纯化血浆蛋白的手段和其实现方法

专利名称：纯化血浆蛋白的手段和其实现方法
技术领域：
本发明涉及可用作药物活性成分的血浆蛋白的纯化领域。 现有技术血浆蛋白已经在很长时间内构成药物的活性成分。在用作药物活性成分的血浆蛋白中，特别应提及因子VII、因子VIII、凝血酶或von Willebrand因子。迄今为止，血浆蛋白只是通过从人血浆中纯化获得。在过去数年间，一些血浆蛋白以在转基因哺乳动物的体液中(例如在转基因哺乳动物的乳中)生产的重组蛋白的形式获得。在所有的情况下，含有待纯化的血浆蛋白的起始材料都由复杂构成的物质组成， 其中目标蛋白与非常大量的物质组合存在，包括蛋白质、脂类、碳水化合物、氨基酸、矿物盐、细胞碎片和代谢废物如尿素、尿酸或胆红素。因此，考虑到销售用于人类用途的药物所需的健康和规范特征，开发纯化血浆蛋白的方法是一项复杂的任务。可以理解，在用于人类或兽医用途的药物中，用作活性成分的血浆蛋白应该以高度纯化的形式存在，且不与可能对生物体有害的不想要的物质相关，所述物质包括其他的血浆蛋白或者上述蛋白质的降解产物。纯化各种血浆蛋白的方法是已知的，包括用于纯化因子VII、抗凝血酶III、纤溶酶原、因子VII或von Willebrand因子的方法。所有已知的方法都包括一系列基于蛋白沉淀步骤、穿过层析基质然后顺序洗脱步骤、深层过滤步骤、超滤步骤或浓缩步骤的选择性步骤。需要说明的是，不论所述方法是新颖的，还是这些方法是已知方法的适应性调整， 或者甚至只是极小的适应性调整，开发凝血蛋白的纯化方法都需要长期的研究和连续的中间产物一致性的大量对照，以便保证所获得的终产物具有高纯度、未修饰的形式、基本不含不需要的物质，并且是无菌且无致热源的。特别是，对于具有酶活性的血浆蛋白，例如因子 VII、VIII和XI，纯化的最终蛋白质必须是未激活的。然而，在任一种纯化步骤的过程中，包括在层析步骤的过程中，如果不能一直维持预先设定的条件，例如所使用的滤器或层析基质的质量、盐浓度或温度，凝血蛋白的激活都是易于诱导的。上述内容至少部分解释了为何已知的方法不包含亲和层析步骤，所述步骤基于如下原理将目标血浆蛋白的特异性的固定在植入层析基质上的配体上，然后在层析洗脱液中回收所述纯化的蛋白。该技术的缺陷也解释了在纯化治疗目的蛋白质的方法中缺少亲和层析纯化步骤的原因，在所述技术中观察到了一部分植入亲和底物上的配体分子的脱离，所述配体分子被发现与洗脱液体积中的纯化的治疗性蛋白质相关联。可以理解，在包含纯化的血浆蛋白的药物中，存在可能对生物体有害的层析基质的组成物质将使患者的健康处于危险之中， 并被药物管理条例所禁止。
虽然已知的纯化血浆蛋白的方法是令人满意的，但现有技术仍然需要替代的方法或者相比现有方法而言改善的方法。发明概述本发明涉及选择性结合血浆蛋白的亲和基质，包括其上固定了脱氧核糖核酸适体的固体基质材料，所述适体特异性的结合所述血浆蛋白。本发明的目标还有将血浆蛋白固定在基质上的方法，包括这样的步骤，在所述步骤中，使含有所述血浆蛋白的样品与亲和基质接触。本发明还涉及纯化血浆蛋白的方法，包括下列步骤a)使含有血浆蛋白的样品与上文定义的亲和基质接触，以便形成在(i)固定在所述亲和基质上的核酸适体和(ii)所述血浆蛋白之间的复合物，和b)从步骤a)形成的复合物中释放蛋白质，和c)以纯化的形式回收所述血浆蛋白。还涉及重组人血浆蛋白的纯化的组合物，包含按重量计至少99. 9%的所述重组人蛋白，并且基本不含非人蛋白。


图1示例了在执行纯化兔奶中生产的重组人因子VII的方法中获得的层析图谱， 使用的亲和基质中固定了抗人FV II核酸适体。X轴时间；y轴2 纳米处的吸光度值(OD)。图2代表了在^Onm处吸光度的测量值作为时间的函数的曲线。图3是考马斯蓝染色的SDS PAGE电泳凝胶图，其能够相对定量条带。图3中的凝胶从左到右的泳道代表了下列起始产物的迁移结果-泳道“MD” 起始组合物 Betafact ,-泳道“NR”对应图2的层析图谱的1号峰的非滞留级分，-泳道“El”对应图2的层析图谱的2号峰的洗脱级分。图4代表了在^Onm处吸光度的测量值作为时间的函数的曲线。图5是SDS PAGE电泳凝胶的图。图5中的凝胶从左到右的泳道代表了下列起始产物的迁移结果-泳道“E5”含有通过MEP HyperCel层析步骤预先纯化的转基因人因子IX的转基因母猪奶的起始组分，-泳道‘ 6”:对应图4的层析图谱的1号峰的非滞留级分，-泳道‘ 7”对应图4的层析图谱的2号峰的洗脱级分，-泳道‘ 8”对应图4的层析图谱的3号峰的再生级分，-泳道“TFIX” 纯化的人血浆因子IX对照。图6代表了在观此！!!处吸光度的测量值作为时间的函数的曲线。在图6中，1号峰对应于没有滞留在柱上的起始产物的级分。2号峰对应于洗脱级分。图7代表了为了显示杂质的消除，通过硝酸银染色的SDS PAGE分析的起始产物以及洗脱产物的图像泳道1对应于起始产物级分，泳道2对应于洗脱级分。尽管起始产物的纯度可观，但应注意到洗脱级分不再含有任何污染物或降解形式。
图8代表了 Mapt2固定化适体与在转基因兔子的奶中生产的重组人因子VII的结合曲线。箭头对应于各次注射的时间，图8从左至右分别是1 注射重组因子VII ；2 注射含有IM NaCl的缓冲液；3 注射含有2M NaCl的缓冲液；4 注射含有3M NaCl的缓冲液；5 注射含有IOmM EDTA的50mM Tris缓冲液。沿χ轴按秒表示的时间；沿y轴反应信号的值，以任意单位(RU)表示。图9代表了 Mapt2固定化适体与在转基因兔子的奶中生产的重组人因子VII的结合曲线。箭头对应于各次注射的时间，图9从左至右分别是1 :50%丙二醇；2 =IOmM的 EDTA0发明详述经过长期的研究，申请人开发了包括层析步骤的用于纯化血浆蛋白的方法，在所述步骤中，将特异性结合目标蛋白的配体预先固定在层析基质上，然后释放保留着所述基质上的目标蛋白，并回收洗脱体积中的纯化蛋白质。更特别的是，根据本发明，提供了纯化血浆蛋白的方法，包括将目标血浆蛋白与基质特异性结合的步骤，所述基质上固定了特异性结合所述目标蛋白的脱氧核糖核酸适体， 接着回收所述纯化的目标蛋白的步骤。令人惊奇的是，根据本发明显示，固定了特异性针对目标血浆蛋白的脱氧核糖核酸适体的亲和层析基质，即，包括包含此类脱氧核糖核酸适体的固定化合物的形式，可成功的用于获得血浆蛋白的方法，其中所述血浆蛋白可用作药物的活性成分。令人惊奇的是，根据本发明显示，通过使用脱氧核糖核酸(DNA)适体可以制备本说明书定义的亲和基质，然而现有技术中认为所述适体为不易使用的配体核酸，并且其与目标蛋白的特异性低于相应序列的RNA分子的特异性。特别的是，现有技术领域中认为配体DNA具有比相应的RNA更小的柔性，因此，配体RNA不太能进行构象改变。据回忆，核酸适体结合靶蛋白时发生构象改变。还描述了核酸适体的构象改变越快，所述核酸适体与靶蛋白的亲和力越高(Michaud 等，2003，Anal Chem，第 76 卷1015-1020 ；Brumbt 等，2005， Anal Chem，第 77 卷1993-1998)。本发明的亲和基质还表现出能够从复杂成分的起始基质中纯化凝血蛋白，例如富含人因子IX的血浆组合物和人因子IX转基因的动物的奶，具有与所述目标凝血蛋白极大的结合特异性。本发明的亲和基质还表现出能够从同时包含了非人的直向同源蛋白的起始基质中选择性纯化人凝血蛋白，例如从人因子IX转基因的动物的奶中，所述奶还包含由所述转基因动物天然生产的因子IX，由所述转基因动物天然生产的所述因子IX(或内源性FIX)可以是例如猪FIX。本发明的亲和基质还表现出能够从也包含了非人的直向同源蛋白的起始基质中选择性纯化人凝血蛋白，例如从人因子VII转基因的动物的奶中，所述奶还包含由所述转基因动物天然生产的因子VII，由所述转基因动物天然生产的所述因子VII (或内源性VII) 可以是例如兔FVII。本发明涉及选择性结合血浆蛋白的亲和基质，包含其上固定了脱氧核糖核酸适体的固体基质材料，所述适体特异性的结合所述血浆蛋白，包括以包含此类脱氧核糖核酸适体的化合物的形式。
特异性结合目标血浆蛋白的脱氧核糖核酸适体的分子，以及包含此类脱氧核糖核酸适体的化合物，构成了由所述固体基质材料携带的、供所述靶蛋白特异性结合的位点。术语“脱氧核糖核酸适体”包括具有长度为5至120个核苷酸且特异性结合血浆蛋白的单链脱氧核糖核苷酸。表述“包含脱氧核糖核酸适体的化合物”也包括在结构中包含上文定义的所述脱氧核糖核酸的化合物。因而，包含特异性结合人或哺乳动物血浆蛋白的脱氧核糖核酸的化合物包括在包含生物素分子的结构中包括所述脱氧核糖核酸的化合物。本发明显示，如上定义的亲和基质允许有效的固定目标血浆蛋白，其在本说明书中也被称为“靶蛋白”。上文定义的亲和基质具有吸附靶蛋白的高容量，因为使固体基质与含有待纯化的血浆蛋白的液体溶液接触使其能够饱和由固体基质携带的至少50%的靶位点。本发明还显示，特异性结合脱氧核糖核酸适体分子的血浆蛋白分子之后可以以至少75%的高产量从亲和基质上洗脱。此外，还显示本发明的亲和基质具有对目标血浆蛋白的高特异性，因为发现相对于洗脱液中含有的蛋白总重量，所述血浆蛋白具有按重量计高达99. 95%的纯度。如实施例所示，使用本发明的亲和基质可以进一步获得目标凝血蛋白的纯度增加 2个数量级，使用包含高纯度的靶凝血蛋白的组合物作为起始产物，例如相对于所述起始产物中含有的总蛋白重量，按重量计大于98%。应说明的是，包括当起始产物中存在的杂质具有与需要纯化的靶凝血蛋白非常接近的结构或物理化学特征时，也可获得此类纯度的增加。重要的是，显示特别对于从复杂组成的起始基质中纯化目标血浆蛋白，可获得本发明的亲和基质的上述高吸附容量、良好产量和高特异性的特征，所述复杂组成的起始基质为例如所述目标血浆蛋白转基因的哺乳动物的血浆或生物学液体。还显示，核酸适体在固体基质材料上的固定是不可逆的和长期的，因为在洗脱溶液中检测不到存在从基质上脱离的脱氧核糖核酸适体。特别的是，还显示通过消除洗脱后仍然结合在基质上的蛋白质，可以非常多次的 “再生”本发明的亲和基质，而不显著的破坏(i)它的吸附靶血浆蛋白的容量，(ii)它对于所述靶蛋白的特异性，或者(iii)不存在释放固定在固体基质材料上的脱氧核糖核酸适体。此外，可以根据已知的技术和使用已知的再生试剂，例如尿素，进行本发明的亲和基质的再生。用作目标血浆蛋白的配体的脱氧核糖核酸具有许多优点。由于其寡核苷酸的性质，适体具有弱免疫原性和对严格的物理化学条件(存在尿素、DMS0、非常酸或非常碱性的 PH、使用有机溶剂或高温)的高抗性，在用作亲和配体的背景下允许以多种策略控制健康安全性，特别是对于病毒或非常规致病体的安全性。此外，它们是高度选择性的。最后，如已经提及的，脱氧核糖核酸适体的生产涉及相对有限的花费。因而，本发明的亲和基质的上述特征的组合使所述亲和基质能够被用作纯化血浆蛋白的手段，因为-所述亲和基质使其能够进行非常高纯度的血浆蛋白的纯化方法，-所述亲和基质没有可检测地释放不希望的物质，特别是脱氧核糖核酸适体，到含有纯化的血浆蛋白的洗脱溶液中，
-脱氧核糖核酸适体分子可能的脱离没有导致对人健康的妨碍，-当血浆蛋白具有酶活性时，亲和基质上的血浆蛋白的结合和之后的洗脱不导致形成可检测量的激活形式的所述血浆蛋白，-所述亲和基质的生产是相对便宜的，特别是由于生产脱氧核糖核酸适体的低成本,禾口-所述亲和基质用于纯化血浆蛋白的用途本身是相对便宜的，由于所述基质的长效性，特别是由于它在长时间段内可以多次再生。此外，如已经提及的，在从复杂组成的基质(特别是从常规上在工业规模使用的基质中，例如人血浆或培养基或含有所述目标蛋白的生物学液体)中纯化的方法中，本发明的亲和基质能够以可逆的方式选择性的结合靶血浆蛋白，具有良好的产量和良好的特异性。进一步的，如本说明书的后文中将详细描述的，本发明的亲和基质适合处理含有目标血浆蛋白的大量体积的溶液。因而，本发明的亲和基质构成了用于纯化血浆蛋白的工具，其完美的适用于工业规模。本说明书随后将相对于对亲和基质本身的说明，或者相对于用于纯化血浆蛋白的方法(所述方法中可使用所述亲和基质)，来说明根据本发明的亲和基质的其他优点。根据申请人掌握的知识，本发明首次描述了包含固定化的脱氧核糖核酸适体的亲和基质，用于在工业规模使用的条件下纯化血浆蛋白。多种特异性针对凝血酶、因子VII和因子IX的核酸适体更是现有技术中已知的(参见PCT申请号WO 02/26932)。然而，根据申请人掌握的知识，现有技术中从未描述过脱氧核糖核酸适体用于生产亲和基质的用途，所述亲和基质可在工业规模用于纯化血浆蛋白的方法中。出于本说明书的目的，术语“选择性结合”意在表示目标血浆蛋白与亲和基质的成分固定化脱氧核糖核酸的特异性非共价结合，所述结合是可逆的(通过使亲和基质与合适组成的溶液相接触实现)，其中所述亲和基质上形成了在所述脱氧核糖核酸和所述目标蛋白之间的非共价复合物，所述溶液也可称为洗脱溶液。根据本发明，术语“血浆蛋白”意在表示包含在血浆中的任何蛋白质，尤其是任何工业或治疗性目的的蛋白质。血浆蛋白包括白蛋白、α/巨球蛋白、抗胰凝乳蛋白酶、抗凝血酶、抗胰蛋白酶、Apo Α、Αρο B、Apo C, Apo D、Apo Ε, Apo F、Apo G、3XIIa、Cl-抑制剂、 C-反应蛋白、C7、Clr, Cls、C2、C3、C4、C4bP、C5、C6、Clq、C8、C9、羧肽酶 N、血浆铜蓝蛋白、 因子B、因子D、因子H、因子I、因子IX、因子V、因子VII、因子Vila、因子VIII、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纤维蛋白原、纤连蛋白、触珠蛋白、血液结合素、肝素辅因子II、 富含组氨酸的GP、IgA, IgD, IgE, IgG, IT1、IgM、激肽酶II、激肽原HPM、溶菌酶、PAI 2、PAI 1、PCI、纤溶酶、纤溶酶抑制剂、纤溶酶原、前白蛋白、激肽释放酶原、备解素、蛋白酶连接蛋白INH、C蛋白、S蛋白、Z蛋白、凝血酶原、TFPI、巯基蛋白酶、血栓调节蛋白、组织因子(TF)、 TPA、钴胺传递蛋白II、皮质激素运载蛋白、转铁蛋白、玻连蛋白和von Willebrand因子。特别的是，血浆蛋白包括凝血蛋白，换言之，参与导致血凝块形成的级联反应链中的所述血浆蛋白。凝血蛋白包括因子I (纤维蛋白原)、因子II (凝血酶原)、因子V(前加速素)、因子VII (前转变素)、因子VIII (抗血友病因子A)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X (司徒因子)、因子XI (Rosenthal因子或PTA)、因子XII (Hageman因子)、因子XIII (纤
8维蛋白-稳定因子或FSF)、PK(前激肽释放酶)、HMWK(高分子量激肽原)、组织促凝血酶原激酶、肝素辅因子II (HCII)、C蛋白(PC)、血栓调节蛋白(TM)、S蛋白(PS)、von Willebrand 因子(vWF)和组织因子途径抑制剂(TFPI)或其他组织因子。在一些实施方案中，血浆蛋白由具有酶活性的凝血蛋白组成。具有酶活性的凝血蛋白包括因子II (凝血酶原)、因子VII (前转变素)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(司徒因子)、因子XI (Rosenthal因子或PTA)、因子 XII (Hageman因子)、因子XIII (纤维蛋白-稳定因子或FSF)和PK(前激肽释放酶)。在一些优选实施方案中，血浆蛋白由天然的或重组的人血浆蛋白组成。在优选的实施方案中，血浆蛋白是天然的或重组的人因子VII。一般而言，可以固定本发明的适体的固体基质包括任何类型的基质，其具有常见于过滤基质、膜等的结构和组成。固体基质特别包括树脂、亲和层析柱树脂、聚合物珠、磁珠、顺磁珠、滤膜的基质材料等。固体基质还特别包括基于玻璃或金属的材料，例如不锈钢、 金、银、铝、铜、硅、玻璃或陶瓷。固体基质还特别包括聚合物材料，例如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏1，1- 二氟乙烯及其组合。在一些实施方案中，可以用材料包被固体基质，所述材料促进附着、结合、复合物形成、固定、或与适体的相互作用，或与包含所述适体的化合物的相互作用。在一些实施方案中，固体基质是表面包被了一层金、一层经历了羧甲基化处理、一层葡聚糖、胶原、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白等的载玻片。以这种方式，可以通过例如上述的附着包被(attachment coating)的手段，将根据本发明的适体或者包含根据本发明的适体的化合物固定在固体基质上，所述附着包被是通过产生共价键的化学反应，或者通过非共价键的结合，例如氢键、静电力、范德华力等。实施例描述了固定了脱氧核糖核酸适体的根据本发明的亲和基质的实施方案，所述固定是通过结构中包括的化合物，通过与固体基质材料的非共价键实现的。在实例中，特别描述了包含固体基质材料的亲和基质，所述材料的表面被移植了链霉抗生物素蛋白分子，脱氧核糖核酸适体包括在化合物的结构内，所述适体的一端与生物素分子偶联，并且所述适体通过在基质材料的链霉抗生物素蛋白分子和包含所述脱氧核糖核酸适体的化合物的生物素分子之间的非共价固定作用固定在所述固体基质材料上。在实例中，描述了这样的亲和基质的实施方案，所述亲和基质包含移植了链霉抗生物素蛋白分子的基质材料。此类固体基质材料是易于商购的。表述“特异性结合血浆蛋白的脱氧核糖核酸”或“适体”或“核酸适体”意指具有结合给定的目标血浆蛋白的能力的DNA (脱氧核糖核酸)分子，所述能力大于它结合任何其他的蛋白质的能力。在一些实施方案中，根据本发明的亲和基质的构件核酸适体具有结合给定的人血浆蛋白的能力，所述能力大于它结合任何其他的人蛋白质的能力。在一些实施方案中，根据本发明的核酸适体特别具有结合给定的人血浆蛋白的能力，所述能力大于它结合由非人哺乳动物的基因组编码的任何其他同源血浆蛋白的能力。 作为示例，可用于本发明的亲和基质中的特异性针对人因子VII的核酸适体，具有结合人因子VII的能力，所述能力大于它结合源自非人哺乳动物的因子VII (包括兔因子VII)的能力。
出于本说明书的目的，第一脱氧核糖核酸适体具有结合人因子Vll/VIIa的能力， 所述能力大于相等质量的第二脱氧核糖核酸适体的所述能力，当使用任一种上述结合检测技术并在相同的测试条件下时，相比用第二脱氧核糖核酸适体所获得的信号，用第一脱氧核糖核酸适体获得了统计学显著更高的结合信号值。作为示例，当使用的结合检测技术是 Biacore 技术时，不论所表达的共振测量单位，当第一脱氧核糖核酸适体的共振信号值统计学上高于所测量的第二脱氧核糖核酸适体的共振信号值时，第一脱氧核糖核酸适体具有结合人因子Vll/VIIa的能力，所述能力大于相等质量的第二脱氧核糖核酸适体的所述能力。两个“统计学上”不同的测量值包括这样的两个值，所述的两个值之间的差异大于所使用的结合检测技术的测量误差。优选的，本发明的亲和基质的脱氧核糖核酸适体具有与靶血浆蛋白的强亲和力。 优选的，所述脱氧核糖核酸适体相对于所述靶血浆蛋白，具有小于500nM的Kd值。可以根据Biacore 技术测量Kd值。作为示例，显示包含序列SEQ ID NO 86的核酸适体具有结合人因子Vll/VIIa的能力，所述能力显著大于它结合源自非人哺乳动物的任何因子Vll/VIIa的能力。特别的是，虽然包含序列SEQ ID N0:86的核酸的适体具有强的结合任何类型的人因子Vll/VIIa 的能力，包括天然的因子Vll/VIIa或重组的因子Vll/VIIa，但它与非人哺乳动物的基因组编码的因子Vll/VIIa(包括兔因子Vll/VIIa)结合的能力微弱或为零。更特别的是，对于包含序列seq id no 86的核酸的适体，根据Biacore 技术确定，其结合人因子VII/VIIa的能力按解离常数Kd表示，是约ΙΟΟηΜ。此外，所述核酸适体相对于人血浆因子Vll/VIIa以及重组的人血浆因子Vll/VIIa(例如在转基因兔中生产的)， 都具有相同的结合能力。还显示在包含序列SEQ ID NO 86的核酸的适体和人因子Vll/VIIa之间的复合物是化学计量的，即，序列SEQ ID N0:86的核酸的分子数与所复合的人因子Vll/VIIa的分子数的比例是约1 1，特别可以是1 1。如上文已提及的，本发明的亲和基质可用于纯化由非人转基因动物生产的重组人血浆蛋白的方法的步骤中。在纯化血浆蛋白的方法的此类实施方案中，复杂的起始基质包含重组的人蛋白作为与所述转基因哺乳动物天然生产的多种蛋白质的混合物，恰当时，包括与重组的人蛋白同源的血浆蛋白。可以理解，在此类实施方案中，本发明的亲和基质的构件核酸适体有利的选择性结合目标人蛋白，而在相同的操作条件下，不结合由非人哺乳动物天然生产的同源蛋白质。在本发明的亲和基质的构件核酸适体的这些特定的实施方案中，所述适体“特异性”结合目标人血浆蛋白的能力还可以表示为分别针对人蛋白和非人哺乳动物同源蛋白的解离常数Kd的比例。根据本发明的亲和基质的构件核酸适体的另一个特征，所述核酸适体特异性结合人血浆蛋白的能力还可以由下列条件(a)表示人Kd/非人 Kd < 0.01(A)，其中-“人K/’是核酸适体与所述人蛋白的解离常数，以摩尔单位表示，和-“非人K/’是所述核酸适体与非人同源蛋白的解离常数，以相同的摩尔单位表示。优选的，对于本发明的亲和基质在纯化重组人血浆蛋白的方法中的优化使用，还可以通过人Kd/非人Kd的比例小于0. 005来定义与所述重组人蛋白特异结合的核酸适体。可以根据称为SELEX的技术来制备本发明的亲和基质的构件核酸适体。所使用的术语“适体”包括能够特异性结合蛋白质的单链脱氧核糖核酸(DNA)分子。适体一般包含 5至120个核苷酸，并可根据称为SELEX (通过指数富集的配体系统进化)的方法在体外选择，所述方法最初特别描述在PCT申请号WO 1991/019813中。关于获得根据本发明使用的 DNA适体，用于选择适体的SELEX方法在于使蛋白质与脱氧核糖核酸的组合文库(一般IO15 个分子)相接触；消除不结合靶的脱氧核糖核酸，分离并扩增结合靶的脱氧核糖核酸。重复所述方法直到溶液充分的富集了与目标蛋白具有良好亲和力的脱氧核糖核酸(Tuerk和 Gold,"Systematic evolution of ligands by exponential enrichment :RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase" (1990) Science, 249 (4968) :505-10,和 Ellington 和 Szostak,“In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands，，(1990) Nature Aug 30 ；346 (6287) :818-22)。文件 EP 0 786 469、EP 668 931、EP 1 695 978 和 EP 1 493 825中给出了 SELEX方法的其他实例，在执行选择根据本发明使用的脱氧核糖核酸适体的方法中可以重复上述文件的教导。对于它在纯化人因子Vll/VIIa的手段中的用途，特异性结合目标血浆蛋白的脱氧核糖核酸优选的包括在化学结构中，在本说明书中也称为“化合物”，所述化学结构还包括间隔基和恰当时，包括固定在固体基质上的手段。在一些实施方案中，脱氧核糖核酸适体包括在下列通式(I)的化合物的结构内[FIX]x-[SPACJy-[APT] (I)，其中:-[FIX]表示固定在基质上的化合物，-[SPAC]表示间隔基链，-[APT]表示特异性结合血浆蛋白的脱氧核糖核酸，也称为脱氧核糖核酸适体，-χ是等于0或1的整数，和_y是等于0或1的整数。在通式(I)的化合物中，[SPAC]表示的间隔基链可以是任何已知的类型。所述间隔基链具有物理性分隔脱氧核糖核酸与固定了所述化合物的固体基质表面的功能，以及允许核酸相对于可固定的固体基质表面的相对运动性的功能。间隔基链限制或阻止了由于固体基质和核酸彼此过于靠近的空间位阻，从而阻碍所述核酸和可能与所述核酸相接触的血浆蛋白分子之间的结合事件。在通式(I)的化合物中，间隔基链优选结合在脱氧核糖核酸适体的5’端或3’端。有利的，间隔基链既结合在适体的一端也结合在固体基质上。该含有间隔基的构造具有不直接将适体固定在固体基质上的优点。优选的，间隔基链是非特异性的寡核苷酸或聚乙二醇(PEG)。当间隔基链由非特异性的寡核苷酸组成时，所述寡核苷酸长度上有利的包含至少5个核苷酸，优选长度在5和15个核苷酸之间。在间隔基链由聚乙二醇组成的通式⑴的化合物的实施方案中，所述间隔基链包 PEG(C 18)型的聚乙二醇，由例如Sigma Aldrich公司出售。为了将适体固定在间隔基链上，可以用多种化学基团化学修饰脱氧核糖核酸，例如使其能够共价固定所述核酸的基团，例如巯基、胺或任何其他能够与存在于固体基质上的化学基团反应的基团。
权利要求
1.选择性结合血浆蛋白的亲和基质，其包含固体基质材料，该固体基质材料上固定了特异结合所述血浆蛋白的脱氧核糖核酸适体。
2.权利要求1或2要求保护的亲和基质，其特征是所述脱氧核糖核酸适体包括在下面通式(I)的化合物的结构内[FIX]x-[SPACJy-[APT] (I)，其中:-[FIX]表示固定在基质上的化合物，-[SPAC]表示间隔基链，-[APT]表示特异性结合血浆蛋白的脱氧核糖核酸，-χ是等于0或1的整数，和-y是等于0或1的整数。
3.权利要求2要求保护的亲和基质，其特征是在通式(I)的化合物中，[APT]由序列 SEQ ID NO 1的脱氧核糖核酸组成。
4.权利要求1或3任一项要求保护的亲和基质，其特征是血浆蛋白选自白蛋白、α/巨球蛋白、抗胰凝乳蛋白酶、抗凝血酶、抗胰蛋白酶、Apo Α、Αρο B、Apo C, Apo D、Apo Ε, Apo F、Apo G、β Xlla、Cl-抑制剂、C-反应蛋白、C7、Clr、Cls、C2、C3、C4、C4bP、C5、C6、Clq、C8、 C9、羧肽酶N、血浆铜蓝蛋白、因子B、因子D、因子H、因子I、因子IX、因子V、因子VII、因子 Vila、因子VIII、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纤维蛋白原、纤连蛋白、触珠蛋白、血液结合素、肝素辅因子II、富含组氨酸的GP、IgA, IgD, IgE, IgG, IT1、IgM、激肽酶II、激肽原HPM、溶菌酶、PAI 2,PAI 1、PCI、纤溶酶、纤溶酶抑制剂、纤溶酶原、前白蛋白、激肽释放酶原、备解素、蛋白酶连接蛋白INH、C蛋白、S蛋白、Z蛋白、凝血酶原、TFPI、巯基蛋白酶、血栓调节蛋白、组织因子(TF)、TPA、钴胺传递蛋白II、皮质激素运载蛋白、转铁蛋白、玻连蛋白和 von Willebrand 因子。
5.权利要求1至4的任一项要求保护的亲和基质，其特征是血浆蛋白由选自因子I(纤维蛋白原)、因子II (凝血酶原)、因子V(前加速素)、因子VII (前转变素)、因子VIII (抗血友病因子A)、因子IX (抗血友病因子B)、因子X (司徒因子)、因子XI (Rosenthal因子或 PTA)、因子XII (Hageman因子)、因子XIII (纤维蛋白-稳定因子或FSF)、PK(前激肽释放酶)、HMWK(高分子量激肽原)、组织促凝血酶原激酶、肝素辅因子II (HCII)、C蛋白(PC)、血栓调节蛋白(TM)、S蛋白(PS), von Willebrand因子(vffF)和组织因子途径抑制剂(TFPI) 或其他组织因子的凝血蛋白组成。
6.权利要求1至5的任一项要求保护的亲和基质，其特征是固体基质材料选自树脂、聚合物珠、磁珠、偏磁珠、滤膜的基质材料和聚合物材料。
7.将血浆蛋白固定在基质上的方法，其包括这样的步骤，在所述步骤中，将含有所述血浆蛋白的样品与权利要求1至6的任一项要求保护的亲和基质接触。
8.纯化血浆蛋白的方法，包括下列步骤a)将含有血浆蛋白的样品与权利要求1至6的任一项要求保护的亲和基质接触，以便形成在(i)固定在所述亲和基质上的核酸适体和(ii)所述血浆蛋白之间的复合物，和b)从步骤a)形成的复合物中释放蛋白质，和c)以纯化的形式回收所述血浆蛋白。
9.权利要求8要求保护的方法，其特征是所述样品选自人血浆，或其级分，或对所述血浆蛋白转基因的哺乳动物的乳，或其级分。
10.权利要求8或9要求保护的方法，其特征是所述血浆蛋白是人的。
11.权利要求10要求保护的方法，其特征是所述样品包含至少一种非人血浆蛋白。
12.权利要求11要求保护的方法，其特征是所述人血浆蛋白与所述非人血浆蛋白是同源的。
13.权利要求12要求保护的方法，其特征是所述人血浆蛋白是所述非人血浆蛋白的同源物。
14.权利要求8至13的任一项要求保护的方法，其特征是所述步骤b)是通过使亲和基质与含有二价离子螯合剂，优选EDTA的洗脱缓冲液接触而进行的。
15.重组人血浆蛋白的纯化的组合物，其包含按重量计至少99.9%的所述重组人蛋白，并且基本不含非人蛋白。
16.药物组合物，其包含权利要求15要求保护的重组人血浆蛋白的纯化组合物。
全文摘要
本发明涉及用于选择性结合血浆蛋白的亲和基质，其包括固体基质材料，该固体基质材料上固定了与所述血浆蛋白特异性结合的脱氧核糖核酸适体。
文档编号C07K14/765GK102405228SQ201080017044
公开日2012年4月4日 申请日期2010年2月19日 优先权日2009年2月19日
发明者G·佩雷, M·诺里 申请人:Lfb 生物技术公司