专利名称：用于检测基孔肯雅病毒的探针和引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过使用“寡核苷酸”探针利用分离自血液样品的核酸来检测基孔肯雅病毒感染的方法。本发明所采用的检测方法是实时PCR。
背景技术：
基孔肯雅病毒产于热带非洲和亚洲，通过感染的蚊子叮咬传播给人类，通常是伊蚊属。基孔肯雅病毒属于多加病毒科的α病毒。它是一种“虫媒病毒”(Ar-节肢动物， bo_传播)。CHIK热(基孔肯雅热)流行病经由人类-蚊子-人类蔓延传播。单词“基孔肯雅”被认为来自当地方言所描述的与该病相关的严重的关节疼痛引起的患者的扭曲姿势。 主要的病毒储存宿主是猴子，但其他物种也会受到感染，包括人类。基孔肯雅(马孔德语指“弯曲的”)病毒(CHIKV)是一种昆虫传播的病毒，α病毒属，由病毒携带体伊蚊传播给人类。最近有CHIKV的爆发，具有较高的发病率。CHIKV引起疾病的症状类似于登革热。CHIKV显现疾病的急性发热阶段，仅持续两到五天，接着是长期的影响到四肢关节的关节痛病。CHIKV感染相关的关节疼痛持续数周或数月。基孔肯雅病的潜伏期是两到四天。该病的症状包括高热到40C(104F)，躯干及偶尔四肢的瘀斑或斑丘疹，及影响到多个关节的关节痛或关节炎。其他非特异症状包括头痛、结膜感染及轻微畏光。典型地，发烧持续两天，然后突然结束。然而，其他症状，即关节痛、剧烈头痛、失眠与极度衰竭，持续时间不同，通常约5到7天。主诉关节痛持续时间很长的患者取决于他们的年龄。常见的实验室检查基孔肯雅包括RT-PCR、病毒分离和血清学试验。病毒分离提供了最明确的诊断，但需要1-2周完成，且必须在生物研究安全性3级实验室进行。 该技术包含使具体的细胞系接触到全血样品，并识别基孔肯雅病毒特异性反应。RT-PCR应用套式引物对(nested primer pairs)，放大全血的数个基孔肯雅特异性基因。结果在1_2 天确定。血清学诊断比其他方法需要更多量的血，应用ELISA试验测量基孔肯雅特异性IgM 水平。结果需要2-3天，且其他相关病毒感染，如奥尼昂尼昂病毒(0’ nyong' nyong)和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)时常产生假阳性。
发明内容
因此，本发明涉及有SEQ ID No. 1和2的探针；有SEQ ID No. 1和2在5'末端或 3'末端或两处与可检测标记结合的探针；SEQ ID No. 3、4、5和6的引物；用于检测基孔肯雅病毒的PCR反应混合物，所述混合物包含待检测的样品、核酸扩增试剂、选自包含SEQ ID No. 1和2的组中的探针、及选自包含SEQ ID No. 3、4、5和6的组中的相应引物；一种检测及可选地量化基孔肯雅感染的方法，所述方法包含以下步骤a)形成反应混合物，包含待检测的样品、核酸扩增试剂、选自包含SEQ ID No. 1和2的组中的探针、及选自包含SEQ ID No.3、4、5和6的组中的相应引物，b)使反应混合物进行PCR以获得目标序列的拷贝，然后通过测量荧光信号的增加以检测基孔肯雅感染，以及c)可选地从检测信号构建标准曲线以获得用于量化基孔肯雅感染的拷贝数；一种检测基孔肯雅感染的试剂盒，所述试剂盒包含单独地或组合地SEQ ID No. 1和2的探针；单独地或组合地SEQ ID No. 3、4、5和6的相应引物对，以及扩增试剂。
图1显示基孔肯雅病毒的标准曲线。
具体实施例方式本发明涉及有SEQ ID No. 1和2的探针。在本发明的一个实施例中，所述探针用于检测基孔肯雅病毒。本发明涉及有SEQ ID No. 1和2在5'末端或3'末端或两处与可检测标记结合的探针。在本发明的一个实施例中，所述探针在5'末端与荧光团结合，而在3'末端与猝灭剂结合。在本发明的另一个实施例中，所述荧光团选自包含荧光素及荧光素衍生物VIC、 J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、荧光黄、德克萨斯红、四甲基罗丹明、6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素、5-羧基罗丹明和花青染料的组。在本发明的另一个实施例中，所述猝灭剂选自包含四甲基罗丹明、4' -(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-马来酰亚胺、四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明及黑洞猝灭剂染料的组。在本发明的另一个实施例中，优选的荧光团是5'末端的6-羧基荧光素[FAM]，优选的猝灭剂是3'末端的四甲基罗丹明[TAMRA]。本发明涉及引物SEQ ID No. 3、4、5和6。在本发明的一个实施例中，有SEQ ID No. 3和4的引物是正义引物，有SEQ ID No. 5 和6的引物是反义引物。在本发明的另一个实施例中，有SEQ ID No. 3和5的引物对应于探针SEQ ID No. 1， 有SEQ ID No. 4和6的引物对应于探针SEQ ID No. 2。在本发明的另一个实施例中，有SEQ ID No. 1和2的探针可选地在5'末端或3' 末端或两处与可检测标记结合。本发明涉及一种检测基孔肯雅病毒的PCR反应混合物，所述混合物包含待检测的样品，核酸扩增试剂，选自包含SEQ ID No. 1和2的组中的探针，及选自包含SEQ ID No. 3、 4、5和6的组中的相应引物。在本发明的一个实施例中，有SEQ ID No. 3和5的引物对应于探针SEQ ID No. 1， 有SEQ ID No. 4和6的引物对应于探针SEQ ID No. 2。在本发明的另一个实施例中，有SEQ ID No. 1和2的探针可选地在5'末端或3' 末端或两处与可检测标记结合。在本发明的另一个实施例中，所述样品选自包含血液、血清和血浆的组。本发明涉及一种检测及可选地量化基孔肯雅感染的方法，所述方法包含以下步骤a)形成反应混合物，所述反应混合物包含待检测的样品、核酸扩增试剂、选自包含SEQ ID No. 1和2的组中的探针、以及选自包含SEQ ID No. 3、4、5和6的组中的相应引物；b)使反应混合物进行PCR以获得目标序列的拷贝，然后通过测量荧光信号的增加以检测基孔肯雅感染；以及c)可选地从检测信号构建标准曲线以获得用于量化基孔肯雅感染的拷贝数。在本发明的一个实施例中，有SEQ ID No. 3和4的引物是正义引物，有SEQ ID No. 5 和6的引物是反义引物，其中样品选自包含血液、血清和血浆的组。在本发明的另一个实施例中，有SEQ ID No. 3和5的引物对应于探针SEQ ID No. 1， 有SEQ ID No. 4和6的引物对应于探针SEQ ID No. 2。在本发明的另一个实施例中，有SEQ ID No. 1和2的探针在5'末端或3'末端或两处与可检测标记结合，其中荧光信号由在5'末端的荧光团和在3'末端有猝灭剂的探针产生。在本发明的另一个实施例中，所述荧光团选自包含荧光素及荧光素衍生物VIC、 J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、荧光黄、德克萨斯红、四甲基罗丹明、6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素、5-羧基罗丹明和花青染料的组，其中，所述猝灭剂选自包含四甲基罗丹明、4' -(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-马来酰亚胺、四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明及黑洞猝灭剂染料的组。本发明涉及一种用于检测基孔肯雅感染的试剂盒，所述试剂盒包含单独地或组合地探针SEQ ID No. 1和2，单独地或组合地SEQ ID No. 3、4、5和6的相应引物对，以及扩增试齐LU在本发明的一个实施例中，有SEQ ID No. 1和2的探针可选地在5 ‘末端或3 ‘末端或两处与可检测标记结合。在本发明的另一个实施例中，所述扩增试剂是包含氯化镁、Taq聚合酶和扩增缓冲液的组合。本发明的主要目的是利用分离自感染的血液样本的核酸来检测基孔肯雅病毒感染。检测的方式是通过使用标记荧光团与猝灭剂的“寡核苷酸”探针，应用实时PCR监测荧光的增加。探针和引物设计有SEQ ID No. 1的探针与有SEQ ID No. 3和5的引物一起被设计针对基孔肯雅的非结构性蛋白nsP4基因。类似地，SEQ ID No. 2探针与SEQ ID No. 4和6引物被设计成针对基孔肯雅的结构蛋白基因。本发明涉及称为SEQ ID No. 1探针的“寡核苷酸”探针与称为SEQ ID No. 3和5的引物一起用于检测基孔肯雅病毒感染，其中所述引物分别是正义和反义引物；SEQ ID No. 2 探针与称为SEQ ID No. 4和6的引物一起用于检测基孔肯雅病毒感染，其中所述引物分别是正义和反义引物。根据本发明，SEQ ID No. 1探针分别与其正义和反义引物一起被设计用作基孔肯雅的非结构性蛋白nsP4基因。类似地，SEQ ID No. 2探针分别与其相应的正义和反义引物一起被设计用作基孔肯雅的结构蛋白基因。根据本发明，所述“寡核苷酸”探针与在5'末端有荧光团在3'末端有猝灭剂的可检测标记结合。所述荧光团选自包含荧光素及荧光素衍生物FAM、VIC、J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘磺酸、香豆素及香豆素衍生物、荧光黄、 德克萨斯红、四甲基罗丹明、6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素、5-羧基罗丹明和花青染料的组。在本发明的另一个实施例中，所述猝灭剂选自包含四甲基罗丹明、4 ‘ - (4- 二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-马来酰亚胺、四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明及BHQ染料的组。在本发明的另一个实施例中，所述荧光团是6-羧基荧光素[FAM]，所述猝灭剂是四甲基罗丹明[TAMRA]。在本发明的另一个实施例中，所述检测本质上是定性或定量的。本发明涉及一个检测基孔肯雅病毒感染的PCR反应混合物，其中所述混合物包含核酸扩增试剂，称为SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的“寡核苷酸”探针结合称为SEQ ID No. 3 和5或SEQ ID No.4和6的引物，和分离自血液/血清/血浆样品的基孔肯雅核酸。本发明涉及一种检测基孔肯雅病毒感染的方法，其中所述PCR混合物包含核酸扩增试剂，称为SEQ ID No.l或SEQ ID No. 2的“寡核苷酸”探针及其相应引物，和应用实时PCR扩增获得目标序列拷贝的待检测的样品。扩增的测量依据荧光信号的增加。所述“寡核苷酸”探针的大小范围是2046个核苷酸。所设计的探针5'末端有荧光团，3'末端有猝灭剂。5'末端的荧光团是6-羧基荧光素[FAM]，当猝灭剂存在于3'末端时是四甲基罗丹明[TAMRA]。本发明用于检测血液/血清/血浆样品中的基孔肯雅病毒感染。用于检测的方法是通过监测PCR反应荧光的增加。根据本发明，所述“寡核苷酸探针”指的是一种脱氧核糖核酸(DNA)的短序列。该寡核苷酸探针能与目标DNA特异杂交，而与未感染的DNA没有表现出非特异杂交。本文所用探针遵循Taqman化学原则。TaqMan探针也称为双染寡核苷酸或双标探针，是最广泛应用的探针类型。因此，根据本发明，所述“寡核苷酸”探针被进一步与其相应的正义和反义引物结合提供，通过实时PCR能够用于特异扩增和检测检验样品中的基孔肯雅病毒序列。也可以基于从标准曲线获得的Ct量化病毒负载量。有SEQ ID No. 1和2的探针与其相应的引物具有如表1和表2中所描述的序列。表.1
序列名核苷酸序列SEQ ID No. 15 ‘ -TTCGATGCCATCATAGCCGCACACTT-3‘SEQ ID No. 35 ‘ -CCTCCTACCCAATGTACATACACTATTT-3‘SEQ ID No. 55' -AGGAGGCTATGTCCGTTTCTAAAA-3‘表.2
权利要求
1.有SEQID No. 1和2的探针。
2.根据权利要求1所述的探针，其中所述探针用于检测基孔肯雅病毒。
3.有SEQID No. 1和2在5'末端或3'末端或两处与可检测标记结合的探针。
4.根据权利要求3所述的探针，其中所述探针在5'末端与荧光团结合、而在3'末端与猝灭剂结合。
5.根据权利要求4所述的探针，其中所述荧光团选自包含荧光素及荧光素衍生物VIC、 J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、荧光黄、德克萨斯红、四甲基罗丹明、6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素、5-羧基罗丹明和花青染料的组。
6.根据权利要求4所述的探针，其中所述猝灭剂选自包含四甲基罗丹明、4'-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-马来酰亚胺、四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明及黑洞猝灭剂染料的组。
7.根据权利要求5和6所述的探针，其中优选的荧光团是5'末端的6-羧基荧光素 [FAM]，而优选的猝灭剂是3'末端的四甲基罗丹明[TAMRA]。
8.引物SEQ ID No. 3、4、5 和 6。
9.根据权利要求8所述的引物，其中有SEQID No. 3和4的引物是正义引物，有SEQ ID No. 5和6的引物是反义引物。
10.根据权利要求9所述的引物，其中所述有SEQID No. 3和5的引物对应于探针SEQ ID No. 1，所述有SEQ ID No. 4和6的引物对应于探针SEQ ID No. 2。
11.根据权利要求9所述的引物，其中所述有SEQID No. 1和2的探针可选地在5'末端或3'末端或两处与可检测标记结合。
12.—种检测基孔肯雅的PCR反应混合物，所述混合物包含待检测的样品、核酸扩增试剂、选自包括SEQ ID No. 1和2的组中的探针、以及选自包括SEQ ID No. 3、4、5和6的组中的相应引物。
13.根据权利要求12所述的反应混合物，其中所述有SEQID No. 3和5的引物对应于探针SEQ ID No. 1，所述有SEQ ID No. 4和6的引物对应于探针SEQ ID No. 2。
14.根据权利要求13所述的反应混合物，其中所述有SEQID No. 1和2的探针在5' 末端或3'末端或两处与可检测标记可选地结合。
15.根据权利要求12所述的反应混合物，其中所述样品选自包括血液、血清和血浆的组。
16.一种检测与可选地量化基孔肯雅感染的方法，所述方法包含以下步骤(a)形成反应混合物，所述反应混合物包含待检测的样品、核酸扩增试剂、选自包括SEQ ID No. 1和2的组中的探针、以及选自包括SEQ ID No. 3、4、5和6的组中的相应引物；(b)使反应混合物进行PCR以获得目标序列的拷贝，然后通过测量荧光信号的增加来检测基孔肯雅感染；以及(c)可选地，由检测信号构建标准曲线以获得用于量化所述基孔肯雅感染的拷贝数。
17.根据权利要求16所述的方法，其中有SEQID No. 3和4的引物是正义引物，有SEQ ID No. 5和6的引物是反义引物，并且其中所述样品选自包含血液、血清和血浆的组。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述有SEQID No. 3和5的引物对应于探针SEQ ID No. 1，所述有SEQ ID No. 4和6的引物对应于探针SEQ ID No. 2。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述有SEQID No. 1和2探针在5'末端或3' 末端或两处与可检测标记结合，其中所述荧光信号由在5'末端具有荧光团和在3'末端具有猝灭剂的探针产生。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述荧光团选自包含荧光素及荧光素衍生物 VIC、J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、荧光黄、德克萨斯红、 四甲基罗丹明、6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素、5-羧基罗丹明和花青染料的组， 并且其中所述猝灭剂选自包含四甲基罗丹明、4' -(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-马来酰亚胺、四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明及黑洞猝灭剂染料的组。
21.一种检测基孔肯雅感染的试剂盒，所述试剂盒包含单独地或组合地探针SEQ ID No. 1和2 ；单独地或组合地SEQ ID No. 3、4、5和6的相应引物对，及扩增试剂。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述有SEQID No. 1和2的探针可选地在5 ‘ 末端或3'末端或两处与可检测标记结合。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述扩增试剂是包含氯化镁、Taq聚合酶和扩增缓冲液的组合。
全文摘要
本发明详细描述了通过使用“寡核苷酸”探针，确定血液/血清/血浆样品中基孔肯雅病毒核酸存在的方法。通过使用实时PCR，所设计的“寡核苷酸”探针能用于定性或定量检测感染样品中的基孔肯雅病毒。
文档编号C07H21/04GK102414217SQ201080018304
公开日2012年4月11日 申请日期2010年2月23日 优先权日2009年2月25日
发明者曼尤拉·贾甘纳特, 皮拉里塞蒂·文卡塔·苏巴拉奥, 钱德拉塞克哈尔·布哈斯卡拉恩·奈尔 申请人:彼格泰格私人有限公司