具有增加的钙亲和性及增强的生物发光的修饰的发光蛋白及其应用的制作方法

专利名称：：具有增加的钙亲和性及增强的生物发光的修饰的发光蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明提供了具有増加的钙亲和性以及增强的生物发光的修饰的发光蛋白(photoprotein),例如修饰的Clytin,生物发光本发明还提供了这些蛋白质在报告基因系统和基于细胞的測定中作为钙指示剂的应用。
背景技术：
：迄今为止已经从生物体分离了ー些据报道在与Ca2+反应时发光的发光蛋白，包括水母素(Aequorin)、Halistaurin、Obelin、Mnemiospin、Clytin和Berovin。通地,所有IU述发光蛋白的大小均相对较小，且被认为含有共同的有机底物(腔肠素(coelenterazine)及以复合物形式结合的分子氧。水母素是最广泛研究的Ca2+激活的发光蛋白，分离自水螅虫Aequoreavictoria.。在水母素的情况中，Ca2+的结合导致蛋白质构象变化,使所述蛋白质转变为酶，催化腔肠素被氧氧化，并发光(即Amax=470nm)。水母素已经用于检测特别是由G蛋白结合的受体(GPCR)介导的细胞中I丐流动(calciumflux),如Stablesetal.(Anal.Biochem.，252:115-126(1997))所述。此外，水母素介导的发光钙测定已经用于GPCR高通量筛选，如Ungrinetal.(Anal.Biochem.,272:34-42(1999))所述。此外，表达水母素的细胞也已经用于药物筛选測定，如美国专利No.6，872，538所述。尽管钙激活的发光蛋白如水母素用于检测例如由GPCR刺激的钙流动以及用于药物筛选，但是相对于由受体诱导的钙的细胞质浓度(例如0.IμM至0.2μM范围)，水母素对于钙的亲和性仍很低(即仅大约7μΜ)。此外，线粒体靶向的水母素在GPCR刺激后看起来产生更好的信号，钙亲和性受线粒体钙积累的异质性影响，水母素通常在线粒体中相对于细胞质较低量表达。相似地，其它钙激活的发光蛋白如Obelin和Clytin也已经被报道具有较低的钙亲和性和/或低水平的光发射。见例如InouyeandSahara,ProteinExpress.Purif.,53384-389(2007)；Bovolentaetal.,J.Biomol.Screen,12:694-704(2007)。发明概述本发明提供了至少部分修饰的发光蛋白，例如修饰形式的Clytin，其相对于本领域已知的野生型(wt)发光蛋白具有増加的细胞内钙亲和性和/或呈现出增强的生物发光，所述野生型发光蛋白如Wt-水母素和/或Wt-Clytin和/或wt_0belin。本发明进ー步提供了这种发光蛋白在基于细胞測定中检测钙流动(例如GPCR刺激的钙流动)的应用及其在药物输送中的应用。在本发明的一些实施方案中，提供了修饰的发光蛋白，其包含在Wt-Clytin的EFhandIII结构域包含至少ー个氨基酸修饰的氨基酸序列，所述wt-Clytin的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQIDNO:I所示氨基酸序列的发光蛋白相比呈现出増加的对细胞内钙的亲和性及增强的生物发光。在一些实施方案中，本发明的修饰的发光蛋白包含SEQIDNO:1所示氨基酸序列中至少第168位赖氨酸由除组氨酸、精氨酸和赖氨酸之外的氨基酸置换的氨基酸序列；其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQIDNO:1所示氨基酸序列的发光蛋白相比呈现出增加的对细胞内钙的亲和性及增强的生物发光。在一具体实施方案中，本发明的修饰的发光蛋白包含SEQIDNO:1所示氨基酸序列中至少第168位赖氨酸由天冬氨酸置换的氨基酸序列，;其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQIDNO:I所示氨基酸序列的发光蛋白及包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的发光蛋白相比均呈现出増加的对细胞内钙的亲和性及增强的生物发光。在一些实施方案中，本发明的修饰的发光蛋白与wt-Clytin和/或wt-水母素相比呈现出增加的对细胞内钙的亲和性。在一些实施方案中，修饰的发光蛋白对于细胞内钙的EC50值为500nM或更低，其中所述修饰的发光蛋白不包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列或者其变体。本发明涵盖的修饰的发光蛋白包括这样的发光蛋白，所述发光蛋白包含选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:9(K168D)、SEQIDNO:11(K168E)、SEQIDNO:15(K168G)、SEQIDNO:17(K168N)、SEQIDNO:19(K168Q)、SEQIDNO:21(K168S)、SEQIDNO:23(K168T)、SEQIDNO25(K168V)和SEQIDNO:27(K168Y)。在多种实施方案中，本发明涵盖的修饰的发光蛋白相对于包含SEQIDN0:1所不氨基酸序列的wt-Clytin呈现出增加的对细胞内钙的亲和性。在一些实施方案中，本发明的修饰的发光蛋白相对于包含SEQIDNO:1所示氨基酸序列的发光蛋白呈现出对细胞内丐的亲和性增加I.5%、或者2%、或者3%、或者4%、或者5%、或者10%、或者20%、或者25%、或者30%、或者40%、或者50%、或者60%、或者70%、或者80%、或者90%或者90%以上。此外，在一些实施方案中，本发明涵盖的修饰的发光蛋白相对于wt-Clytin呈现出增强的生物发光。在一些实施方案中，本发明的修饰的发光蛋白相对于包含SEQIDNO:I所示氨基酸序列的发光蛋白呈现出生物发光增加I.5%、或者2%、或者3%、或者4%、或者5%、或者10%、或者20%、或者25%、或者30%、或者40%、或者50%、或者60%、或者70%、或者80%、或者90%或者90%以上。本发明涵盖的各种发光蛋白相对于wt-Clytin和wt-水母素之一或这两者呈现出増加的对细胞内钙的亲和性。在一些实施方案中，本发明的一或多种发光蛋白呈现出的对细胞内钙的亲和性以及生物发光是在用编码所述修饰的发光蛋白的核酸分子转染的细胞中测量的。举例的细胞包括但不限于CHO细胞、HEK293T细胞、HeLa细胞、NIH3T3细胞和U-20S细胞。本发明还涵盖了编码本发明的发光蛋白的核酸分子以及包含这种核酸分子的载体。在进ー步的实施方案中，提供了用编码修饰的发光蛋白的核酸转染的哺乳动物细胞。在进ー步的实施方案中，提供了本发明涵盖的修饰的发光蛋白的使用方法。在一些实施方案中，提供了用于检测细胞中钙流动的体外方法。这种方法包括如下步骤a)提供表达如本文所述修饰的发光蛋白的细胞；b)使所述细胞与导致钙流动的物质接触；及c)检测所述发光蛋白的生物发光，其中所述生物发光表明存在钙流动。在进ー步的实施方案中，提供了用于筛选调节GPCR活性或者离子通道的化合物的方法，其中这种方法包括如下步骤a)提供表达如本文所述修饰的发光蛋白的细胞；b)使所述细胞与候选化合物接触'及c)检测发光蛋白的生物发光，其中发光蛋白生物发光在存在所述候选化合物的条件下的变化表明所述化合物调节GPCR活性或者离子通道活性。在多种实施方案中，钙流动是由调节GPCR活性或者离子通道活性导致的。举例的GPCR包括但不限于Hl组胺受体、抑胃多肽(GIP)受体、GLP-I受体、胰高血糖素受体、SlP2鞘氨醇I-磷酸盐受体、EP1前列腺素受体或者EP3前列腺素受体。举例的离子通道包括瞬时感受器电位Al(transientreceptorpotentialA1,TRPA1)。在一些实施方案中，修饰的发光蛋白包含线粒体信号序列。举例的线粒体信号序列是C0X8线粒体序列，如SEQIDNO8所示。附图简述图I描述了发光蛋白Clytin(SEQIDNO1),水母素(SEQIDNO:2)、Mitrocomin(SEQIDNO3)和Obelin(SEQIDNO4)的氨基酸序列比对。方框中是I丐结合的螺旋-转角-螺旋(HTH)/EFhand基序。序列相同性以星号(*)标示，序列相似性用冒号(:)标示。图2描绘了总结举例实验结果的图，所述实验在HEK293T细胞中使用瞬时共转染测定测量了野生型线粒体水母素(mt-水母素，其氨基酸序列如SEQIDN0:6所示)、野生型线粒体Clytin(mt-Clytin,其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示)、野生型线粒体Obelin(mt-0belin,其氨基酸序列如SEQIDNO:7所示)、修饰的线粒体Clytin(K168D)(mt-ClytinK168D，其氨基酸序列如SEQIDN0:10所示)以及修饰的线粒体Clytin(K168E)(mt_ClytinK168E，其氨基酸序列如SEQIDNO:12所示)对钙的亲和性。X轴表示钙浓度，Y轴表示在存在指定浓度钙条件下发出的生物发光与在存在I.5mMCaCl2条件下发出的生物发光之间标准化log比(log(L/Lmax))。图3描绘了总结举例实验结果的图，所述实验在U-20S细胞中测量受体介导的生物发光的变化，所述U-20S细胞用编码Hl组胺受体的cDNA及编码以下任一的cDNA瞬时共转染野生型线粒体水母素(mt-水母素，其氨基酸序列如SEQIDNO:6所示)、野生型线粒体Clytin(mt-Clytin,其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示)、野生型细胞质水母素(wt-水母素，其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示)、野生型细胞质Clyin(wt-Clytin，其氨基酸序列如SEQIDNO:I所示)、修饰的线粒体Clytin(mt-ClytinK168D，其氨基酸序列如SEQIDNO:10所示)或者修饰的细胞质Clytin(K168D，其氨基酸序列如SEQIDNO:9所示)。X轴表示施加于细胞的组胺的浓度，Y轴表示以相对发光单位(RLU)测量的生物发光。图4描绘了总结举例实验结果的图，所述实验比较了在U-20S细胞中受体介导的生物发光的变化与通过使用TritonX-100在存在ImMCaCl2条件下使细胞膜透化而诱导的生物发光的变化，所述U-20S细胞用编码Hl组胺受体的cDNA及编码以下任一的cDNA瞬时共转染野生型线粒体水母素(mt-水母素，其氨基酸序列如SEQIDNO:6所示)、野生型线粒体Clytin(mt-Clytin,其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示)、野生型细胞质水母素(wt-水母素，其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示)、野生型细胞质Clyin(wt-Clytin，其氨基酸序列如SEQIDNO:I所示)、修饰的线粒体Clytin(mt-ClytinK168D，其氨基酸序列如SEQIDNO:10所示)或者修饰的细胞质Clytin(K168D，其氨基酸序列如SEQIDNO:9所示)。Y轴表示以相对发光单位(RLU)测量的生物发光。转染进细胞中的特定发光蛋白在X轴上表示。图5描绘了总结举例实验结果的图，所述实验測量了在HEK293T细胞中的受体介导的生物发光的变化，所述HEK293T细胞用编码GIP、嵌合的杂交G蛋白的cDNA以及编码如下任一的cDNA瞬时共转染野生型线粒体水母素(mt-水母素，其氨基酸序列如SEQIDNO6所示)、野生型线粒体Clytin(mt-Clytin,其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示)、野生型线粒体Obelin(mt-Obelin,其氨基酸序列如SEQIDNO:7所示)、野生型细胞质水母素(wt-水母素，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)、野生型细胞质Clyin(wt-Clytin，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示)、野生型细胞质Obelin(wt_Obelin,其氨基酸序列如SEQIDN0:4所示)、修饰的线粒体Clytin(mt-ClytinK168D,其氨基酸序列如SEQIDNO:10所示)或者修饰的细胞质Clytin(ClytinK168D，其氨基酸序列如SEQIDNO:9所示)。X轴表示施加于所述细胞的GIP浓度，Y轴表示以相对发光单位(RLU)测量的生物发光。图6A-6E描绘了总结举例实验结果的图，所述实验測量了在用编码GLP-I(胰高血糖素样肽-I)受体、胰高血糖素受体、S1P2(鞘氨醇I-磷酸受体2)受体、EPl受体和EP3受体(后两个受体是前列腺素E2受体)、嵌合的杂交G蛋白(GLP-1受体、胰高血糖素受体和S1P2受体)以及修饰的细胞质Clytin(ClytinK168D，其氨基酸序列如SEQIDN0:9所示)的cDNA瞬时共转染的HEK293T细胞中的受体介导的生物发光变化。X轴表示施加于所述细胞的每种受体的相应配体的浓度，Y轴表示以相对发光单位(RLU)测量的生物发光。图7A-7F描绘了总结举例实验结果的图，所述实验測量在用编码GIP受体(抑胃肽受体)、CXCRl受体、CXCR4受体、胰高血糖素受体、GLP-I受体或者EPl受体、嵌合的杂交(promiscuous)G蛋白以及修饰的细胞质Clytin(ClytinK168D,其氨基酸序列如SEQIDNO9所示)的cDNA瞬时共转染的HEK293T细胞中的受体介导的生物发光变化。图7G描绘了总结举例实验结果的图，所述实验測量了在稳定表达D2受体、杂交G蛋白和修饰的细胞质Clytin(ClytinK168E，其氨基酸序列如SEQIDNO11所示)的CHO-Kl细胞中的受体介导的生物发光变化。图中的生物发光数据得自FLIPRTetraPlus高通量发光平板測量仪(MolecularDevices)。图8描绘了总结举例实验结果的图，所述实验测量了在HEK293细胞中的受体介导的生物发光变化，所述HEK293细胞稳定表达编码TRPAl阳离子通道的cDNA并用编码如下任一的cDNA瞬时共转染野生型线粒体水母素(mt-水母素，其氨基酸序列如SEQIDNO6所示)、野生型线粒体Clytin(mt-Clytin,其氨基酸序列如SEQIDNO5所示)、野生型细胞质水母素(wt-水母素，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)、野生型细胞质Clyin(wt-Clytin,其氨基酸序列如SEQIDNO1所示)、修饰的线粒体Clytin(mt-ClytinK168D，其氨基酸序列如SEQIDN0:10所示)或者修饰的细胞质Clytin(ClytinK168D，其氨基酸序列如SEQIDNO:9所示)。X轴表示施加于所述细胞的异硫氰酸烯丙酯(AITC)浓度，Y轴表示以相对发光单位(RLU)测量的生物发光。发明详述本发明提供了修饰的发光蛋白，如修饰的Clytin,其相对于wt-Clytin和/或Wt-水母素和/或Wt-Obelin具有増加的钙亲和性以及增强的生物发光，本发明还提供了其在报告基因系统和基于细胞的測定中作为钙指示剂的应用。I.定义为了更易于理解本发明，首先定义ー些术语。另外的定义在详细描述中阐述。术语“发光蛋白”或者“Ca2+激活的发光蛋白”在本文可互換使用，是指在与钙结合时发光的蛋白质。发光蛋白通常分离自海洋腔肠动物，在存在钙的条件下通过分子内反应发出可见光。已知发光蛋白的钙结合位点与在其它Ca2+结合蛋白如钙调蛋白(Calmodulin)中发现的那些位点相似，但是与其它Ca2+蛋白不同在于相对高含量的半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、脯氨酸和酪氨酸残基。举例的发光蛋白包括但不限于Obelin、Clytin、水母素、HalistauriruMnemiospin和Berovin,通常不包括萤光素酶(Luciferases)。所有这些发光蛋白均是脱辅基蛋白、咪唑并哌嗪生色团(imidazopyrazinechromophore)(腔肠素)和氧的复合物。在一些实施方案中，本发明提供了修饰的发光蛋白。在一具体实施方案中，本发明涉及修饰的Clytin。发光蛋白Clytin(SEQIDNO:I)、水母素(SEQIDNO:2)、Mitrocomin(SEQIDNO3)Obelin(SEQIDNO4)的氨基酸序列比对在图I中示出。术语“修饰的发光蛋白”或者“Ca2+激活的修饰的发光蛋白”在本文可互換使用，是指野生型发光蛋白的氨基酸序列变体(例如wt-Clytin的变体，wt-Clytin的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示)，其相对于wt-Clytin呈现出增加的对细胞内钙的亲和性以及增强的生物发光。在一些实施方案中，本发明的修饰的发光蛋白包括在wt-Clytin的螺旋-转角-螺旋结构域(HTH)(例如EFhandIII结构域)中的至少ー个氨基酸修饰，其中所述修饰的发光蛋白相对于wt-Clytin呈现出増加的对细胞内钙的亲和性以及增强的生物发光。在一些实施方案中，修饰的发光蛋白包含SEQIDNO1中至少第168位的赖氨酸残基由除组氨酸、精氨酸和赖氨酸之外的氨基酸置换的氨基酸序列，其中所述修饰的发光蛋白相对于包含SEQIDNO:1所示氨基酸序列的发光蛋白呈现出増加的对细胞内钙的亲和性以及增强的生物发光。在一些实施方案中，修饰的发光蛋白包含SEQIDNO:1中至少第168位赖氨酸残基由天冬氨酸置换的氨基酸序列，其中所述发光蛋白相对于包含SEQIDN0:1所示氨基酸序列的发光蛋白及包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的发光蛋白均呈现出増加的对细胞内钙的亲和性以及增强的生物发光。在举例的实施方案中，本发明的修饰的发光蛋白包含选自如下的氨基酸序列SEQIDNO:9(K168D)、SEQIDNO:11(K168E)、SEQIDNO:15(K168G)、SEQIDNO:17(K168N)、SEQIDNO:19(K168Q)、SEQIDNO:21(K168S)、SEQIDNO:23(K168T)、SEQIDNO25(K168V)和SEQIDN0:27(K168Y)。在一些实施方案中，本发明的修饰的发光蛋白进ー步包含线粒体靶向信号序列，例如C0X8线粒体标签，其氨基酸序列如SEQIDN0:8所示。EFhand结构域是在包括本发明涵盖的发光蛋白在内的钙结合蛋白质大家族中发现的ー种螺旋-转角-螺旋(HTH)结构结构域。其由两个彼此大致垂直的并通过一个短的环区域(通常大约12个氨基酸)连接的α螺旋组成，其通常结合钙离子。EFhand结构域是根据其在描述蛋白质小白蛋白(Parvalbumin)的传统命名法命名的，小白蛋白含有三个这种基序，且被认为通过其钙结合活性參与肌肉舒张。EFhand结构域也在信号蛋白钙调蛋白的姆个结构结构域以及在肌肉蛋白肌I丐蛋白-C(Troponin-C)中出现。术语“HTHIV结构域”或者“EFhandIII结构域”是指在Clytin中发现的四个螺旋-转角-螺旋结构域(三个是EFhand结构域)的第四个结构域以及三个EFhand结构域的第三个结构域，其包含第162至173位氨基酸残基，及包括氨基酸序列DLDNSGKLDVDE(SEQIDNO31)。所述Clytin的HTHIV结构域(或者EFhandIII结构域)据报道在生理相关浓度结合钙。不受任何理论限制，应理解本发明涵盖的氨基酸序列变体可以与其所衍生自的亲本氨基酸序列不同，可以在亲本氨基酸序列任何位置具有一或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，及包括在至少ー个HTH结构域中的至少ー个氨基酸取代(例如在Clytin第168位，该残基在EFhandIII结构域中)，其中所述变体呈现出增加的钙亲和性(例如在HEK293T细胞中细胞内钙的EC50值为500nM或更低)及增强的生物发光。在一些实施方案中，氨基酸序列变体与亲本序列(即SEQIDNO:I所示wt-Clytin)具有至少大约70%、或者至少大约80%、或者至少大约85%、或者至少大约90%、或者至少大约95%、或者至少大约96%、或者至少大约97%、或者至少大约98%、或者至少大约99%相同性，其中这种变体呈现出増加的对细胞内钙的亲和性及增强的生物发光，且这种变体不包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列或者其变体。术语“序列相同性”是指当例如通过程序GAP或者BESTFIT使用默认缺ロ权重(gapweight)进行最佳排列比对时，两个核苷酸或者氨基酸序列具有至少70%序列相同性、或者至少80%序列相同性、或者至少85%序列相同性、或者至少90%序列相同性、或者至少95%序列相同性或者更高相同性(例如99%序列相同性或更多)。对于序列比对，一般一个序列作为參照序列(例如亲本序列)，检测序列与其对比。当使用序列对比算法时，检测序列和參照序列均输入计算机中，如果需要随后指定配对物，指定序列算法程序參数。然后所述序列对比算法基于指定的程序參数计算所述检测序列与參照序列的序列相同性。可以进行最佳序列比对，例如通过Smith&ffaterman,Adv.AppI.Math.2482(1981)的局部同源性算法、Needleman&ffunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、Pearson&Lipman,Proc.Nat'I.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的搜索相似性方法及这些算法的计算机执行(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wis.),或者通过目测进行(见Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology)。适于确定序列相同性和序列相似性百分比的ー个算法实例是BLAST算法，在Altschuletal.，J.Mol.Biol.215=403(1990)中描述。进行BLAST分析的软件可通过NationalCenterforBiotechnologyInformation公开获得(通过国立卫生研究院NCBI互联网服务器公开获得)。一般可用默认參数进行所述序列对比，但是也可以使用指定參数。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认wordlength(W)=3,expectation(E)=10,BL0SUM62得分矩阵(见Henikoff&HenikofT，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))。使用MUSCLE(MultipleSequenceComparisonbyLogExpectation)算法(Edgar,Nucl.AcidsRes.32:1792(2004))进行多个序列比对的软件可通过欧洲生物信息学中心(EuropeanBioinformaticsInstitute)互联网服务器公开得自欧洲分子生物学实验室(EuropeanMolecularBiologyLaboratories;。在一个实施方案中，本发明的修饰的发光蛋白基于wt-Clytin的氨基酸序列(即SEQIDN0:1所示序列)，其中所述修饰的发光蛋白至少包含在第168位赖氨酸残基由除组氨酸、精氨酸和赖氨酸之外的氨基酸置換。在一些实施方案中，在SEQIDN0:1第168位的赖氨酸由选自以下的氨基酸置換天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺，其中修饰的发光蛋白相对于野生型发光蛋白(例如wt-Clytin和/或wt-水母素和/或Obelin)呈现出增加的钙亲和性(例如在HEK293T细胞中EC50为500nM或更低)及增强的生物发光。在一具体实施方案中，本发明的修饰的发光蛋白包含至少在第168位的赖氨酸由天冬氨酸置换的氨基酸序列，其中所述修饰的发光蛋白相对于wt-Clytin和wt-水母素呈现出増加的对细胞内钙的亲和性和增强的生物发光。在一些实施方案中，本发明的修饰的发光蛋白包含线粒体靶向序列(例如SEQIDNO:8所示)。在一些实施方案中，包含线粒体靶向序列的Clytin变体如SEQIDNO10,SEQIDNO12,SEQIDNO16,SEQIDNO18,SEQIDNO20,SEQIDNO22,SEQIDNO:24、SEQIDNO26和SEQIDNO28所示。置换SEQIDNO1第168位赖氨酸的合适氨基酸包括除了组氨酸、精氨酸和赖氨酸之外的任何天然发生的氨基酸。在一些实施方案中，置换在第168位赖氨酸的合适氨基酸包括选自如下的ー种天然发生的氨基酸天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺。本领域熟知的非天然发生的氨基酸和氨基酸衍生物也可用于置换在第168位的赖氨酸。如本文所用，术语“生物发光”、“发光”、“生物发光的”或者“发光的”涉及本发明的修饰的发光蛋白在与ニ价阳离子如Ca2+结合时发出可见光的能力。生物发光反应一般需要三个主要组分萤光素、萤光素酶和分子氧。然而，也可需要其它组分，包括阳离子(例如Ca2+和Mg2+)及辅因子(例如ATP、NAD(P)H)。萤光素酶是催化底物萤光素氧化的酶，并产生不稳定的中间体。当不稳定的中间体衰变至其基态时发光，产生氧化萤光素。生物发光可以使用本领域已知的及本文描述的ー或多种技术測量，包括但不限于使用光度计，如Victor2andLumilux(PERKINELMER)、FLIPR和FlexStation(MOLECULARDEVICES/MDSANALYTICAL)、Mithras(BERTHOLDTECHNOLOGIES)、FDSS(HAMAMATSUPHOTONICS)和PHERAstar(BMGLABTECH)。如本文所用，术语“增强的生物发光”是指修饰的发光蛋白的生物发光相对于野生型发光蛋白在存在Ca2+条件下的任何增加。例如，在举例的实施方案中，如在用增加细胞内Ca2+的物质刺激的活细胞中或者在暴露于含有不同浓度Ca2+的溶液的渗透化处理的细胞中所测量到的，修饰的发光蛋白如本文所述修饰的Clyin(例如在第168位具有氨基酸修饰的Clytin)的生物发光相对于wt-Clytin和/或wt-水母素的生物发光增强。修饰的发光蛋白在存在钙的条件下的生物发光相对于野生型发光蛋白(例如wt-Clytin和/或wt-水母素和/或Obelin)可增加大约I.5%、或者大约2%、或者大约3%、或者大约4%、或者大约5%、或者大约10%、或者大约20%、或者大约30%、或者大约40%、或者大约50%、或者大约60%、或者大约70%、或者大约80%、或者大约90%或者90%以上。在一些实施方案中，修饰的发光蛋白在存在钙的条件下的生物发光相对于野生型发光蛋白(例如wt-Clytin和/或wt-水母素)增加大约I.5倍、或者2倍、或者5倍、或者10倍、或者15倍、或者20倍、或者25倍、或者30倍、或者35倍、或者40倍、45倍、或者50倍、或者55倍、或者60倍、或者65倍、或者70倍、或者75倍、或者80倍、或者85倍、90倍，或者90倍以上。本领域熟知细胞内钙作为许多重要的生理学应答和病理生理学病症的调节剂。在大多数这些情况中，细胞外信号是由受体(例如GPCR和离子通道)接受的，并转变为细胞内Ca2+浓度的变化，其导致细胞内部Ca2+敏感性变化，包括但不限于调节Ca2+敏感性激酶、蛋白酶和转录因子的调节。因此，測量细胞内Ca2+浓度是理解细胞蛋白质的细胞内处理和调节所必需的。此外，Ca2+在细胞内信号传输中的关键作用使其成为药物研发中非常有吸引力的报告物。对于制药业重要的许多药物靶类别包括但不限于G蛋白结合的受体(GPCR)、离子通道和转运蛋白，当被激活时触发Ca2+调动(mobilization),称作“I丐流动”。细胞内Ca2+浓度或者钙流动的变化可以使用荧光染料(例如fura-2和indo-1)(见例如R.Y.Tsien,Nature290，527(1981)；R.Y.Tsien,T.Pozzan,T.J.Rink,J.Cell.Biol.94，325(1982))，Ca2+敏感性生物发光的水母蛋白水母素(例如E.B.RidgwayandC.C.Ashley,Biochem.Biophys.Res.Commun.29,229(1967))或者Ca2+敏感性微电极(例如C.C.AshleyandA.K.Campbe丄丄，Eds·,DetectionandMeasurementofFreeCa-incells(Elsevier,North-Holland,Amsterdam,1979))检测。在举例的实验中，细胞内I丐浓度可以通过在表达发光蛋白的哺乳动物细胞中加入腔肠素辅因子并检测光子发射而进行測量，光子发射是细胞内钙浓度的指示。本发明提供了修饰的发光蛋白，其相对于已知发光蛋白呈现出増加的对细胞内Ca2+的亲和性。因此，本发明的修饰的发光蛋白对于细胞内Ca2+浓度变化更敏感，并因此优于检测钙流动的已知蛋白质和试剂。由于所述修饰的发光蛋白与野生型发光蛋白相比呈现出细胞内钙浓度的变化更高的敏感度，因此所述修饰的发光蛋白非常适用于筛选GPCR或者离子通道活性调节物的測定中，特别适于筛选仅可导致细胞内钙浓度细微变化的调节物。如本文所用，术语“増加的对细胞内钙的亲和性”是指本发明的修饰的发光蛋白(例如在SEQIDNO:I所示序列第168位具有氨基酸取代的Clytin)相对于野生型发光蛋白(例如wt-水母素和/或wt-Clytin和/或wt_0belin)在对于细胞内I丐的亲和性的任何增加。例如，对细胞内I丐的亲和性相对于野生型发光蛋白(例如wt-Clytin和/或wt-水母素和wt-Obelin)可增加大约I.5%、或者大约2%、或者大约3%、或者大约3.5%、或者大约4%、或者大约5%、或者大约10%、或者大约20%、或者大约30%、或者大约40%、或者大约50%、或者大约60%、或者大约70%、或者大约80%、或者大约90%、或者大约95%、或者大约96%、或者大约97%、或者大约98%、或者大约99%或更多。在一些实施方案中，增加的对细胞内I丐的亲和性是指修饰的发光蛋白相对于野生型发光蛋白(例如wt-Clytin和/或wt-水母素和/或wt-Obelin)对于细胞内I丐的EC50值降低。发光蛋白对于I丐的亲和性可以使用本领域熟知的技术和测定法測量，包括但不限于本文所述技术和測定法。在举例的測定中，如在实施例中描述，钙亲和性是通过将腔肠素装载入发光蛋白表达细胞，随后測量在向所述细胞中加入不同浓度钙时由所述细胞发出的生物发光。如本文所用，术语“对细胞内钙的EC50值”是指激发发光信号(即生物发光)至IJ达在存在饱和量钙的条件下观测到的发光信号的50%水平的游离钙的浓度(即在此之上钙浓度进ー步增加不产生发光信号进ー步増加)。如本文所用，细胞内钙的EC50值是修饰的发光蛋白对细胞内钙的亲和性的測量值。EC50值可以使用本领域已知的及本文所述的ー或多种测定法測量，例如在下文实施例章节所述方法。在举例的实施方案中，本发明的修饰的发光蛋白在HEK293T细胞中对细胞内钙的EC50值为500nM或更低，其中修饰的发光蛋白不是wt-水母素或者其变体(例如不包含SEQIDNO2所示氨基酸序列或者其变体).在一些实施方案中，修饰的发光蛋白的细胞内钙的EC50值相对于野生型发光蛋白(例如wt-Clytin和/或wt-水母素和/或wt-Obelin)的EC50值降低大约I.5%、或者2%、或者3%、或者4%、或者5%、或者10%、或者15%、或者20%、或者25%、或者30%、或者50%、或者60%、或者70%、或者80%、或者90%、或者95%、或者95%以上。在一些实施方案中，本发明修饰的发光蛋白的EC50值相对于野生型发光蛋白(例如wt-Clytin和/或wt-水母素和/或wt-Obelin)的EC50值降低大约ΙΟηΜ、或者20nM、或者30nM、或者40nM、或者50nM、或者60nM、或者70nM、或者80nM、或者90nM、或者ΙΟΟηΜ、或者ΙΙΟηΜ、或者120nM、或者130nM、或者140nM、或者150nM、或者160nM、或者170nM、或者180nM、或者190nM、或者200nM、或者210nM、或者220nM、或者230nM、或者240nM、或者250nM、或者260nM、或者270nM、或者280nM、或者290nM、或者300nM、或者310nM、或者320nM、或者330nM、或者340nM、或者350nM、或者360nM、或者370nM、或者380nM、或者390nM、或者400nM、或者410nM、或者420nM、或者430nM、或者440nM、或者450nM、或者450nM以上。术语“GPCR”是指G蛋白偶联受体，其參与各种细胞信号转导途径。作为自然界最大和最多样的ー个蛋白质家族，G蛋白偶联受体(GPCR)超家族在多种生物和病理学进程如发育和増殖、神经调节、血管发生、代谢紊乱、炎症和病毒感染中起重要作用。其是目前药物学研究中最聚焦的蛋白质家族之一。GPCR超家族的所有成员共有相似的7跨膜结构域，但是可以基于共有的序列基序分类。例如，A类包括视紫红质样GPCR，B类包括促胰液素样GPCR，C类包括促代谢型谷氨酰胺/信息素GPCR、D类包括真菌信息素GPCR，及E类包括cAMPGPCR。另外的GPCR可以分类为Frizzled/SmoothenedGPCR、VomeronasalGPCR及一些仍未分类的GPCR。下表I列举了本文论述的核酸和氨基酸序列以及相应的序列标识符(SEQIDNO)。表I权利要求1.修饰的发光蛋白，其包含SEQIDNO:I所示氨基酸序列中至少第168位赖氨酸由除组氨酸、精氨酸和赖氨酸之外的氨基酸置换的氨基酸序列；其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQIDNO:1所示氨基酸序列的发光蛋白相比呈现出增强的对细胞内钙的亲和性以及增强的生物发光。2.修饰的发光蛋白，其包含SEQIDNO:1所示氨基酸序列中至少第168位赖氨酸由天冬氨酸置换的氨基酸序列；其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQIDNO:1所示氨基酸序列的发光蛋白及与包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的发光蛋白相比均呈现出增强的对细胞内钙的亲和性以及增强的生物发光。3.权利要求I的修饰的发光蛋白，其中所述修饰的发光蛋白对细胞内钙的EC50值为500nM或者更低，且其中所述修饰的发光蛋白不包含SEQIDNO2所示氨基酸序列或其变体或衍生物。4.权利要求I的修饰的发光蛋白，其包含选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:9(K168D),SEQIDNO:11(K168E)、SEQIDNO:15(K168G)、SEQIDNO:17(K168N)、SEQIDNO:19(K168Q)、SEQIDNO:21(K168S)、SEQIDNO:23(K168T)、SEQIDNO25(K168V)和SEQIDNO27(K168Y)。5.权利要求I的修饰的发光蛋白，其中所述氨基酸修饰位于所述发光蛋白的EFhandIII结构域内。6.权利要求2的修饰的发光蛋白，其中所述氨基酸修饰位于所述发光蛋白的EFhandIII结构域内。7.权利要求I的修饰的发光蛋白，其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQIDN0:1所示氨基酸序列的发光蛋白相比呈现出对细胞内钙的亲和性增加2%、或者3%、或者4%、或者5%、或者10%、或者20%、或者25%、或者30%、或者40%、或者50%、或者60%、或者70%、或者80%、或者90%、或者90%以上。8.权利要求2的修饰的发光蛋白，其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQIDNO:l所示氨基酸序列的发光蛋白相比呈现出对细胞内钙的亲和性增加2%、或者3%、或者4%、或者5%、或者10%、或者20%、或者25%、或者30%、或者40%、或者50%、或者60%、或者70%、或者80%、或者90%、或者90%以上。9.权利要求I的修饰的发光蛋白，其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQIDNO:l所示氨基酸序列的发光蛋白相比呈现出生物发光增加2%、或者3%、或者4%、或者5%、或者10%、或者20%、或者25%、或者30%、或者40%、或者50%、或者60%、或者70%、或者80%、或者90%、或者90%以上。10.权利要求2的修饰的发光蛋白，其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQIDNO:l所示氨基酸序列的发光蛋白相比呈现出生物发光增加2%、或者3%、或者4%、或者5%、或者10%、或者20%、或者25%、或者30%、或者40%、或者50%、或者60%、或者70%、或者80%、或者90%、或者90%以上。11.权利要求I的修饰的发光蛋白，其中所述对细胞内钙的亲和性及生物发光是在用编码权利要求I的修饰的发光蛋白的核酸分子转染的细胞中测量的。12.权利要求2的修饰的发光蛋白，其中所述对细胞内钙的亲和性及生物发光是在用编码权利要求I的修饰的发光蛋白的核酸分子转染的细胞中测量的。13.权利要求I的修饰的发光蛋白，其中所述对细胞内钙的亲和性及生物发光是在用编码权利要求2的修饰的发光蛋白的核酸分子转染的细胞中测量的。14.权利要求2的修饰的发光蛋白，其中所述对细胞内钙的亲和性及生物发光是在用编码权利要求2的修饰的发光蛋白的核酸分子转染的细胞中测量的。15.权利要求11的修饰的发光蛋白，其中所述细胞选自CHO细胞、HEK293T细胞、HeLa细胞、NIH3T3细胞和U-20S细胞。16.权利要求12的修饰的发光蛋白，其中所述细胞选自CHO细胞、HEK293T细胞、HeLa细胞、NIH3T3细胞和U-20S细胞。17.权利要求13的修饰的发光蛋白，其中所述细胞选自CHO细胞、HEK293T细胞、HeLa细胞、NIH3T3细胞和U-20S细胞。18.权利要求14的修饰的发光蛋白，其中所述细胞选自CHO细胞、HEK293T细胞、HeLa细胞、NIH3T3细胞和U-20S细胞。19.编码权利要求I的修饰的发光蛋白的核酸分子。20.编码权利要求2的修饰的发光蛋白的核酸分子。21.包含权利要求19的核酸分子的载体。22.包含权利要求20的核酸分子的载体。23.用权利要求21的载体转染的哺乳动物细胞。24.用权利要求22的载体转染的哺乳动物细胞。25.用于检测细胞中钙流动的体外方法，所述方法包括a)提供表达权利要求I的修饰的发光蛋白的细胞山)使所述细胞与导致钙流动的物质接触；以及c)检测所述发光蛋白的生物发光，其中所述生物发光表示存在钙流动。26.用于检测细胞中钙流动的体外方法，所述方法包括a)提供表达权利要求2的修饰的发光蛋白的细胞山)使所述细胞与导致钙流动的物质接触；以及c)检测所述发光蛋白的生物发光，其中所述生物发光表示存在钙流动。27.用于筛选调节GPCR或者离子通道活性的化合物的方法，所述方法包括a)提供表达权利要求I的修饰的发光蛋白的细胞山)使所述细胞与候选化合物接触；以及c)检测所述发光蛋白的生物发光，其中所述发光蛋白的生物发光在存在候选化合物条件下的变化表示所述化合物调节GPCR或者离子通道活性。28.用于筛选调节GPCR或者离子通道活性的化合物的方法，所述方法包括a)提供表达权利要求2的修饰的发光蛋白的细胞；b)使所述细胞与候选化合物接触；以及c)检测所述发光蛋白的生物发光，其中所述发光蛋白的生物发光在存在候选化合物条件下的变化表示所述化合物调节GPCR或者离子通道活性。29.权利要求25的方法，其中所述钙流动是由调节任何GPCR或者离子通道的活性导致。30.权利要求26的方法，其中所述钙流动是由调节任何GPCR或者离子通道的活性导致。31.权利要求27的方法，其中所述GPCR选自H1组胺受体、GIP受体、GLP-I受体、胰高血糖素受体、SlP2鞘氨醇I-磷酸受体、CXCRl趋化因子受体、CXCR4趋化因子受体、D2多巴胺受体、EP1受体、EP3前列腺素受体以及TRPAl阳离子通道。32.权利要求I的修饰的发光蛋白，其包含位于所述发光蛋白N末端的线粒体靶向序列。33.权利要求2的修饰的发光蛋白，其包含位于所述发光蛋白N末端的线粒体靶向序列。34.权利要求32的修饰的发光蛋白，其中所述线粒体靶向序列包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。35.权利要求33的修饰的发光蛋白，其中所述线粒体靶向序列包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。全文摘要本发明提供了具有增强的钙亲和性以及增强的生物发光的修饰的发光蛋白，例如修饰的Clytin，以及其在报告基因系统和基于细胞的测定中作为钙指示剂的应用。文档编号C07K14/435GK102666574SQ201080031857公开日2012年9月12日申请日期2010年7月6日优先权日2009年7月14日发明者L·阿姆斯特朗,M·徐,M·李申请人:Emd密理博公司