多发性硬化的治疗的制作方法

专利名称：多发性硬化的治疗的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及用于治疗和/或预防多发性硬化(MQ的方法。根据本发明， GM-CSF的拮抗物在多发性硬化的治疗中可以是有效的。GM-CSF的拮抗物包括，但不限于， 对GM-CSF或GM-CSF受体特异性的抗体。
背景技术：
多发性硬化(MS)，也称作播散性硬化或播散性脑脊髓炎，是其中免疫系统攻击中枢神经系统(CNQ的自身免疫病。实质上，MS通过损坏髓磷脂而影响脑和脊髓中神经细胞互相联系的能力。当失去髓磷脂后，轴突不再有效地传导信号。已描述了 MS的4个主要亚型(Neurology (1996)46 ；901-911 ；还参见

图1)。复发缓解型亚型的特征是不可预测的复发，随后几月到几年无疾病活动性的新体征的相对静息 (缓解)时期。继发性进行性MS描述了具有初始复发缓解型MS的那些人，且其然后开始在急性发作之间具有进行性神经衰退，而不具有任何确定的缓解时期。原发性进行性亚型描述了在其起始MS症状之后从没有缓解的患者，特征为从发病开始的伤残(disability)的进展，无缓解和改善或仅有偶发的和轻微的缓解和改善。最后，进行性复发型MS描述了从发病起具有持续的神经退化但还遭受明显的重叠发作的那些个体。还存在MS的多种非典型病例。MS的症状是多方面的且通常在恶化(复发)的间歇性急性期、在神经功能逐步进行性退化中出现，或在二者的组合中出现。常见的为感觉中枢症状、视觉症状、小脑症状和运动症状。MS患者可遭受几乎任何神经症状或体征，包括感觉的改变(感觉迟钝和感觉异常)、肌无力、肌痉挛、运动困难；协调和平衡困难；语言或吞咽问题；视觉问题；疲劳、急性或慢性疼痛、和膀胱和肠困难。不同程度的认知损害和抑郁的情感症状或不安情绪也是常见的。MS通常在30多岁的成人中出现，但其也可出现在儿童中，且原发性进行性亚型在 50多岁的人中更常见。如许多自身免疫疾患一样，该疾病在女性中更常见，且趋势可能在渐
+曰O在MS中，免疫系统攻击神经系统，可能地是暴露于与其自身具有相似结构的分子的结果。MS损害最常涉及靠近小脑室、脑干、基底神经节和脊髓的白质区域；和视神经。白质细胞的功能是在处理信号的灰质区域和机体的其它部分之间传送信号。MS破坏少突胶质细胞，该细胞负责构建和维持脂肪层——称作髓鞘——其协助神经元传送电信号。MS导致髓磷脂变薄或完全缺失，且随疾病进展导致神经元延伸或轴突的截断(横断)。修复的过程称作髓鞘再生，发生在疾病的早期阶段，但少突胶质细胞不能完全重建细胞的髓鞘。重复发作导致连续较少的有效的髓鞘再生，直至在受损的轴突周围形成疤痕样斑。
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除脱髓鞘之外，疾病的另一个病理标志是炎症。T细胞将髓磷脂识别为外源的且将其视作侵入病毒来攻击。这触发了炎症过程，刺激了其它免疫细胞和可溶性因子如细胞因子和抗体。存在用于多发性硬化的一些疗法，但已知没有治愈的。不同的疗法用于急性发作的控制，以缓和疾病并控制MS的作用。对于急性症状的发作的控制，常规疗法是静脉施用或口服施用皮质类固醇。该治疗在短期缓解症状中是有效的，但对患者的长期恢复没有显著作用。根据MS的确切性质和亚型不同，使用了用于疾病缓解治疗的大量疗法。用于复发-缓解型MS的治疗包括干扰素(干扰素β -Ia和干扰素β -lb)、醋酸格拉默(Copaxone ； 通过将其自身替换为免疫系统攻击的靶标而保护髓磷脂蛋白的多肽的混合物)、米托蒽醌 (免疫抑制剂，也用于癌症化疗)和那他珠单抗(Tysabri ；人源化的单克隆抗体，细胞粘附分子α 4-整联蛋白)。用于继发性进行性MS和进行性复发型MS的治疗包括米托蒽醌、那他珠单抗和干扰素-P-lMbetaferon)。另外，还使用了主要探索性治疗。MS与导致一系列进行性损害和障碍的多种症状和功能性缺陷相关联。为控制MS的影响，大量疗法是已知的，并按照具体病例可能所需来使用。已知一些细胞因子参与多发性硬化，所述细胞因子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Ponomarev 等人；J Immunol (2007) 178 ；39-48 ；McQualter 等人；J Exp Med. (2001) 194 ；873-82)。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是作为白细胞生长因子发挥作用的细胞因子。GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。单核细胞退出循环并迁移到组织中，由此它们成熟为巨噬细胞。因此，其为天然免疫/炎症级联反应的一部分，由此小量巨噬细胞的激活可快速导致其数量的增加，这是抗感染的关键过程。在胞外发现GM-CSF的活性形式为可溶性单体。具体地， GM-CSF已被鉴定为如类风湿性关节炎(RA)的自身免疫疾患中的炎症介导者，导致增加的促炎细胞因子、趋化因子和蛋白酶产生，且从而最终导致关节破坏。发明概述本发明证明，拮抗GM-CSF的作用是治疗MS的有效方法。具体地，抗GM-CSF或其受体的抗体是MS治疗中有效的干预点。因此，本发明提供了，例如，用于在受治疗者中治疗多发性硬化的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用有效量的GM-CSF拮抗物的步骤。在另一方面，本发明考虑了用于在受治疗者中预防多发性硬化的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用有效量的GM-CSF拮抗物的步骤。在另一方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物包括能够拮抗GM-CSF在多发性硬化中的病生理作用的GM-CSF拮抗物，所述组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。在另一方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物包括在多发性硬化的治疗中有用的GM-CSF拮抗物，所述组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。在本发明的特定的方面，GM-CSF拮抗物是对GM-CSF特异性的抗体。在本发明的可选的方面，GM-CSF拮抗物是对GM-CSF受体特异性的抗体。在其它方面，本发明涉及GM-CSF拮抗物用于制备治疗多发性硬化的药物的用途。在其它方面，本发明提供了用于治疗多发性硬化的GM-CSF拮抗物。在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”、“具有(have)“和“包括(include)”和其相应的变化形式诸如“包含(comprises) ”、“包含 (comprising) ”、“具有(has) ”、“具有(having) ”、“包括(includes) ”和“包括(including)，， 将理解为表示含有所指的元素或整数、或元素或整数的组，但不排除任何其它元素或整数、 或元素或整数的组。附图简述^！描绘了 MS的4个主要亚型的进行性类型。Sl显示了 GM-CSF拮抗物在MOG诱导的MS的EAE模型中的效力(预防性治疗)。 显示了 0-15天的累积EAE评分。A 用媒介物(PBS)处理的动物；B 用10mg/kg MOR-GM处理的动物；C 用20mg/kgM0R-GM处理的动物；D 用50mg/kg MOR-GM处理的动物；E 用0. 5mg/ kg地塞米松处理的动物；F 用50mg/kg MOR-NOGM (同种型对照抗体)处理的动物；G 在第 14天第一次处理的用50mg/kg MOR-GM处理的动物(治疗性治疗)。* 与同种型对照抗体相比P < 0. 05。$ 与PBS处理相比P < 0. 05。Ml显示了用MOR-GM处理后疾病发病的延迟。A 用媒介物(PBS)处理的动物；B 用 10mg/kg MOR-GM 处理的动物；C 用 20mg/kgM0R_GM 处理的动物；D 用 50mg/kg MOR-GM 处理的动物；E 用0. 5mg/kg地塞米松处理的动物；F 用50mg/kg MOR-NOGM(同种型对照抗体)处理的动物；G 在第14天第一次治疗的用50mg/kg MOR-GM处理的动物(治疗性治疗)。* 与同种型对照抗体相比P < 0. 05。$ 与PBS处理相比P < 0. 10。Mi显示了用本发明的化合物处理之后在脊髓的骶骨部分中炎性细胞的浸润。A 用50mg/kg MOR-NOGM处理的动物(同种型对照抗体；预防性处理)；B 用50mg/kg MOR-GM 处理的动物(预防性处理)；C 用50mg/kg MOR-GM处理的动物(治疗性处理)；D 用0. 5mg/ kg地塞米松处理的动物(预防性处理)。每个数据点指示一个个体动物的评分。与同种型对照抗体相比P < 0. 10。* 与同种型对照抗体相比P < 0. 05。M5显示了脊髓的骶骨部分中脱髓鞘的程度。A 用50mg/kgM0R-N0GM处理的动物 (同种型对照抗体；预防性处理)；B 用50mg/kgM0R-GM处理的动物(预防性处理)；C 用 50mg/kg MOR-GM处理的动物(治疗性处理)；D 用0. 5mg/kg地塞米松处理的动物(预防性处理)。每个数据点指示一个个体动物的评分。* :与同种型对照抗体相比P <0.05。发明详述本发明证明了 GM-CSF是用于MS治疗的有效靶标。在这方面，本发明在一方面提供了利用GM-CSF拮抗物在MS领域带来预防性或治疗性利益的方法。本发明提供了治疗性方法，所述方法包括向需要这种治疗的受治疗者施用治疗有效量的GM-CSF拮抗物。如本文所用的，“治疗有效量”或“有效量”指引发期望的生物响应必需的GM-CSF拮抗物的量。根据本发明，治疗有效量是治疗和/或预防多发性硬化必需的 GM-CSF拮抗物的量。如本文所用的，“GM-CSF拮抗物”包括最宽泛含义的GM-CSF拮抗物；抑制GM-CSF的活性或功能、或通过任何其它途径对GM-CSF施加治疗性作用的任何分子。术语GM-CSF拮抗物包括，但不限于，特异性结合GM-CSF的抗体、对GM-CSF特异性的抑制性核酸或对GM-CSF 特异性的有机小分子。术语GM-CSF拮抗物的含义还包括与GM-CSF受体特异性结合的抗体、 对GM-CSF受体特异性的抑制性核酸或对GM-CSF受体特异性的有机小分子。术语GM-CSF 拮抗物还指非抗体支架分子，比如纤连蛋白支架、锚蛋白、maxybody/avimer、蛋白A衍生的分子、蛋白表位模拟物(PEM)或类似物。抑制性核酸包括但不限于，反义DNA、三链体形成寡核苷酸、外部指导序列、SiRNA 和微小RNA。有用的抑制性核酸包括与对照相比，减少编码GM-CSF的RNA表达至少20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的那些抑制性核酸。抑制性核酸和产生它们的方法是本领域中熟知的。siRNA设计软件是可获得的。对GM-CSF或GM-CSF受体特异性的有机小分子(SMOL)可经由天然产物筛查或化学文库的筛查来鉴定。通常SMOL的分子量低于500道尔顿，更通常从160到480道尔顿。 SMOL的其它典型性质是以下一种或多种·分配系数log P在从-0. 4至+5. 6的范围中·摩尔折射率从40至130·原子的数目从20至70综述参见Ghose 等人(1999) J Combin Chem 1，55-68 和 Lipinski 等人(1997) Adv Drug Del Rev :23，3-25。优选地，用于本发明的GM-CSF拮抗物是对GM-CSF特异性或对GM-CSF受体特异性的抗体。此类抗体可以是任何类型，比如鼠抗体、大鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。因此，“人类”抗体或功能性的人类抗体片段定义为非嵌合的(例如，非“人源化的”) 和非(全部地或部分地)来自非人物种的抗体。人类抗体或功能性抗体片段可来源于人类或可以是合成的人类抗体。“合成的人类抗体”在本文定义为具有整个或部分地计算机模拟地来源于基于已知人类抗体序列的分析的合成序列的序列的抗体。人类抗体序列或其片段的计算机模拟设计可例如通过分析人类抗体或抗体片段序列数据库并利用从其获得的数据设计多肽序列来实现。人类抗体或功能性抗体片段的另一实例是由从人类来源抗体序列文库(即，这种文库是基于从人类天然来源获取的抗体)分离的核酸编码的抗体或功能性抗体片段。“人源化抗体”或功能性人源化抗体片段在本文定义为(i)来源于非人类来源 (例如，带有异源免疫系统的转基因小鼠)，该抗体是基于人类种系序列；或(ii)嵌合的，其中可变结构域来源于非人类来源，恒定结构域来源于人类来源；或(iii) CDR-嫁接的，其中可变结构域的CDR来自非人类来源，而可变结构域的一个或多个构架为人类来源，恒定结构域(如果存在)为人类来源。术语“嵌合抗体”或功能性嵌合抗体片段在本文定义为具有来源于或对应于见于一种物种的序列的恒定抗体区和来源于另一物种的可变抗体区的抗体分子。优选地，恒定抗体区来源于或对应于见于人类如，见于人类种系或体细胞的序列，可变抗体区(如，VH、 VL、CDR或FR区)来源于见于非人类动物如，小鼠、大鼠、兔或仓鼠的序列。如本文所用的，如果抗体能够区分一种抗原(在本文是GM-CSF，或可选地GM-CSF 受体)与一种或多种参考抗原，则认为这样的抗体“特异性结合”、“特异性结合”、“对...特异性”或“特异性识别”这样的抗原，因为结合特异性不是绝对的，而是相对的性质。参考抗原可以是用作参考点的一种或多种紧密相关的抗原，如，IL3、IL5、IL-4、IL13或M-CSF。 以其最通用形式(且当未提及具体参考时)，“特异性结合”是指抗体区分目标抗原与无关抗原的能力，如例如根据以下方法之一确定的。所述方法包括但不限于，蛋白质印迹、 ELISA-检验、RIA-检验、ECL-检验、IRMA-检验和肽扫描。例如，可进行标准ELISA测定。
6评分可通过标准显色进行(如，第二抗体以辣根过氧化物，四甲基联苯胺以过氧化氢进行显色)。某些孔中的反应通过光密度，例如在450nm的光密度评分。典型的背景(=阴性反应)可以是0. IOD ；典型的阳性反应可以是10D。这表示阳性/阴性的差异可以大于10 倍。通常，结合特异性的确定不是通过利用单个参考抗原，而是利用一组约三种到五种无关抗原进行，诸如奶粉、BSA、铁传递蛋白或类似无关抗原。另外，“特异性结合”可能涉及抗体区分其靶抗原不同部分的能力，如，区分GM-CSF或GM-CSF受体的不同结构域或区域、或区分GM-CSF或GM-CSF受体的一个或多个关键氨基酸残基或氨基酸残基段。而且，本文所用的“免疫球蛋白”(Ig)在此定义为属于类IgG、IgM、IgE、IgA或 IgD(或其任何亚类)的蛋白，包括所有常规已知的抗体和其功能性片段。因此，抗体/免疫球蛋白的“功能性片段”定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段(如，IgG可变区)。抗体的“抗原结合区”通常见于抗体的一个或多个高变区，即，CDR-l、-2、和/或-3 区；然而，可变“构架”区也可在抗原结合中起重要作用，诸如通过提供CDR的支架。优选地，“抗原结合区”至少包含可变轻(VL)链的氨基酸残基4至103和可变重(VH)链的氨基酸残基5至109，更优选地包含VL的氨基酸残基3至107和VH的氨基酸残基4至111，尤其优选地是完整VL链和VH链(VL的氨基酸位置1至109和VH的氨基酸位置1至113 ；按照TO 97/08320编号)。用于本发明的优选免疫球蛋白类是IgG。本发明的“功能性片段” 包括F(ab' )2片段、Fab片段、scFv或包含单免疫球蛋白可变结构域或单结构域抗体多肽的构建体的结构域，如，单重链可变结构域或单轻链可变结构域。可改造F(ab' )2或？油以使在Chi结构域和Q结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用最小或完全去除。本发明的抗体可来源于基于计算机模拟设计并由合成产生的核酸编码的氨基酸序列的重组抗体文库。抗体序列的计算机模拟设计例如，通过分析人类序列数据库并利用从其获得的数据设计多肽序列来实现。用于设计和获得计算机模拟产生的序列的方法描述于，例如，Knappik 等人，J. Mol. Biol. (2000)296 :57 ；Krebs 等人，J. Immunol. Methods. (2001)254 67, Rothe 等人，J. Mol. Biol. (2008) 376 :1182 ；和授予 Knappik 等人的美国专利第6，300, 064号中，其全部内容在此通过引用并入。对GM-CSF特异性的任何抗体可用在本发明。示例抗体包括含如SEQ ID N0:1中所描绘的重链可变区的氨基酸序列或如SEQ ID NO :2中所描绘的轻链可变区的氨基酸序列的抗体。其它示例抗体包括来源于包含如SEQ ID NO :1中所描绘的重链可变区或如SEQ ID NO :2中所描绘的轻链可变区的氨基酸序列的抗体的抗体。又一些其它示例性抗体包括与包括如SEQ ID NO :1中所描绘的重链可变区或如SEQ ID NO :2中所描绘的轻链可变区的氨基酸序列的抗体具有相同特异性和/或结合相同表位的抗体。又一些其它示例性抗体包括含与如SEQ ID NO :1中所描绘的序列至少70%、至少80%、至少90%或至少95%同源的重链可变区的抗体。又一些其它示例性抗体包括含与如SEQ ID NO :2中所描绘的序列至少 70%、至少80%、至少90%或至少95%同源的轻链可变区的抗体。SEQ ID No. 1 Met Glu Leu lie Met Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val HisSer Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro GlyAla Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr AspTyr Asn lie His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Trp
lieGlyTyrlieAlaProTyrSerGlyGlyThrGly Tyr Asn Gln Glu
PheLysAsnArgAlaThrLeuThrValAspLysSer Ser Ser ThrAla
TyrMetGluLeuArgSerLeuThrSerAspAspSerAlaValTyrTyr
CysAlaArgArgAspArgPheProTyrTyrPheAspTyrTrpGlyGln
ThrThrLeuArgValSerSerValSerGlySer
SEQID No.2
MetGlyPheLysMetGluSerGlnlieGlnValPheValTyrMetLeu
LeuTrpLeuSerGlyValAspGlyAsplieValMetlieGlnSerGln
LysPheValSerThrSerValGlyAspArgValAsnlieThrCysLys
AlaSerGlnAsnValGlySerAsnValAlaTrpLeuGlnGlnLysPro
GlyGlnSerProLysThrLeulieTyrSerAlaSerTyrArgSerGly
ArgValProAspArgPheThrGlySerGlySerGlyThrAsPPhelie
LeuThrlieThrThrValGlnSerGluAspLeuAlaGluTyrPheCys
GlnGlnPheAsnArgSerProLeuThrPheGlySerGlyThrLysLeu
GluLeuLysArgAlaAspAlaAlaProThrValSerliePheProPro
SerSerLysGlyGluPhe
可用于本发明的可选的示例性抗体是包括如SEQ ID No.3中所描绘的重
区的氨基酸序列或如SEQ ID No. :4中所描绘的轻链可变区的氨基酸序列的抗体。其它示例性抗体包括来源于包括如SEQ ID No. :3中所描绘的重链可变区或如SEQ ID No. :4中所描绘的轻链可变区的氨基酸序列的抗体的抗体。又一些其它示例性抗体包括与包括如SEQ ID No. :3中所描绘的重链可变区或如SEQ ID No. :4中所描绘的轻链可变区的氨基酸序列的抗体具有相同特异性和/或结合相同的表位的抗体。又一些其它示例性抗体包括含与 SEQ ID No. :3中所描绘的序列至少70%、至少80%、至少90%或至少95%同源的重链可变区的抗体。又一些其它示例性抗体包括含与SEQ ID No. :4中所描绘的序列至少70%、 至少80%、至少90%或至少95%同源的轻链可变区的抗体。SEQ ID NO. 3 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVSGIENKYAGGATYYAASVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGFGTDFffGQGTLVTVSSSEQ IDNo. 4DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGKKYAYWYQQKPGQAPVLVIYKKRPSGIPERFSGSNSGNTAT LTISGTQAEDEADYYCSAffGDKGMVFGGGTKLTVLGQ可用于本发明的可选的示例性抗体是包括选自以下的H-CDR3序列的抗体Ser Gly Leu lie Phe Asp Tyr Trp Leu Asp1510(SEQ ID NO. 5)，Ser Gly Leu lie lie Asp Ala Leu Ser Pro1510(SEQ ID NO. 6)，Thr Ser Leu Met Ser lie Tyr Phe Asp Tyr
1510(SEQ ID NO. 7)，Ser Gly Leu Leu Phe Leu Tyr Phe Asp Tyr1510(SEQ ID NO. 8)，Ser Gly Leu lie Asn Leu Gly Met His Pro1510(SEQ ID NO. 9)，Ser Gly Leu lie Phe Asp Ala Leu Arg Asp1510(SEQ ID NO. 10)，Ser Gly Leu lie Phe Asp Lys Leu Thr Ser1510(SEQ ID NO. 11)，Ser Gly Leu lie Asn Leu His Phe Asp Thr1510(SEQ ID NO. 12)，Ser Thr His Phe Ser Ala Tyr Phe Asp Tyr1510(SEQ ID NO. 13)，Ser Gly Leu lie Met Asp Lys Leu Asp Asn1510(SEQ ID NO. 14)，Ser Gly Leu lie lie Asp Asn Leu Asn Pro1510(SEQ ID NO. 15)，禾ロSer Gly Leu lie Ala Val Tyr phe Asp Tyr1510(SEQ ID NO. 16).优选地，包括选自SEQ ID NO. 5-16中任ー个的H-⑶R3序列的抗体另外包括以下 的H-CDRl序列Asp Tyr Leu Leu His15(SEQ ID NO. 16),和/或以下的H-CDR2序列Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gin151015GlyArg Asn lie Leu Asn 10
(SEQ ID NO. 19)，
0118](SEQ ID NO. 17)，
0119]和/或以下的L-⑶Rl序列
0120]Arg Ala Ser Gln Asn Ile
0121]15
0122](SEQ ID NO. 18)，
0123]和/或以下的L-⑶R2序列
0124]Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser
0125]15
0126]
0127]和/或以下的L-⑶R3序列
0128]Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Ars Thr
0129]15
0130](SEQ ID NO. 20).
0131]可用于本发明的可选的示例性抗体是包括以下的L-CDRl序列的抗体
0132]Arg Ala Ser His Arg Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala
0133]1510(SEQ
0134]ID Ν0· 21)，
0135]和/或以下的L-⑶R2序列
0136]Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr
0137]15
0138]和/或以下的L-CDR3序列
0139]Gln Gln Tyr Ala Ser Ser Pro
0140]15
0141]和/或以下的H-⑶Rl序列
0142]Gly Tyr lie Phe Pro Thr Phe Ala
0143]15
0144](SEQ ID NO. 24),
0145]和/或以下的H-⑶R2序列
0146]Ser lie Asn Thr Ala Ser Gly Lys
0147]15
0148](SEQ ID N0. 25)，
0149]和/或以下的H-⑶R3序列
0150]Asp Arg Phe Gln Asn lie Met Ala
0151]15
0152](SEQ ID NO. 26).
0153]优选地所述抗体包括SEQ ID NO. 21-26的所有CRD。
0154]GM-CSF受体是促红细胞生成素(haematopoietin)受体超家族的成员。它是异二聚体的，由α亚基和β亚基组成。α亚基对GM-CSF是高度特异性的，而β亚基是与其它细胞因子受体包括IL3和IL5共有的。这反映在β受体亚基的组织分布较广泛。α亚
(SEQ ID Ν0. 22)，
Val Thr
(SEQ ID N0. 23)，
Leu His 10
Thr Lys Phe Ser Thr Lys Phe Gln 1015
Thr lie Leu Asp Val 10基，GM-CSFR α，主要表达于骨髓细胞和非促红细胞生成素细胞，比如嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜曙红粒细胞、树突细胞、内皮细胞和呼吸道上皮细胞。全长GM-CSFR α是400个氨基酸的I型膜糖蛋白，属于I型细胞因子受体家族，由22个氨基酸的信号肽(位置1-22)、 298个氨基酸的胞外结构域(位置23-320)、位置321-345的跨膜结构域和短的55个氨基酸的胞内结构域组成。信号肽被裂解以提供GM-CSFRa的成熟形式，为378个氨基酸的蛋白。人类和鼠GM-CSFRa的cDNA克隆是可获得的，并且在蛋白水平，受体亚基具有36%的同一性。GM-CSF能够以相对低的亲和力与单独α亚基结合(Kd 1_5ηΜ)，但根本不结合单独β亚基。然而，α亚基和β亚基二者的存在导致高亲和力配体-受体复合体(Kd >> IOOpM)。GM-CSF信号传导如下发生通过初始与GM-CSFRa链结合，然后与较大亚基即共有的β链交联产生高亲和力相互作用，这将JAK-STAT途径磷酸化。
对GM-CSF特异性的任何抗体可用于本发明。示例性抗体包括含SEQ ID No. 27-45中任一个中所描绘的H-CDR3序列的氨基酸序列的抗体。其它示例性抗体包括来源于包括SEQ ID No. :27-45中任一个中所描绘的H-⑶R3序列的氨基酸序列的抗体的抗体。 又一些其它示例性抗体包括与包括SEQ ID No. :27-45中任一个中所描绘的H-⑶R3序列的氨基酸序列的抗体具有相同的特异性和/或结合相同表位的抗体。又一些其它示例性抗体包括含与SEQ ID No. :27-45中任一个中所描绘的H-⑶R3序列至少70%、至少80%、至少 90%或至少95%同源的H-⑶R3序列的抗体。
0156]SEQID No 27 0157]ValGly Ser PheSerGly lie AlaTyrArgPro0158]5100159]SEQID No 28 0160]ValGly Ser PheSerGly Pro AlaLeuArgPro0161]5100162]SEQID No 29 0163]ValGly Ser PheSerPro Pro ThrTyrGlyTyr0164]5100165]SEQID No 30 0166]<400>450167]ValGly Ser PheSerGly Tyr ProTyrArgPro0168]5100169]SEQID No 31 0170]ValGly Ser PheSerPro Leu ThrLeuGlyLeu0171]5100172]SEQID No 32 0173]ValGly Ser PheSerGly Pro ValTyrGlyLeu0174]5100175]SEQID No 33 0176]ValGly Ser PheSerPro Pro AlaTyrArgPro0177]510SEQ ID No 34 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 35 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 36 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 37 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 38 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 39 Leu Gly Ser Val
SEQ ID No 40 Ala Gly Ser Ile
SEQ ID No 41 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 42 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 43 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 44 Val Gly Ser Val
SEQ ID No 45 Val Gly Ser Phe
Ser 5
Ser 5
Ser 5
Ser 5
Ser 5
Thr 5
Pro 5
Ser 5
Ser 5
Ser 5
Ser 5
Ser 5
Pro Val Thr Tyr
Gly Leu Ala Tyr
Pro lie Thr Tyr
Gly Trp Ala Phe
Gly Trp Ala Phe
Ala Trp Ala Phe
Gly 10
Leu
Arg Pro 10
Gly 10
Asp 10
Asp 10
Asp 10
Leu
Tyr
Tyr
Tyr
Gly Trp Ala Phe Asp Tyr 10
Pro Leu Thr Met
Pro Leu Thr Met
Gly Pro Ala Leu
Arg lie Thr Tyr
Gly 10
Gly 10
His 10
Gly 10
Leu
Leu
Leu
Phe
Pro Leu Thr Leu Gly Leu 10
可用于本发明的对GM-CSF特异性的另外的抗体包括含SEQ ID No. 46-56中任一项所描绘的H-⑶R3序列的氨基酸序列的抗体。其它示例性抗体包括来源于包括SEQ ID No. 46-56中任一项所描绘的H-⑶R3序列的氨基酸序列的抗体的抗体。又一些其它示例
12性抗体包括与包括SEQ ID No. 46-56中任一项所描绘的H-⑶R3序列的氨基酸序列的抗体具有相同的特异性和/或结合相同表位的抗体。又一些其它示例性抗体包括含与SEQ ID No. 46-56中任一项所描绘的H-⑶R3序列至少70%、至少80%、至少90%或至少95%同源的H-⑶R3序列的抗体。SEQ ID No 46 EGGYSYGYFDYSEQ ID No 47 DKffLDGFDYSEQ ID No 48 DRffLDAFDISEQ ID No 49 APYDffTFDYSEQ ID No 50 DRffLDAFEISEQ ID No 51 QRYYYSMDVSEQ ID No 52 RPffELPFDYSEQ ID No 53 NGDYVFTYFDYSEQ ID No 54 FGYFGYYFDYSEQ ID No 55 DPYTSGFDYSEQ ID No 56 EDTAMDYFDY本发明的组合物可用于治疗性或预防性应用。因此本发明包括含有发明性抗体 (或功能性抗体片段)和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。在一个相关的方面， 本发明提供了用于治疗多发性硬化的方法。所述方法包括向需要该施用的受治疗者施用有效量的含有如本文所描述或考虑的发明性抗体的药物组合物。在某些方面，本发明提供了用于在受治疗者中治疗多发性硬化的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用GM-CSF拮抗物的步骤。在这一上下文中使用的“受治疗者”是指任何哺乳动物，包括啮齿动物诸如小鼠或大鼠、和灵长类诸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、猕猴(Macaca mulatta)或人类(Homo sapiens)。优选地受治疗者是灵长类，最优选地是人类。在某些方面，本发明提供了用于治疗多发性硬化的方法，所述方法包括向受治疗者施用GM-CSF拮抗物的步骤，其中所述GM-CSF拮抗物能够以低于约ΙΟΟηΜ，更优选地为低于约60nM，且进一步更优选地为低于约30nM的亲和力结合GM-CSF。进一步优选地是以低于约ΙΟηΜ，且更优选地为低于约3nM的亲和力结合GM-CSF的抗体。
在某些方面，本发明提供了用于治疗多发性硬化的方法，所述方法包括向受治疗者施用GM-CSF拮抗物的步骤，其中所述GM-CSF拮抗物与抗体竞争结合GM-CSF，其中所述抗体的重链包括SEQ ID No. :3的氨基酸序列。在可选的方面，本发明提供了用于治疗多发性硬化的方法，所述方法包括向受治疗者施用GM-CSF拮抗物的步骤，其中所述GM-CSF拮抗物与抗体竞争结合GM-CSF，其中所述对GM-CSF特异性的抗体的轻链包括SEQ ID No. :4的氨基酸序列。在某些方面，本发明提供了用于治疗多发性硬化的方法，所述方法包括向受治疗者施用GM-CSF拮抗物的步骤，其中所述GM-CSF拮抗物是对GM-CSF特异性的抗体且其中所述对GM-CSF特异性的抗体与大鼠和/或猕猴(Hiacaca)GM-CSF交叉反应，如通过溶液平衡滴定(SET)和/或TFl增殖测定所测定的。在某些方面，本发明提供了包括能够拮抗GM-CSF在多发性硬化中的病生理作用的GM-CSF拮抗物的组合物，所述组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。本发明的抗-GM-CSF抗体可拮抗GM-CSF在多发性硬化中的任何作用。在某些方面，本发明提供了包括能够减少髓磷脂层的脱髓鞘的GM-CSF拮抗物的组合物，所述组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。在某些方面，本发明提供了包括能够减少炎性细胞流入脊髓的GM-CSF拮抗物的组合物，所述组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。在某些方面，本发明提供了用于在受治疗者中治疗或预防多发性硬化的方法，所述方法包括向受治疗者施用有效量的GM-CSF的拮抗物的步骤，其中所述施用延迟了多发性硬化的发病。在另一方面，本发明提供了在受治疗者中预防多发性硬化的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用GM-CSF拮抗物。该上下文所用的“预防”指目的为预防疾病的发病或延迟疾病的发病的方法。在某些方面，本发明提供了用于在受治疗者中治疗或预防多发性硬化的方法，所述方法包括向受治疗者施用有效量的GM-CSF的拮抗物的步骤，其中所述施用降低了 T细胞的增殖。在某些方面，本发明提供了用于在受治疗者中治疗或预防多发性硬化的方法，所述方法包括向受治疗者施用有效量的GM-CSF拮抗物，其中所述施用减少了 T细胞的IL17 释放。用来测量和定量T细胞增殖和IL17的释放的测定是本领域中已知的。在某些方面，本发明提供了包括在多发性硬化的治疗中有用的GM-CSF拮抗物的组合物，所述组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。在其它方面，本发明提供了 GM-CSF拮抗物用于制备治疗多发性硬化的药物的用途。在其它方面，本发明提供了用于治疗多发性硬化的GM-CSF拮抗物。在特定的方面，本发明的GM-CSF拮抗物是皮下施用的。在其它方面，本发明的 GM-CSF拮抗物是脊柱内施用的。当皮下施用或脊柱内施用时，GM-CSF拮抗物可以是对多发性硬化的治疗特别有效的。本发明的组合物优选地是药物组合物，所述药物组合物包括GM-CSF拮抗物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，以用于治疗多发性硬化。所述载体、稀释剂和赋形剂是本领域中已知的，且技术人员将发现最适合利用本发明的GM-CSF拮抗物治疗受治疗者的制剂和施用途径。在某些方面，本发明提供了用于在受治疗者中治疗或预防多发性硬化的方法，所述方法包括向受治疗者施用有效量的GM-CSF的拮抗物的步骤。在某些方面所述受治疗者是人类。在可选的方面所述受治疗者是啮齿动物，比如大鼠或小鼠。在某些方面，所述GM-CSF的拮抗物是对GM-CSF特异性的抗体。在特定的方面，所述对GM-CSF特异性的抗体的可变重链包括SEQ ID No. :3的氨基酸序列。在其它特定的方面，所述对GM-CSF特异性的抗体的可变轻链包括SEQ ID No. :4的氨基酸序列。在某些方面，所述GM-CSF的拮抗物是对GM-CSF受体特异性的抗体。在某些方面，所述GM-CSF的拮抗物的施用减少了髓磷脂层的脱髓鞘。在其它方面，所述GM-CSF的拮抗物的施用减少了炎性细胞流入脊柱。在又一些其它方面，所述GM-CSF的拮抗物的施用减少了 T细胞的增殖。在又一些其它方面，所述GM-CSF的拮抗物的施用减少了 T细胞的IL17释放。在又一些其它方面，所述施用延迟了多发性硬化的发病。在某些方面，所述GM-CSF的拮抗物是皮下施用或脊柱内施用的。在某些方面，本发明提供了用于治疗或预防多发性硬化的GM-CSF的拮抗物。在某些方面，所述治疗或预防包括向受治疗者施用有效量的GM-CSF的拮抗物的步骤。在某些方面，所述受治疗者是人类。在可选的方面，所述受治疗者是啮齿动物，比如大鼠或小鼠。在某些方面，所述GM-CSF的拮抗物是对GM-CSF特异性的抗体。在某些方面，所述对GM-CSF特异性的抗体的可变重链包括SEQ ID No. :3的氨基酸序列。在某些方面，所述对GM-CSF特异性的抗体的可变轻链包括SEQ ID No. :4的氨基酸序列。在某些方面，所述GM-CSF的拮抗物是对GM-CSF受体特异性的抗体。在某些方面，利用所述GM-CSF的拮抗物进行的治疗或预防减少了髓磷脂层的脱髓鞘。在其它方面，利用所述GM-CSF的拮抗物进行的治疗或预防减少了炎性细胞流入脊柱。在其它方面，用所述GM-CSF的拮抗物的治疗或预防减少了 T细胞的增殖。在其它方面，用所述GM-CSF的拮抗物的治疗或预防减少了 T细胞的IL17释放。在其它方面，用所述GM-CSF的拮抗物的治疗或预防延迟了多发性硬化的发病。在某些方面，所述GM-CSF的拮抗物是皮下施用或脊柱内施用的。
实施例实施例1 本发明中所用的示例性抗体和动物MOR-GM在本发明中用作示例性的GM-CSF拮抗物。MOR-GM是完全人类GM-CSF-特异性抗体(W0 06/122797)。MOR-GM的重链可变区显示于SEQ ID No. :3中，轻链可变区显示于 SEQ ID No. 4 中。抗体22E9，一种抗小鼠GM-CSF抗体，曾用于其它实验中(AbD Serotec, Martiηsried/Germany ；Cat. No. 1023501)。
显然地，任何其它GM-CSF拮抗物，例如包括选自SEQ ID No. :1_45的氨基酸片段的任何抗体可根据本发明来使用。iffi Dark Agouti ^H, 7-8 MS (Harlan Laboratories, Inc. , Indianapolis/ IN)饲养于21 士3°C、40-70%的相对湿度和12小时光/暗循环的清洁的常规条件下。大鼠成对饲养且自由获取啮齿动物饲料(SSNIFF，Bio-Services，Hie Netherlands)。个体动物通过标记尾部来确认身份。在实验开始之前，将大鼠饲养4周的时间。在实验起始之前对大鼠进行随机分组。在实验开始时，大鼠为11-12周龄且具有200-250g的重量。实施例2 在MOG诱导的MS的EAE模型中GM-CSF拮抗物的治疗有效性为诱导实验性的自身免疫脑脊髓炎(EAE)，在尾部的背侧基底的两侧的两个位点中通过用在200 μ 1的弗氏不完全佐剂(IFA)和IOnM NaAc ρΗ3. 0的1 1混合物中乳化的15 μ g的重组髓磷脂-少突胶质细胞-糖蛋白(rMOG)进行皮内注射而使雄性DA大鼠免疫。为协助免疫，通过吸入含2-4%的异氟烷的氧气和队0的混合物而麻醉大鼠。与媒介物(PBQ处理相比较地和与用非特异性的/无关的同种型对照抗体 M0R-N0GM (50mg/kg)处理组相比较地检验测试化合物MOR-GM的腹膜内施用的效果。以3个剂量，即10mg/kg、20mg/kg和50mg/kg来检验利用化合物MOR-GM进行的预防性治疗。在第 7天、第10天、第14天、第17天和第21天施用化合物。并且，在疾病发病之后开始首次治疗的方案中检验化合物(50mg/kg)的效力。在该情况中，在第14天、第17天和第21天施用化合物。阳性对照组包括用从第9天开始每天腹膜内施用地塞米松(0.5mg/kg)处理的大鼠。每个实验组包括12只动物。在第17天和第21天(处理之前)和终点时从尾静脉采集血样品。每天测量每个大鼠的体重。利用以下的伤残评分系统每天对大鼠的EAE进行评估0 无疾病0. 5 尾局部麻痹或部分麻痹1 完全尾麻痹2 后肢无力或部分麻痹2. 5 如2 一样，但具有额外的前肢的受累3 后肢和/或机体的下部分的完全麻痹3. 5 如3 一样，但具有额外的前肢的受累4 死于 EAE因为EAE相关共病而需要被安乐死的大鼠在安乐死那天被指定为3. 5的值，且在整个监测期所有随后的天指定为4的评分。“最大临床评分”指实验期间每个大鼠的最高EAE评分。“累积评分”是在确定的时期中对于给定的大鼠的所有EAE评分的总和(曲线下面积)。计算整个随访期、第一疾病期(第0-15天)和复发期(第16天-结束)的累积评分。“发病日”指达到至少3的累积评分的3个连续日中的第一个。组织学分析将福尔马林固定的组织包埋在石蜡中并用苏木精/伊红对5pm的组织切片进行染色以能够对炎性细胞的浸润程度进行半定量，或用根据Kluver-Barrera的Luxol坚牢蓝染色以进行髓磷脂染色。以半定量的方式对来自脊髓的骶骨部分的三个非连续切片(间隔100 μ m)的炎性细胞的浸润和脱髓鞘的程度进行评价。利用如以下表中所描述的评分系统进行组织学分级。组织学分级以盲法方式进行。用于炎性细胞浸润入脊髓组织的半定量分级的组织学评分系统
权利要求
1.一种用于治疗或预防多发性硬化的GM-CSF的拮抗物。
2.如权利要求1所述的拮抗物，其中所述治疗或预防包括向受治疗者施用有效量的 GM-CSF的拮抗物的步骤。
3.如权利要求2所述的拮抗物，其中所述受治疗者是人类。
4.如权利要求2所述的拮抗物，其中所述受治疗者是啮齿动物，比如大鼠或小鼠。
5.如前述权利要求中任一项所述的拮抗物，其中所述拮抗物是对GM-CSF特异性的抗体。
6.如权利要求5所述的拮抗物，其中所述对GM-CSF特异性的抗体的可变重链包括SEQ ID No. 3的氨基酸序列。
7.如权利要求5或6所述的拮抗物，其中所述对GM-CSF特异性的抗体的可变轻链包括 SEQ ID No. 4的氨基酸序列。
8.如权利要求1-4中任一项所述的拮抗物，其中所述拮抗物是对GM-CSF受体特异性的抗体。
9.如前述权利要求中任一项所述的拮抗物，其中所述治疗或预防减少髓磷脂层的脱髓鞘。
10.如前述权利要求中任一项所述的拮抗物，其中所述治疗或预防减少炎性细胞流入脊髓。
11.如前述权利要求中任一项所述的拮抗物，其中所述治疗或预防减少T细胞的增殖。
12.如前述权利要求中任一项所述的拮抗物，其中所述治疗或预防减少T细胞释放 IL17。
13.如前述权利要求中任一项所述的拮抗物，其中所述治疗或预防延迟多发性硬化的发病。
14.如权利要求2-13中任一项所述的拮抗物，其中所述GM-CSF的拮抗物是皮下施用或脊柱内施用的。
全文摘要
本发明涉及用于治疗和/或预防多发性硬化(MS)的方法。GM-CSF的拮抗物，比如对GM-CSF或GM-CSF受体特异性的抗体，在多发性硬化的治疗和/或预防中是有效的。
文档编号C07K16/24GK102439039SQ201080019701
公开日2012年5月2日 申请日期2010年5月4日 优先权日2009年5月5日
发明者伊丽莎白·托马森-沃尔夫, 斯特凡·施泰德尔, 曼纽拉·迪尔, 罗伯特·佛里森, 马修·唐纳姆 申请人:莫佛塞斯公司