biliary cancer),中枢神经系统(CNS)月中瘤(neoplasms of the central nervous system(CNS)), 脊椎轴肿瘤(spinal axis tumors)，脑干胶质瘤(brain stem glioma)，多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme),星形细胞瘤(astrocytomas),神经鞘瘤(schwanomas),室管膜瘤(印endymonas)，成髓细胞瘤(medulloblastomas)，脑膜瘤(meningiomas)，鳞状细胞癌(squamous cell carcinomas)，垂体腺瘤(pituitary adenoma)，禾口尤因肉瘤(Ewings sarcoma)，包括任一种上述癌症的难治性形式，或一种或多种上述癌症的组合。本发明的另一方面是作为抗-血管生成剂的本发明所述的双特异性抗体或所述药物组合物。这种抗-血管生成剂可用于治疗癌症(特别是实体瘤)和其它血管疾病。本发明的一个实施方案是用于治疗血管疾病的本发明所述的双特异性抗体。本发明的另一方面是本发明所述的抗体用于制备用于治疗血管疾病的药物的应用。本发明的另一方面是治疗患有血管疾病的患者的方法，其通过向需要这种治疗的患者施用本发明所述的抗体进行。术语“血管疾病(vascular diseases) ”包括癌症(Cancer)，炎症疾病 (Inflammatory diseases),云力脉粥样硬化(Atherosclerosis), iE^iil (Ischemia),仓丨J伤 (Trauma)，脓毒症(S印sis)，COPD,哮喘(Asthma)，糖尿病(Diabetes)，AMD,视网膜病 (Retinopathy)，中风(Stroke)，肥胖(Adipositas)，急性肺损伤(Acute lung injury)， 出血(Hemorrhage)，血管渗漏(Vascular leak)(例如细胞因子诱导的血管渗漏)，变态反应(Allergy)，格雷夫斯病(Graves，Disease)，桥本自身免疫性甲状腺炎(Hashimoto，s Autoimmune Thyroiditis),(Idiopathic Thrombocytopenic Purpura)，巨细胞动脉炎(Giant Cell Arteritis)，类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis)，系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus (SLE))，狼疮性肾炎(Lupus N印hritis)，局限性回肠炎(Crohn，s Disease)，多发性硬化(Multiple Sclerosis), 溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis)，特别是实体瘤，眼内新血管综合征(intraocular neovascular syndrome)诸如增殖性视网膜病(proliferative retinopathies)或年龄相关的黄斑变个生(age-related macular degeneration) (AMD)，类风 关节炎(rheumatoid arthritis)和银屑病(psoriasis) (Folkman, J.，和 Shing，Y.，等，J. Biol. Chem.(生物化学杂志)267 (1992) 10931-10934 ；Klagsbrun, Μ·，等，Annu. Rev. Physiol.(生理学年度综述)53 (1991) 217-239 ；和 Garner，Α.，Vascular diseases (血管疾病)，在Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach (目艮禾斗疾病，艮口动力学途径的病理学)，Garner, A.，和 Klintworth，G. K，(编)第 2 版，Marcel Dekker，纽约(1994)，第 1625-1710 页)。
这些组合物还可以包含辅药如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止微生物的存在可以通过灭菌方法(见上文)和通过包含各种抗细菌和抗真菌药剂来确保，所述抗细菌和抗真菌药剂例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。可能需要在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延缓吸附的试剂如单硬脂酸铝和明胶来导致可注射药物形式的延长的吸收。不管所选择的施用路径为何，通过本领域技术人员已知的常规方式，将可以以适合的水合形式使用的本发明的化合物、和/或本发明的药物组合物配制成药用剂型。在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化从而获得这样的活性成分的量，其对于特定的患者、组合物和施用方式有效获得需要的治疗反应，而不会对患者具有毒性。选定的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本发明的特定组合物的活性、施用路径、施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、治疗的延续时间、 与所用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和以前的医疗病史，以及医疗领域中公知的类似因素。所述组合物必需是无菌和可流动的，到所述组合物可通过注射器递送的程度。除了水之外，所述载体优选地是等渗缓冲的盐水溶液。适当的流动性可以例如通过使用涂层如磷脂酰胆碱(lecithin)，在分散体的情形中通过维持需要的颗粒大小，和通过使用表面活性剂来维持。在许多情形中，优选在所述组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇、和氯化钠。现在已经可见，本发明所述的针对人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体具有有价值的特征，诸如生物学或药理学活性、药物代理动力学特性。与亲本<ErbB3>和/或<c-Met> 抗体相比，本发明所述的双特异性<ErbB3-c-Met>抗体表现出减少的内在化。提供下述实施例、序列表和附图来辅助理解本发明，本发明的真正范围在后附的权利要求书中描述。应该理解，在不背离本发明的精神的前提下，可以在所述的方法中进行
修改。
氨基mWi丨描沭
SEQIDNO1重链可变结构域<ErbB-3>HER3克隆四
SEQIDNO2轻链可变结构域<ErbB-3>HER3克隆四
SEQIDNO3重链可变结构域<c-Met>Mab 5D5
SEQIDNO4轻链可变结构域<c-Met>Mab 5D5
SEQIDNO5重链<ErbB-3>HER3克隆四
SEQIDNO6轻链<ErbB-3>HER3克隆四
SEQIDNO7 重链 <c-Met> Mab 5D5
SEQIDNO8 轻链 <c-Met> Mab 5D5
SEQIDNO9 重链 <c-Met>Fab 5D5
SEQIDNO:10 轻链 <c-Met>Fab 5D5
SEQIDNO:11 重链 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS
SEQIDNO12 重链 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS
SEQIDNO13 轻链 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS
SEQIDNO14 重链 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH
SEQIDNO15重链 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH
SEQIDNO16轻链 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH
SEQIDNO17重链 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS
SEQIDNO18重链 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS
SEQIDNO19轻链 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS
SEQIDNO20重链 KErbB3-c-Met>Her3/Met_lC
SEQIDNO21重链 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_lC
SEQIDNO22轻链 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_lC
SEQIDNO23重链 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C
SEQIDNO24重链 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C
SEQIDNO25轻链 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C
SEQIDNO26重链 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvSSKHSS
SEQIDNO27重链 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvSSKHSS
SEQIDNO28轻链 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvSSKHSS
SEQIDNO29重链 l<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvSSKH
SEQIDNO30重链 2<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvSSKH
SEQIDNO31轻链 <ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvSSKH
SEQIDNO32重链 l<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKH
SEQIDNO33重链 2<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKH
SEQIDNO34轻链 <ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKH
SEQIDNO35重链 l<ErbB3-c-Met> Her3/Me_scFvKHSB
SEQIDNO36重链 2<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKHSB
SEQIDNO37轻链 <ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKHSB
SEQIDNO38重链 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvKHSBSS
SEQIDNO39重链 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvKHSBSS
SEQIDNO40轻链 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvKHSBSS
SEQIDNO41人IgGl的重链恒定区
SEQIDNO42人IgG3的重链恒定区
SEQIDNO43人轻链κ恒定区
SEQIDNO44人轻链λ恒定区
SEQIDNO45人 c-Met
SEQIDNO46人 ErbB-3
SEQIDNO47重链可变结构域VH，<ErbB3>Mab 205 (鼠)
SEQIDNO48轻链可变结构域VL，<ErbB3>Mab 205 (鼠)
SEQIDNO49重链可变结构域VH，<ErbB3>Mab 205. 10 (人源化的)
SEQIDNO50轻链可变结构域VL, <ErbB3>Mab 205. 10. 1 (人源化的)
SEQIDNO51轻链可变结构域VL, <ErbB3>Mab 205. 10. 2 (人源化的)
SEQIDNO52轻链可变结构域VL, <ErbB3>Mab 205. 10. 3 (人源化的)
SEQIDNO53重链 CDR3H, <ErbB3>Mab 205. 10
SEQIDNO54重链 CDR2H, <ErbB3>Mab 205. 10
SEQIDNO55重链 CDR1H, <ErbB3>Mab 205. 10
SEQIDNO56轻链 CDR3L, <ErbB3>Mab 205. 10
SEQIDNO57轻链 CDR2L, <ErbB3>Mab 205. 10
SEQIDNO58轻链 CDRlL (变体 1)，<ErbB3>Mab 205
SEQIDNO59轻链 CDRlL (变体 2)，<ErbB3>Mab 205
SEQIDNO60重链 CDR3H, <ErbB3>HER3 克隆四
SEQIDNO61重链 CDR2H, <ErbB3>HER3 克隆四
SEQIDNO62重链 CDR1H，<ErbB3>HER3 克隆 29
SEQIDNO63轻链 CDR3L, <ErbB3>HER3 克隆四
SEQIDNO64轻链 CDR2L, <ErbB3>HER3 克隆四
SEQIDNO65轻链 CDRlL<ErbB3>HER3 克隆四
SEQIDNO66重链 CDR3H, <c-Met>Mab 5D5
SEQIDNO67重链 CDR2H, <c-Met>Mab 5D5
SEQIDNO68重链 CDR1H, <c-Met>Mab 5D5
SEQIDNO69轻链 CDR3L, <c-Met>Mab 5D5
SEQIDNO70轻链 CDR2L, <c-Met>Mab 5D5
SEQIDNO71轻链 CDRlL<c-Met>Mab 5D5
附图描沭
图1特异性结合第一抗原1的不具有CH4结构域的4
全长抗体具有以典型顺序包含可变结构域和恒定结构域的两对重链和轻链。图加-c 二价双特异性<ErbB-3-c-Met>抗体的示意性结构，所述抗体包含a)特异性结合人ErbB-3的全长抗体的轻链和重链；和b)特异性结合人c-Met的全长抗体的轻链和重链，其中恒定结构域CL和CHl、和/或可变结构域VL和VH相互替换，其用凸起-进入-孔洞技术修饰。图3本发明所述的三价双特异性<ErbB-3-c-Met>抗体示意图，所述抗体包含特异性结合第一抗原1的全长抗体，对其a)图3a 融合两个多肽VH和VL (这两个多肽的VH和VL结构域一起形成特异性结合第二抗原2的抗原结合位点)；b)图北融合两个多肽VH-CHl和VL-CL (这两个多肽的VH和VL结构域一起形成特异性结合第二抗原2的抗原结合位点)；图3c 具有“凸起和孔洞”的本发明所述的三价双特异性抗体的示意图，所述抗体包含特异性结合第二抗原1的全长抗体，对其融合两个多肽VH和VL (这两个多肽的VH和 VL结构域一起形成特异性结合第二抗原2的抗原结合位点)；图3d 具有“凸起和孔洞”的本发明所述的三价双特异性抗体示意图，所述抗体包含特异性结合第一抗原1的全长抗体，对其融合两个多肽VH和VL (这两个多肽的VH和VL 结构域一起形成特异性结合第二抗原2的抗原结合位点，其中这些VH和VL结构域包含在位置VH44和VL100之间的链间二硫键)。图44a 四种可能的单链Fab片段的示意性结构；
4b 两种单链Fv片段的示意性结构。图5三价双特异性<ErbB-3-c-Met>抗体的示意性结构，所述抗体包含全长抗体和一个单链Fab片段(图5a)或一个单链Fv片段(图恥)-具有凸起和孔洞的双特异性三价实例。图6四价双特异性<ErbB-3-c-Met>抗体的示意性结构，所述抗体包含全长抗体和两个单链Fab片段(图6a)或两个单链Fv片段(图6b) -c-Met结合位点来源于抑制c_Met 二聚化的抗体。图7 二价双特异性<ErbB-3-c-Met>抗体的示意性结构，其中一个Fab臂替换为 scFab片段。图8双特异性抗体与癌细胞细胞表面的结合。图9通过双特异性Her3/C-Met抗体形式对HGF-诱导的c_Met受体磷酸化的抑制。图10通过双特异性Her3/C-Met抗体形式对HRG-诱导的Her3受体磷酸化的抑制。图11，12和13通过双特异性Her3/c_Met抗体形式对HGF-诱导的HUVEC增殖的抑制。图14通过双特异性Her3/C-Met抗体形式对癌细胞系A431中增殖的抑制。图15和16分析双特异性Her3/c_Met抗体形式对癌细胞系A431中HGF-诱导的细胞-细胞散布(分散)的抑制。图17分析四种不同癌细胞系中的Her3和c_Met细胞表面表达。图18分析癌细胞系A431，AM9，和DU145中的抗体介导的受体内在化。图19分析A431细胞的HGF-诱导的细胞迁移。A.以存在递增剂量的双特异性抗体 MH_TvAbl8时阻抗的函数测量A431癌细胞的迁移。显示的是M小时后的终点读数。B.作为对照，以与所述双特异性抗体相似的浓度范围加入非特异性人IgG对照。图20在Η ^9细胞中分析双特异性Her3/c_Met_scFv_SSKH抗体的细胞-细胞交联(用 ΡΚ 6 和 PKH67 (SIGMA)染色)。图 2I 双特异性 HerVc-Met 抗体 Her3/Met_scFvSS_KH (左侧)和 Her3/Met_scFv_ KH(右侧)的 SDS page。图 22 双特异性 Her3/c_Met 抗体 Her3/Met_scFvSSKH(图 22a)和 Her3/MetscFv_ KH(图22b)的HP SEC分析(纯化的蛋白)。实验方法
实施例材料和方法重组DNA技术使用标准方法操作 DNA，如 Sambrook，J.等，Molecular cloning :A laboratory manual (分子克隆实验室手册)；Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor (冷泉港)，纽约，1989中所述。分子生物学试剂按照供应商的使用说明使用。DNA和蛋白序列分析和序列数据管理关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的通用信息在Kabat，Ε. Α.等，(1991) : 目的的歹I」(Sequences of Proteins of Immunological Interest), 第五版，NIH出版号91-3242中提供。抗体链的氨基酸按照EU编号进行编号(Edelman， G.M.，等，PNAS 63(1969)78-85 ；Kabat, Ε. A.，等，(1991)免疫目的的蛋白质序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest),第五版，NIH 出版号 91-3242)。 GCG (Genetics Computer Group (遗传学计算小组)，Madison，威斯康星)的软件包版本 10. 2禾口 Infomax载体NTl 进展组版本8. Odnfomax’ s Vector NTI Advance suite version 8. 0)用于序列构建、作图、分析、注解和说明。DNA 测序DNA序列通过在 SequiServe (Vaterstetten,德国)禾口 Geneart AG (Regensburg,德国)进行的双链测序来确定。基因合成所需基因区段由Geneart AG (Regensburg，德国)从合成的寡核苷酸和通过自动化基因合成的PCR产物来制备。将侧邻单个限制性内切核酸酶裂解位点的基因区段克隆到 pGA18 (ampR)质粒中。从转化的细菌纯化质粒DNA，并且通过UV光谱法确定浓度。亚克隆基因片段的DNA序列通过DNA测序验证。合成编码在CH3结构域中携带T366W突变的“凸起-进入-孔洞”Her3(克隆29)抗体重链(具有通过(G4S)n肽连接体连接的C端5D5VH 区)的基因区段和编码携带T366S，L368A*W07V突变的“凸起-进入-孔洞” Her3(克隆29)抗体重链(具有通过(G4S)1Ji连接体连接的C端5D5VL区)的基因区段，所述基因区段具有5’-BamHI和3’_XbaI限制性位点。以相似的方式，通过基因合成制备编码在CH3 结构域中携带S354C和T366W突变的“凸起-进入-孔洞， θι·3(克隆29)抗体重链(其具有由(G4S)1Ji连接体连接的C-端OT5VH区)的DNA序列和编码携带TO49C，T366S，L368A
突变的“凸起-进入-孔洞” Her3(克隆29)抗体重链(其具有由(G4S)n肽连接体连接的C-端5D5VL区)的DNA序列，所述DNA序列具有侧连的BamHI和)(baI限制性位点。最后，合成编码Her3(克隆29)抗体和5D5抗体的未修饰的重链和轻链的DNA序列，所述DNA序列具有侧连的BamHI和)(baI限制性位点。将所有的构建体设计具有编码前导肽 (MGWSCIILFLVATATGVHS)的5’ -端DNA序列，所述前导肽靶向用以在真核细胞中分泌的蛋白。使用可变和恒定区的各自的元件(例如，在下述设计部分和表1-5中特定说明的)，类似地进行下述其他双特异性抗体的基因合成。构建表达质粒将Roche表达载体用于构建所有编码重链和轻链scFv融合蛋白的表达质粒。所述载体包括下述元件-作为选择标记的潮霉素抗性基因，-埃巴病毒(EBV)的复制起点，oriP，-来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，-β -内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌氨苄青霉素抗性，-来自人巨细胞病毒(HCMV)的即时早期增强子和启动子，-人1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“聚Α”)信号序列，和-特有的BamHI和)(baI限制性位点。如所描述的，通过基因合成制备免疫球蛋白融合基因，其包含重链或轻链构建体以及具有C端VH和VL结构域的“凸起-进入-孔洞”构建体，将该融合基因克隆进入 pGA18 (ampR)质粒。带有合成的DNA区段的pG18(ampR)质粒和Roche表达载体用BamHI 和)(bal限制性酶(Roche Molecular Biochemicals)消化并进行琼脂糖凝胶电泳。然后将纯化的重链和轻链编码DNA区段连接到分离的Roche表达载体BamHlAbaI片段，产生最终表达载体。将最终表达载体转化到大肠杆菌细胞中，分离表达质粒DNA (Minipr印)并进行限制性酶分析和DNA测序。正确的克隆在150mlLB-Amp培养基中生长，再次分离质粒 DNA(Maxiprep)并通过DNA测序确认序列完整性。免疫球蛋白变体在HEK293细胞中的瞬时表达根据供应商的说明书，使用Fre必tyle 293表达系统(Invitrogen，USA) 通过人胚肾^3-F细胞的瞬时转染来表达重组免疫球蛋白变体。简言之，将混悬的 Freestyle 293-F细胞在FreeMyle 293表达培养基中在37°C /8% CO2进行培养，并在转染当天将细胞以1-2χ106个活细胞/ml的密度接种在新鲜的培养基中。使用325μ 1 的^3fectin (Invitrogen，德国)和250 μ g 1 1摩尔比率的重链和轻链质粒DNA在 Opti-MEM I培养基(Invitrogen，USA)中制备DNA-293feCtinTM复合物，最终转染体积为250ml。“凸起-进入-孔洞"DNA-293feCtin复合物如下制备在Opti-MEM I培养基 (Invitrogen，USA)中使用 325μ 1 的293fectin (Invitrogen，德国)和 250μ g的 1 :1:2 摩尔比的“凸起-进入-孔洞”重链1和2和轻链质粒DNA(最终转染体积250ml)制备。在转染后7天，通过以14000g离心30分钟并通过无菌滤器(0. 22 μ m)过滤收获包含抗体的细胞培养物上清液。将上清液贮存在_20°C直到纯化。双特异性抗体和对照抗体的纯化使用蛋白质A-S印harose (GE Healthcare，瑞典)和Superdex200大小排阻层析法，通过亲和层析法从细胞培养物上清液中纯化双特异性抗体和对照抗体。简言之，将无菌过滤的细胞培养物上清液应用到用PBS缓冲液(IOmM Na2HPO4, ImM KH2PO4,137mM NaCl和 2. 7mM KCl，pH 7.4)平衡的HiTrap蛋白质A HP (5ml)柱上。将未结合的蛋白用平衡缓冲液洗涤下来。抗体和抗体变体用PH 2. 8的0. IM柠檬酸缓冲液洗脱，并且用pH 8. 5的0. Iml 1 M Tris中和含有蛋白的级分。然后，汇聚洗脱的蛋白级分，将其用Amicon超离心过滤装置(MWC0 :30K,Millipore)浓缩至 3ml 体积，并且上样到用 pH 6. O 的 20mM Histidin, 140mM NaCl 平衡的 Superdex200HiLoad 120ml 16/60 凝胶过滤柱(GE Healthcare，瑞典)上。汇聚具有少于5%的高分子量聚集物的包含纯化的双特异性抗体和对照抗体的级分，并且以 1. 0mg/ml的等分试样保存在_80°C。通过木瓜蛋白酶消化纯化的5D5单克隆抗体产生Fab 片段，并且随后通过蛋白质A层析法去除污染的Fc结构域。将未结合的Fab片段进一步在用 pH 6. 0 的 20mM Histidin, HOmMNaCl 平衡的 Superdex200 HiLoad 120ml 16/60 凝胶过滤柱(GE Healthcare，瑞典)上纯化，并且以1. 0mg/ml的等分试样保存在_80°C。纯化的蛋白的分析利用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量^Onm的光密度(OD)，来确定纯化的蛋白样品的蛋白浓度。通过在存在和不存在还原剂(5mM 1，4-二硫苏糖醇)条件下的SDS-PAGE并且用考马斯亮蓝染色，分析双特异性抗体和对照抗体的纯度和分子量 (示例性的图 21，双特异性 Her3/c-Met 抗体 Her3/MetscFvSS_KH (左侧)和 Her3/MetscFv_ KH(右侧)的SDS-Page)。按照供应商的使用说明使用NuPAGE I^e-Cast凝胶系统(Invitrogen,USA) (4-20% Tris-甘氨酸凝胶)。使用Superdex 200分析级大小排阻柱(GE Healthcare，瑞典)，在 200mM KH2PO4, 250mM KCl，pH 7. 0 运行缓冲液中在 25°C，通过高效 SEC分析双特异性抗体和对照抗体样品的聚集物含量。将25μ g蛋白以0. 5ml/分钟的流速注射到柱上，并且在50分钟内勻速(isocratic)洗脱。对于稳定性分析，将浓度为lmg/ml 的纯化的蛋白在4°C和40°C温育7天，然后通过高效SEC评估(例如，双特异性Her3/C-Met 抗体 Her3/MetscFvSS_KH(图 22a)和 Her3/MetscFv_KH(图 22b)的 HP SEC 分析(纯化的蛋白))。在通过用肽-N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)酶处理去除N-聚糖后，通过纳米电喷雾Q-TOF质谱法验证还原的双特异性抗体轻链和重链的氨基酸骨架的完整性。产率如下例如，对于双特异性Her3/c-Met抗体Her3/MetscFvSS_KH为 . 8mg/L (蛋白质 A 和 SEC)，对于 Her3/MetscFv_KH 为 12. 3mg/L(蛋白质 A 和 SEC))。c-Met磷酸化测定在HGF刺激前一天，将切1(^5个A549细胞接种在6孔板的每个孔中的具有0. 5% FCS (胎牛血清)的RPMI中。次日，用含有0. 2 % BSA (牛血清白蛋白)的RPMI替换生长培养基1小时。然后，向培养基中加入5 μ g/mL双特异性抗体，并且将细胞温育10分钟，对其加入HGF以50ng/mL的终浓度继续10分钟。将细胞用含有ImM钒酸钠的冰冷PBS洗涤一次，将其置于冰上，在细胞培养板中用100 μ L裂解缓冲液(50mM Tris-Cl pH7. 5,150mM NaCl, 1% NP40，0. 5% DOC, aprotinine, 0. 5mM PMSF, ImM 钒酸钠)裂解。将细胞裂解物转移到印pendorf管中，并且允许裂解在冰上继续进行30分钟。利用BCA法(Pierce)确定蛋白浓度。在4-12% Bis-Tris NuPage凝胶(Invitrogen)上分离30-50 μ g裂解物，并且将凝胶上的蛋白转移到硝基纤维素膜上。将膜用含有5% BSA的TBS-T封闭1小时，并且用针对Y1230, 1234，1235的磷-特异性c-Met抗体(44-888, Biosource)按照供应商的使用说明进行显色。免疫印迹用结合未磷酸化的c-Met的抗体(AF276，R&D)再次探测。Her3 (ErbB3)磷酸化测定将hl0e5个MCF7细胞接种在12-孔板的每个孔中的完全生长培养基中(RPMI 1640，10% FCS)。允许细胞在两天内生长至90%的汇合。然后，用含有0. 5% FCS的饥饿培养基更换培养基。次日，在加入SOOng/mLHeregulin (R&D)前1小时，以指定的浓度补充各种抗体。当加入Heregulin时，将细胞进一步培育10分钟，然后收集细胞并裂解。使用BCA法 (Pierce)确定蛋白浓度。在 4-12% Bis-Tris NuPage 凝胶(Invitrogen)上分离 30-50 μ g 裂解物，并且将凝胶上的蛋白转移到硝基纤维素膜上。将膜用含有5% BSA的TBS-T封闭1 小时，并且用特异性识别Tyrl289的磷-特异性Her3/ErbB3抗体(4791，Cell Signaling) 进行显色。分散测定在化合物处理前一天，将A549 (4000个细胞/孔)或A431 (8000个细胞/孔)以 200 μ L的总体积接种在96孔E-板(Roche, 05232368001)中的具有0. 5 % FCS的RPMI中。 贴壁和细胞生长用实时细胞分析仪机器监测过夜，每15分钟扫描(swe印s)监测阻抗。次日，将细胞用5 μ L在PBS中的各自抗体稀释液预先温育，每5分钟扫描。30分钟后，加入产生20ng/mL终浓度的2，5 μ L的HGF溶液，并且允许实验再继续进行72小时。每分钟扫描持续180分钟监测即时变化，然后其余的时间每15分钟扫描。迁移测定
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迁移测定基于实时细胞分析仪技术(Roche)进行。为了这一目的，将具有8 μ m孔的CIM装置的下室装满160 μ L HGF-条件培养基(50ng/mL)。装配该装置，并且将在150 μ L 总体积中的100000个Α431细胞接种在上室中。对其加入双特异性抗体或对照抗体。允许迁移继续M小时，在期间每15分钟规律扫描。输出数据并且表示为M小时后的终点读数。流式细胞术测定(FACS)a)细胞表面受体状态的相对定量将细胞保持在对数生长期。将亚汇合的细胞用accutasdSigma)解离，离心 (1500rpm,4°C,5min)并随后用含有2% FCS的PBS洗涤一次。为了确定与其他细胞系相比较的相对受体状态，将Ixl0e5个细胞在冰上与5 μ g/mL Her3或c_Met特异性一级抗体温育30分钟。使用非特异性IgG(同种型对照)作为特异性对照。在指定的时间后，将细胞用含有2% FCS的PBS洗涤一次，然后在冰上与荧光团偶联的二级抗体温育30分钟。将细胞如所述进行洗涤并且重悬在适当体积的包含7-AAD(BD Biosciences)的BD CellFix溶液(BD Biosciences)中，以区分活细胞和死细胞。通过流式细胞术(FACS Canto,BD)确定平均荧光强度(mfi)。Mfi以至少两次独立染色的重复确定。使用Flowjo软件(Tre必tar) 进一步处理流式细胞仪光谱。a)结合测定解离并且计数A431。将1. 5xl0e5个细胞接种在锥形96孔平板的每个孔中。将细胞离心(1500rpm，4°C，5分钟)并且在冰上在具有2 % FCS (胎牛血清)的PBS中的50 μ L 各种双特异性抗体的系列稀释液中温育30分钟。将细胞再次离心，并且用200 μ L含有 2% FCS的PBS洗涤一次，然后用针对人Fc的藻红蛋白-偶联的抗体第二次温育30分钟， 所述藻红蛋白-偶联的抗体稀释在含有2% FCS的PBS (Jackson Immunoresearch (杰克逊免疫研究)，10911609 中。将细胞离心，用200 μ L含有2% FCS的PBS洗涤两次，重悬在 BD CellFix溶液(BD Biosciences (BD生物科学))中并且在冰上温育至少10分钟。通过流式细胞术(FACS Canto,BD)确定细胞的平均荧光强度(mfi)。至少进行重复的两次独立染色来确定Mfi。使用Flowjo软件(Tre必tar)进一步处理流式细胞术光谱。使用XLFit 4. O(IDBS)和剂量反应单位点模型(one site model) 205确定半最大结合。b)内在化测定解离并且计数细胞。将切1065个细胞置于印？611(10什管中的501^完全培养基中，并且在37°C用5 μ g/mL各种双特异性抗体温育。在指定的时间点后，将细胞保存在冰上，直到时间过程结束。然后，将细胞转移到FACS管中，离心(1500rpm，4°C，5分钟)，用 PBS+2% FCS洗涤，并且在50 μ L针对人Fc的藻红蛋白-偶联的二级抗体中温育30分钟， 所述二级抗体稀释在含有2 % FCS的PBS (Jackson Immunoresearch (杰克逊免疫研究)， 109116098)中。将细胞再次离心，用PBS+2% FCS洗涤，并且通过流式细胞术(FACS Canto, BD)确定荧光强度。c)交联实验将HD9细胞解离、计数并分成两个群体，各自用ΡΚ 6和PKH67 (Sigma)按照供应商的使用说明染色。从每个染色的群体中取切10巧个细胞，合并并且在完全培养基中用 10 μ g/mL各种双特异性抗体温育30和60分钟。在指定的时间点后，将细胞保存在冰上，直到时间过程结束。将细胞离心(1500rpm，4°C，5分钟)，用PBS+2% FCS洗涤，并且通过流式细胞术(FACS Canto, BD)确定荧光强度。细胞滴定发光测定(CellTiter Glow Assay)使用细胞滴定发光测定(!Iomega)量化细胞存活力和增殖。该测定按照供应商的使用说明进行。简言之，将细胞在96孔板中以100 μ L的总体积培养所需要的时间期间。对于增殖测定，将细胞从温箱中取出，并且置于室温下30分钟。加入100 μ L细胞滴定发光试剂，并且将多孔板放置在定轨摇床上2分钟。15分钟后在微量平板读数仪(Tecan)上定量发光。Wst-I 测定进行Wst-I存活力和细胞增殖测定作为终点分析，以检测代谢活性细胞的数目。 简言之，向200 μ L培养基中加入20 μ L Wst-I试剂(Roche，11644807001)。将96孔板进一步温育30分钟-1小时，直到出现染料的强显色。在微量平板读数仪(Tecan)上在450nm 波长定量染色强度。表面等离振子共振在25°C使用标准结合测定，诸如表面等离振子共振技术(BIAcore ， GE-Healthcare Uppsala，瑞典)，确定结合亲和力。对于亲和力测量，将30 μ g/ml抗Fc γ 抗体(来自山羊，Jackson Immuno Research)在SPR仪器(Biacore T100)上通过标准的胺-偶联和封闭化学偶联到CM-5传感器芯片的表面上。缀合后，在25°C以5 μ L/min的流速注射单特异性或双特异性Her3/CMet抗体，然后以30 μ L/min注射人HER3或c_Met ECD 的稀释系列(OnM-lOOOnM)。对于结合实验，使用PBS/0. 1 % BSA作为运行缓冲液。然后，用 PH 2. 0的IOmM甘氨酸-HCl溶液的60秒脉冲再生芯片。表达和纯化的双特异性<ErbB3-c-Met>抗体的设计所有下述表达的和纯化的双特异性<ErbB3-c-Met>抗体包括IgGl亚类的恒定区或至少Fc部分(SEQ ID NO 11的人恒定IgGl区)，其最终按下述修饰。在表1中具有表1所示的各自的特征的基于全长ErbB-3抗体(HER3克隆29)(通过免疫获得(用人HER3-E⑶免疫的NMRI小鼠))和来自c_met抗体(cMet 5D5)的一个单链Fv片段(关于基本结构图见图5—一最终并非表中所提及的所有特征都包括在该附图中)的三价双特异性<ErbB3-C-Met>抗体按照上述通用方法表达和纯化。在序列表中提供 HER3克隆四和cMet 5D5的相对应的VH和VL0表 1
权利要求
1.特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB_3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，当在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量时，与不存在抗体时ErbB-3的内在化相比较，所述双特异性抗体显示不超过15%的ErbB-3的内在化。
2.根据权利要求1的抗体，其特征在于是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的二价的或三价的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的一个或两个抗原结合位点和特异性结合人c-Met的一个抗原结合位点。
3.根据权利要求1的抗体，其特征在于是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的三价的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的两个抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第三抗原结合位点。
4.根据权利要求1的抗体，其特征在于是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的二价的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的一个抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点。
5.特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于i)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQID NO :53的⑶R3H区，SEQ ID NO 54的⑶R2H区和SEQ ID NO 55的⑶RlH区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO 56 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 57 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 58 的 CDRlL 区或 SEQ ID NO 59 的CDRlL区；和所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID N0:66的⑶R3H区，SEQ ID NO :67的⑶R2H区和SEQ ID NO :68的⑶RlH区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO: 69 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 71 的 CDRlL 区；ii)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQID NO 60的⑶R3H区，SEQ ID NO :61的CDR2H区和SEQ ID NO :62的CDRlH区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO: 63 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 64 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO 65 的 CDRlL 区或 SEQ ID NO 66 的CDRlL区；和所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO :66的⑶R3H区，SEQ ID NO :67的⑶R2H区和SEQ ID NO :68的⑶RlH区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO: 69 的 CDR3L 区，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 区和 SEQ ID NO :71 的 CDRlL 区。
6.根据权利要求5的双特异性抗体，其特征在于i)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQID NO :47和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :48，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 4 ；ii)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQID N0:49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :50，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 4 ；iii)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQID N0:49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :51，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 4 ；iv)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID N0:49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :52，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO 4 ；或ν)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO :1和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :2，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :4。
7.根据权利要求5的双特异性抗体，其特征在于所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :51，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO 3 和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO :4。
8.根据权利要求1至7的双特异性抗体，其特征在于包含IgGl或IgG3亚类的恒定区。
9.根据权利要求1至8的双特异性抗体，其特征在于所述抗体在Asn297用糖链糖基化，其中所述糖链内岩藻糖的量为65%以下。
10.编码根据权利要求1至9的双特异性抗体的核酸。
11.药物组合物，其包含根据权利要求1至9的双特异性抗体。
12.根据权利要求11的药物组合物，其用于治疗癌症。
13.根据权利要求1至9的双特异性抗体，其用于治疗癌症。
14.根据权利要求1至9的双特异性抗体用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
15.治疗患有癌症的患者的方法，其通过向需要这样的治疗的患者施用根据权利要求 1至9的双特异性抗体进行。
全文摘要
本发明涉及针对人ErbB-3和针对人c-Met的双特异性抗体，制备它们的方法，含有所述抗体的药物组合物，及其用途。
文档编号C07K16/28GK102378768SQ201080015072
公开日2012年3月14日 申请日期2010年3月30日 优先权日2009年4月7日
发明者乌尔里希·布林克曼, 于尔根·迈克尔·尚策, 克劳迪奥·祖斯特曼, 克里斯蒂安·克莱因, 埃克·霍夫曼, 巴勃罗·乌马纳, 扬·奥拉夫·斯特拉克, 格哈德·尼德费尔纳, 比吉特·博森梅尔, 维尔马·劳 申请人:罗氏格黎卡特股份公司