同型二聚体形式的plgf-1的制作方法

专利名称：同型二聚体形式的plgf-1的制作方法
技术领域：
本申请涉及PlGF的新型同型二聚体形式，其特征在于在其C-端区存在一个链间二硫键。本申请还涉及其生产和纯化方法、包含其的组合物及其作为药物或化妆品的用途。 本申请还涉及其它目的，将通过描述变得清楚。
背景技术：
胎盘生长因子(PlGF)是血管内皮生长因子(VEGF)家族的成员，并通过经由VEGF 受体-I的信号作为血管生成放大因子(amplifier)发挥作用，其主要由血管内皮细胞、单核细胞、巨卩遼细胞表达，也由人⑶34+骨髓重建干细胞(marrow repopulating stem cell) 表达。PlGF以至少四种剪接异构体PlGF-I至P1GF-4存在，其在大小和结合特性上不同。PlGF-I完整的肽和核苷酸序列在专利申请WO 92/06194中已有描述。详细来说，PlGF-I序列含有位于35、60、66、69、70、77、111、113和125的九个半胱氨酸残基，是形成链内-和链间-二硫键的潜在候选。半胱氨酸残基的上述编号对应着大肠杆菌(Escherichia coli)产生的重组P1GF-1,其包括天然P1GF-1中不存在的N-端甲硫氨酸(例如重组PlGF-I中的Cys35对应着天然PlGF-I-也作PlGF131中的Cys34)。通过以2.0 A分辨率的PlGF-I晶体结构分析已经证实了二硫键的存在(Iyer
S.等人，J. Biol. Chem. , 2001, 276,12153-12161) 0 根据 Iyer 等人，P1GF-1 描述为通过 Cys60-Cys69Cys69-Cys60 之间的两个链间二硫键以及 Cys35-Cys77, Cys66-Cys111 和 Cys70-Cys113 之间的三个链内二硫键共价结合的、以反平行排列组织的同型二聚体分子。通过晶体学分析证明的最有关的特征是存在半胱氨酸-结基序(cysteine-knot motif)。位点114之后，PlGF-I的C-端序列不显示有组织的结构，通过推测，还未确定有关的晶体结构。然而，同型二聚体中位点125的两个半胱氨酸残基之间存在的距离，致使这两个位点之间不可能存在链间共价键，因为这要求分子扭曲。同型二聚体形式已显示是PlGF的生物活性形式，而PlGF单体是无活性的。一些研究已证明PlGF-I的药理活性。例如，初步观察已显示出在对5-氟尿嘧啶-抑制小鼠中的早期和晚期骨髓造血作用上以及对干细胞/祖细胞动员至血流中，通过表达hPLGF (人胎盘生长因子)的腺病毒载体获得的积极作用。此外，已显示PlGF-I体内诱导血管生成以及体外刺激内皮细胞迁移和增殖 (Ziche M.等人，Lab. Invest. , 1997, 76, 517-531) PlGF蛋白质或基因治疗对缺血性疾病的有益作用已在例如W0-A-01/56593和US-2007/0027100中公开。缺血性疾病包括脑缺血、 急性心肌梗塞和下肢缺血。通过参考并入此处的专利申请W0-A-03/066676描述了从遗传修饰的细菌细胞中提取和纯化重组PlGF-I的方法。获得的产物，此后称作QHM1/2]P1GF-1，包括至少98.5%的二聚体和多聚体活性形式，至少70%的二聚体形式和I. 5%以内无活性的单体形式。根据本方法，PlGF-I通过重组DNA技术在E. coli中以包涵体表达。然后，通过在变性缓冲液中溶解包涵体来提取，在氧化还原作用系统存在下重新折叠，随后通过两步色谱程序(阴离子交换色谱，随后是反相色谱)纯化。尽管W0-A-03/066676中公开的方法获得的PlGF-I蛋白质是高纯活性形式，本发明人已发现这种产物在水溶液中不表现出最佳稳定性，有时显示出批-批的不均匀性(通过质谱、SDS-PAGE和IEF分析)。W0-A-03/097688公开了制备P1GF-1分子突变蛋白质的方法，其中P1GF-1分子位点125的半胱氨酸被不能形成二硫键的不同氨基酸所置换。上述突变蛋白质在水溶液中显示比野生-型PlGF-I更好的稳定性。本发明的范围是提供活性PLGF的新型稳定形式。

发明内容
本发明人生产了新型活性PLGF同型二聚体，其表现出出乎意料的重现性和稳定性的特性，及其制备的新方法。因此，本发明实施方式的目的是各单体蛋白质C-端区的两个半胱氨酸残基之间具有链间二硫键的PlGF的新型同型二聚体形式。除了 C-端链间键，所述二聚体可以具有一个或两个额外的链间键。在本目的的现实形式中，所述C-端二硫桥位于选自如下各单体中位置的两个Cys-残基之间重组PLGF-I的位点125、wtPLGFm的位点124、重组PLGF-2的位点 146、wtPLGF152 的位点 145、重组 PLGF-3 的位点 197、WtPLGF2tl3 的位点 196、重组 PLGF-4 的位点218、WtPlGF224的位点217。本目的具体的现实形式是重组PLGF-I 二聚体，其可能具有三个链间二硫键， 并称为[DIM3]PLGF-1。在本目的更具体的现实形式中，链间二硫键在残基CyS6°-CyS69、 Cys69-Cys60 和 Cys125-Cys125 之间。本发明另一实施方式的目的是用于制备所述PlGF同型二聚体的方法，包括步骤 获得PlGF单体蛋白质，通过将其孵育在缓冲液中，和去除任何还原剂(如果有的话)来氧化所述单体，从而获得期望的PLGF同型二聚体，以及任选地纯化所述PLGF同型二聚体。在本实施方式的现实形式中，通过在含有还原剂且pH从中性至弱碱性的缓冲液中孵育含有三个以内二硫链间桥的PlGF同型二聚体的步骤来获得PlGF单体。本发明的其它一些实施方式的目的是本发明PlGF同型二聚体用于医学治疗，比如促进血液干细胞在有此需求的受试者中的动员，治疗缺血性疾病、皮肤型硬皮病或进行性系统性硬皮病、皮肤溃疡、创伤、烧伤、术-后疗法、皮肤组织的自然或过早老化、以及任何病理性脱发。本发明其它一些实施方式的目的是含有本发明PLGF的药物组合物。本发明的其它目的将通过如下详细描述变得清楚。之前从未描述过在PlGF 二聚体分子中存在两个以上链间二硫键，其中之一在两个C-端半胱氨酸残基之间。从公开的以反平行排列而组织的二聚体蛋白质晶体结构来看， 这一发现尤其令人惊奇且出乎意料的。出于此原因，以至于形成二硫桥的两个C-端半胱氨酸间的距离将需要分子构象的夸张扭曲。因此，因为基于单体的不利构象第三个二硫桥的形成完全不可预测。然而，在实施例部分中，获得的产物的完整结构和功能特征，不仅证明其可行性， 还证明和具有三个以内二硫键的已知同型二聚体(即QHM1/2]P1GF-1)相比其更高的稳定性和更高的批-批重现性。此外，和已知二聚体相比，PlGF-I的新型形式出乎意料地展现出改善的生物活性。


图I 显示 QHM1/2] PlGF-I 的 RP-LC-MS 色谱图。图2 显示[DIM1/2] PlGF-I 的多价 MS 谱。图3显示QHM1/2] PlGF-I的去卷积质谱。图4 显示 QHM3] PlGF-I 的 RP-LC-MS 色谱图。图5显示QHM3] PlGF-I的多价MS谱。图6显示QHM3] PlGF-I的去卷积质谱。图7显示SDS-PAGE，其中道L对应丽标准，道I对应QHM1/2]P1GF-1以及道2对应[DIM3]PlGF-I ο图8是显示浓度逐渐提高的QHM1/2]PlGF-I或QHM3]P1GF-1趋化活性的图。图9 显示单独用 G-CSF 或 G-CSF 联合[DIM1/2]PlGF-I 或[DIM3]PlGF-I 获得的 12-天动员的作用。图10显示使用鸡绒毛膜尿囊膜血管形成测试(CAM)比较QHM3] PlGF-I、[DIM1/2] PLGF-1、以及作为阳性参考的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的血管生成活性。
具体实施例方式本发明的PLGF同型二聚体可以是任何已知PLGF类型，即PLGF-1、PLGF_2、PLGF_3 或 PLGF-4，之一。两个单体PlGF蛋白质的C-端半胱氨酸残基参与单体间的二硫键。表述“单体间”和“链间”认为是等价的且可互换。表述“二硫桥”和“二硫键”也认为是等价的且可互换。本发明表述“C-端”表示包括只有一个且最后一个半胱氨酸残基的单体C-端区。 参与链间键的这种残基，位于重组PLGF-I的位点125 (对应WtPlGF131中的位点124)、位于重组P1GF-2的位点146 (对应WtPlGF152中的位点145)、位于重组P1GF-3的位点197 (对应WtPlGF203中的位点196)以及位于重组P1GF-4的位点218 (对应WtPlGF224中的位点 217)。因此，本发明的同型二聚体包括一个位于在PLGF-I中的Cys125-Cys125、在PLGF-2中的 Cys146-Cys1'在 PLGF-3 中的 Cys197-Cys197 或在 PLGF-4 中的 Cys218-Cys218 的链间二硫键。本发明的一个示例性实施方式中，同型二聚体是具有三个链间二硫桥的分离的PlGF-I蛋白质同型二聚体。根据本发明的具体形式，桥在两个单体之间，优选在cys6°-cys69、cys69-cys6° 和Cys125-Cys125之间。这种新型P1GF-1蛋白质将在此后称为QHM3]P1GF-1。本发明术语“P1GF的单体”表示天然形式(w.t.)的单体蛋白质，即单体PlGFm、 单体PlGF152、单体PlGF2tl3或单体PlGF224，或修饰宿主细胞中表达的重组单体蛋白质。PlGF 单体，如果表达于原核细胞(比如细菌)，可以是非-糖基化的，如在W0-A-92/06194中或在W0-A-03/066676中公开的，或者如果表达于真核细胞(比如酵母或哺乳动物细胞)至少部
分糖基化。对于已知PLGF 二聚体而言，额外链间二硫键的存在赋予了本发明同型二聚体新颖且出乎意料的特性。例如，如实施例部分中更加详细说明的，和仅具有两个链间二硫键(包括Cys6tl和 Cys69)的已知[DIM1/2]PlGF-I相比，本发明的产物被赋予了更高稳定性并且基本上更加均匀。此外，新型同型二聚体在体外趋化分析中令人惊奇地显示出和QHM1/2]P1GF-1 相比更高的固有活性，这和改进的体内作用有关。本发明的另一方面是用于制备PlGF同型二聚体，例如0ΠΜ3]PlGF-I，的方法。这种方法包括如下步骤I.获得PlGF单体蛋白质，II.氧化或使所述单体氧化来获得PLGF同型二聚体，以及任选地III.纯化所述PLGF同型二聚体。步骤I :在步骤I中可以遵循多种不同程序用以获得单体P1GF，优选都保留链内二硫键的天然结构。根据本发明的一个实施方式，步骤I包括从C-端半胱氨酸残基之间缺少链间二硫桥的PlGF同型二聚体形式制备单体P1GF。在这种情况下步骤I包括如下步骤在具有从中性至碱性的pH(例如范围从7至9. 5)并且含有还原剂的缓冲液中孵育PlGF的同型二聚体形式，然后去除还原剂或使还原剂失活，根据如下描述的过程。当起始产物是PlGF-I的同型二聚体形式时，这将含有三个以内链间二硫键。 例如，可使用带有一个或两个二硫键的同型二聚体、或其混合物。优选起始产物是根据 W0-A-03/066676中所述方法获得的同型二聚体形式QHM1/2]PlGF-I。通常用于蛋白质化学的任何类型还原剂可用于方法的这一步骤。例如，三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP*HC1)、二硫苏糖醇(DTT)或同等试剂或其混合物。优选以如下摩尔比使用还原剂还原剂/PLGF蛋白质在5 1-100 I范围内，以及用所述还原剂的孵育进行包括10分钟至30小时之间的一段时间，优选30分钟至2小时之间。根据一个替代实施方式，步骤I包括通过重组DNA技术从含有PlGF-I分子的细菌宿主细胞获得的包涵体制备单体P1GF。所述包涵体优选根据W0-A-03/066676中所述方法获得。在这种情况下，步骤I包括如下步骤在具有从中性至碱性的pH(例如范围从7至9. 5，优选Tris缓冲液(pH8))并且含有变性剂(例如8M尿素或6M胍)，任选存在离液剂(比如乙二胺、精氨酸等)的缓冲液中孵育含有PlGF的包涵体；用还原剂还原如此获得的蛋白质溶液；通常用于蛋白质化学的任何类型还原剂可用于方法的这一步骤。例如，三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP*HC1)、二硫苏糖醇(DTT)或同等试剂或其混合物。优选地，使用还原剂。优选以如下摩尔比使用还原剂还原剂/PLGF蛋白质在5 1-100 I范围内，以及用所述还原剂的孵育进行包括10分钟至30小时之间的一段时间，优选30分钟至2小时之间。如此获得的单体可以是充分还原的形式或，优选，通过保留所有链内二硫键使其保留了其天然折叠。还原后，获得的单体不经任何预纯化可直接提交至步骤II氧化。在这种情况下，期望进行纯化步骤III以便获得纯化的最终同型二聚体P1GF。未纯化的PLGF单体表示，根据本发明，含有50%至90%单体的蛋白质混合物。或者，在氧化之前，获得的单体可提交至预纯化。纯化形式的单体PlGF-I表示，根据本发明，含有至少90 %、优选至少95 %以及更优选至少98 %或以上的PlGF单体的蛋白质混合物。当氧化步骤以纯化的单体进行时，例如PlGF-I单体，氧化一般产生纯化的同型二聚体，如0ΠΜ3]PlGF-I，其不再需要纯化步骤III。步骤II还原之后，通过用合适的技术去除还原剂和/或变性剂或者使还原剂和/或变性剂失活可使获得的单体提交至步骤II氧化，所述合适的技术，比如通过透析、通过适当稀释(例如，以10至100倍)、或通过任何其它方法，比如色谱。在第一个替代中，在未纯化的单体PlGF上进行氧化。通常，充分稀释溶液来防止还原剂和，当存在时，变性剂和半胱;氣酸残基的疏基反应，和/或(防止)干扰蛋白质折置。如果情况并非如此，进行步骤II之前，还原剂和，当存在时，变性剂必须从上述溶液中去除或作为替代使其对和游离半胱氨酸反应以及对干扰蛋白质折叠失活，如此后所述。适于纯化蛋白质材料的任何已知技术可用于方法的这一阶段。可用技术是例如过滤、包括离子交换色谱和/或凝胶过滤色谱的色谱纯化。众所周知，这些技术中某些仅引起小分子(例如还原剂)的排除，而其它还引起蛋白质杂质的排除。为了获得期望的同型二聚体PlGF蛋白质，通过在具有pH从中性到碱性值范围内的、不存在能够干扰单体PlGF半胱氨酸残基氧化的任何还原剂以及不存在能够干扰单体 PlGF半胱氨酸残基氧化的任何变性剂的缓冲液中孵育来氧化单体。如果PlGF是P1GF-1， 那么氧化产物，即同型二聚体，一般包括三个链间二硫键=S卩[DM3]P1GF-1。根据本发明“不存在还原剂”表示绝对没有还原剂或以不干扰PlGF单体半胱氨酸的巯基氧化的量或情况存在还原剂。根据本发明“不存在变性剂”表示绝对没有变性剂或以不干扰蛋白质折叠的量或情况存在变性剂。为了完整形成所有链间二硫键，包括C-端二硫键，优选单纯在大气环境下进行氧化。或者，可加入少量氧化剂使氧化更快。在后一种情况下，可轻易地通过单纯控制氧化剂的量避免形成蛋白质多聚物。氧化时间一般从12至48小时不等。在15°C至30°C之间的温度下，优选在室温下，进行反应。在其中发生氧化过程的缓冲液可以是具有PH中性至碱性的任何缓冲液，尤其从pH 7至pH 9. 5，例如pH 7. 2、pH 8. 3或pH 9。合适的缓冲液选自磷酸钠缓冲液、TRIS. HCl缓冲液、磷酸铵缓冲液或任何等价缓冲液。最终，单体PlGF以起始浓度从3至10mg/mL溶液的范围反应。
如果获得PLGF单体的步骤涉及还原剂的使用，这种试剂必须从氧化溶液中完全或以至少不干扰氧化的程度去除或失活。通过用具有从中性至碱性pH(例如7和9. 5之间)不含任何还原剂的缓冲液置换缓冲液进行还原剂的去除。或者，通过一个或更多色谱纯化步骤至少部分实现还原剂的去除，例如以任何顺序通过任何类型离子交换色谱、凝胶过滤色谱和疏水相互作用色谱。例如，一个阴离子-或阳离子-交换色谱随后是凝胶过滤色谱和/或疏水相互作用色谱。去除还原剂的色谱方式提供了其它优点，其使得从任何其它蛋白质材料中同时纯化或额外纯化PLGF单体蛋白质。最后，通过稀释蛋白质溶液和/或向所述溶液加入过量本领域已知的适合在蛋白质存在下使用的任何氧化剂使还原剂失活。步骤III:步骤III的目的是获得纯度水平不低于90%，优选至少95%和更优选至少98%的
最终同型二聚体。通常，步骤III的纯化由一步或更多步色谱纯化组成。优选，所述色谱纯化包括离子交换色谱，任选，随后体积(尺寸)排阻色谱法和/或疏水相互作用色谱。进行纯化步骤III的时机取决于步骤I获得的单体PlGF的纯度以及期望获得的最终产物的纯度。如实施例部分中所示，本发明的方法，当在PLGF-I上进行时，产生纯的、稳定且高活性的同型二聚体，其主要含有单体残基Cys6°_Cys69、Cys69-Cys60和Cys125-Cys125之间的三个链间二硫键。通过在人单核细胞上和动物模型BALB/c小鼠中进行趋化实验评价获得的产物中生物/药理活性的存在(见实施例9和10)。在上述两个实验中，QHM3]P1GF-1均和 [DIM1/2]PlGF-I 比较。获得的且显示于图8和9和10的结果不仅说明QHM3]P1GF-1表现出血管生成活性、趋化活性和细胞集落生成活性，还说明固有活性，其能够激活生物刺激，高于[DIM1/2] PlGF-I中观察到的。这些生物作用体现本领域对于野生型PLGF以及对于根据之前W0-A-2003/066676 和W0-A-2003/097688产生的重组PLGF已知的所有药理特性和治疗应用。本发明还涉及新型同型二聚体PlGF用于制备在有此需求的患者或受试者中促进血液干细胞动员的药物的用途。可能受益于本发明药物用途的患者的实例是经受化疗的患者。此外，具有血管生成活性的新型同型二聚体PlGF用于缺血性疾病的治疗性治疗， 比如心肌组织缺血、心肌梗塞、缺血性发作和慢性缺血性心肌疾病脑缺血和缺血性发作、肠缺血、四肢外周缺血。此外，其用于硬皮病的治疗、皮肤溃疡、创伤、烧伤、术-后疗法的治疗、皮肤组织的自然或过早老化的治疗以及自然或病理性脱发的治疗。鉴于其稳定性和纯度谱，本发明的二聚体非常适合制药业的制造。因此，本发明的另一目的涉及包括混合有至少一种可药用载体、赋形剂、稀释剂或佐剂的本发明同型二聚体PlGF的组合物。根据本发明可以使用适于全身或局部施用治疗性试剂的任何制剂。用于局部使用的制剂用于化妆品应用的领域。尤其是，可通过具有全身或局部作用的肠胃外途径、或通过主要具有局部作用的皮肤或黏膜上的局部途径施用新型同型二聚体。主要通过静脉内施用获得全身作用，通过腹腔内或肌肉内施用也是合适的。通过局部、或肠胃外肌肉内、皮下、关节内 (intrarticular)施用获得局部作用。同样地，可通过电转运或离子电泳局部施用PLGF-I 因子。考虑到活性产物的敏感性，较少建议因子的口服施用。用于肠胃外的组合物，全身性或局部使用，包括溶液、混悬液、脂质体混悬液、W/0 或0/W乳液。用于局部使用的组合物包括溶液、洗液、混悬液、脂质体混悬液、W/0或0/W乳液、凝胶、膏、霜、香膏和糊。在优选实施方式中，活性物质配制成冻干形式，混合合适的冻干添加剂，且备用与治疗可接受稀释剂复溶。有用的冻干添加剂是缓冲液、多糖、蔗糖、甘露醇、肌醇、多肽、氨基酸以及和活性物质兼容的任何其它添加剂。在本发明优选实施方式中，活性物质以冻干-后PLGFl/磷酸盐比在I : I至I : 2之间的量溶于磷酸盐缓冲液 (NaH2P04/H20-Na2HP04/2H20)中。适于肠胃外使用的稀释剂是水、生理溶液、糖溶液、水醇溶液、油性稀释剂、多元醇(像甘油、乙二醇或聚丙二醇)或和施用方法(在无菌、pH、离子强度和粘度方面)兼容的任何其它稀释剂。乳液或混悬液的情况时，组合物可含有通常用于药物制剂的合适的非离子、两性离子、阴离子或阳离子类型表面活性剂。油/水(0/W)亲水性乳液优选用于肠胃外全身性用途，而水/油(W/0)亲脂乳液优选用于局部(local or topic)用途。此外，本发明的组合物可含有任选的添加剂，像等渗剂(比如糖或多元醇)、缓冲液、螯合剂、抗氧化剂、抗菌剂。用于局部使用的组合物包括液体形式或半固体形式。液体形式包括溶液或洗液。 这可以是水、水醇(像乙醇/水)、或醇的，并且通过溶解冻干的物质获得。或者，通过添加已知的胶凝剂可将活性物质溶液配制成凝胶的形式，所述胶凝剂， 像淀粉、甘油、聚乙二醇或聚丙二醇，聚(甲基)丙烯酸酯/盐、异丙醇、羟基硬脂酸酯/盐。用于局部使用的组合物的其它类型是以香膏、糊、霜形式的乳液或混悬液。优选提供更快吸收的W/0乳液。亲脂赋形剂的实例是液体石蜡、无水羊毛脂、白凡士林、十六醇、 硬脂醇、植物油、矿物油。增加皮肤通透性的试剂，从而有助于吸收，可优选使用。这种试剂的实例是生理可接受添加剂像聚乙烯醇、聚乙二醇或二甲基亚砜(DMSO)。用于局部组合物的其它添加剂是等渗剂(像糖或多元醇)、缓冲液、螯合剂、抗氧化剂、抗菌剂、增稠剂、分散剂。相似地，可使用用于局部或全身性使用的缓释组合物，并且其包括聚合物像聚乳酸、聚(甲基)丙烯酸酯/盐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基纤维素以及本领域已知的其它物质。也可使用以基于如聚乳酸或其它可生物降解聚合物的皮下植入物形式的缓释组合物。尽管活性物质优选以冻干且因此稳定的形式包装，药物组合物(仍然)优选包括将同型二聚体稳定在活性二聚体形式的物质。实施例部分实施例I :确定QHM1/DM2]P1GF的特征根据W003/066676中所述程序获得的QHM1/2]P1GF-1样本，在NaH2PO4缓冲溶液
10(pH 7. 2)中以lmg/ml的浓度，在梯度条件下注射至C18分析柱，随后进行ESI-MS分析。分析条件配有MicroHPLC 系统的 ThermoFinnigan LTQ Ion Trap ；C18HPLC 柱；洗脱系统系统A :H20/CH3CN/HC00H 97 :2:1系统B :H20/CH3CN/HC00H 2 97 I洗脱梯度
t = O系统1/系统B 8020
t = 12min系统,/系统B 5050
t = 15min系统,/系统B 5050
t = 16min系统,/系统B 8020
获得的TIC色谱图显示于图I。色谱图显示QHM1/2]PlGF-I在rt = 7. 91min时的主峰。相关的多价和去卷积MS 谱(分别为图2和3)证明样本中存在多种不同种类的P1GF-1。图2，说明存在宽幅的蛋白质。图3详细显示种类QHM1/2]PlGF-I的确是分子量在29. 7-30. 5KDa范围以内的蛋白质的混合物。获得的数据证实MW29690的期望的二聚体蛋白质的存在，连同具有更高分子量的丰度更高的变体，其中的一些说明存在小的有机分子共价连接至分子的半胱氨酸残基。实施例2 :生产[DIM3] PlGF-I根据W0-A-03/066676, 2. 5mL 纯化的 DIM1/2 PlGF-1 (浓度 O. 9mg/mL, pH 7. 2)加载至PD-IO脱盐柱以便进行缓冲液置换。用pH 9的3mL 50mM NH4H2PO4缓冲液(蛋白质浓度O. 75mg/mL)洗脱样本。用12 μ L 二硫苏糖醇(DTT) (4mg/mL)还原2. 5mL获得的溶液，从而确立了为5/1的还原剂/蛋白质摩尔比(还原时间30min)。这一反应导致，链间二硫桥被还原，而链内_■硫桥保持完整，且犾得单体形式的P1GF。还原的蛋白质溶液(2. 5mL)然后加载至ro-ΙΟ柱以便去除还原剂，且用pH 9的3mL 50mM NH4H2PO4缓冲液洗脱。获得的洗脱物在室温下孵育18小时。确定产物的特征对上述方法获得的O. 62mg/ml [DIM3]PlGF-I样本进行LC-MS分析。详细来说，根据实施例I中[DIM1/2]PlGF-I所用的相同过程，以进行HPLC-MS分析的梯度条件，将样本注射至C18分析柱。此分析的结果显示于图4，并说明基本充分的再-氧化导致单一的纯化的蛋白质种类(见保留时间9. 88min时的尖色谱峰)。相关的多价谱(图5)还突出了仅有一种高纯蛋白质的绝对优势。这种单一种类鉴定为分子量29690± 15Da (理论MW = 29702)的PlGF-I 同型二聚体，进一步通过产物的去卷积质谱证实(图6)。总结HPLC-MS分析的结果，和QHM1/2]P1GF-1不同，产物QHM3]P1GF-1由占优势的种类组成。主要差异推测为a)-HPLC 分析“确定两个产物([DIM3] PlGF-I rt = 9. 88min)对[DIM1/2] PlGF-I rt = 7. 91min)的不同保留时间；b) - [DIM3] PlGF-I的HPLC-MS谱证实获得了具有分子量对应于理论重量(29700Da)的单一同型二聚体蛋白质种类。这和由异种蛋白质混合物(19. 7-30. 5kDa)组成的[DIM1/2]PlGF-I 相反。通过Ellman程序确认二聚体蛋白质存在链间二硫桥，即没有游离的半胱氨酸巯基。在[DIM3]P1GF-1中没有检测到游离的半胱氨酸巯基。这些结果进一步通过碘乙酰胺烷基化的DHM3]P1GF-1样本的质量分析验证。没有烷基化说明[DIM3] PlGF-I中完全没有游离的半胱氨酸巯基残基。最后，SDS-PAGE分析(图7)证实QHM3]P1GF-1的固有高纯度。使用自动芯片系统(Bio-Rad Experion)进行[DIM3]PlGF-I 以及[DIM1/2]PlGF-I 的 SDS-PAGE 分析。如图 7所示，[DIM3]PlGF-I明显比QHM1/2]P1GF-1更纯。没有检测到纯化操作之后产生的代表新产物的条带。还通过在非-还原条件下进行的胰酶肽图和随后的经典程序证实第三链间二硫桥的存在。总之，这些数据证实高纯蛋白质QHM3]PlGF-I中存在三个链间二硫桥。实施例3 [DIM3]PlGF-I 的生产根据W0-A-03/066676, 2. 5mL 纯化的 DIM1/2 PlGF-1 (浓度 4. 5mg/mL, pH 7. 2)用 20. 8μ L 二硫苏糖醇(DTT) (30. 7mg/mL)进行还原，获得为11/1的还原剂/蛋白质摩尔比 (还原时间120min)。此反应之后，链间二硫桥被还原，而链内二硫桥保持完整，从而获得单体形式的P1GF。还原的蛋白质溶液(2.5mL)然后加载至TO-IO柱以便去除还原剂，且用 pH 7. 2的3mL 50mM NaH2PO4缓冲液洗脱。获得的溶液在室温下孵育48小时。如实施例2中所述确定获得的产物的特征，获得同等的结果，证明形成含有三个链间二硫键的二聚体。实施例4 [DIM3]PlGF-I 的生产根据W0-A-03/066676, ImL 纯化的 DIM1/2 PlGF-1 (浓度 O. 9mg/mL, pH 7. 2)用 5 μ L 二硫苏糖醇(DTT) (30. 7mg/mL)进行还原，获得为33/1的还原剂/蛋白质摩尔比(还原时间60min)。此反应之后，链间二硫桥被还原，而链内二硫桥保持完整，获得单体形式的P1GF。进行缓冲液置换，以便从蛋白质溶液中去除所有氧化还原种类以及将缓冲液换为 pH 8. 3的IOOmM TRIS缓冲液。详细来说,通过离心过滤系统Amicon Microcon YM-10以
10.000的截留进行缓冲液置换。使用Eppendorf离心机在IOOOOg下进行5个过滤循环，此后MW在10. OOODa以下的98-99%分子被去除。获得的溶液在室温下孵育48小时。如实施例2中所述确定获得的产物的特征，获得同等的结果，证明形成含有三个链间二硫键的二聚体。实施例5 [DIM3]PlGF-I 的生产ImL 纯化的 DIM1/2 PlGF-1 (浓度 4. 5mg/mL，pH 7· 2)用 15 μ L 二硫苏糖醇(DTT) (61. 7mg/mL)进行还原,获得为40/1的还原剂/蛋白质摩尔比(还原时间60min)。此反应之后，链间二硫桥被还原，而链内二硫桥保持完整，获得单体形式的P1GF。进行缓冲液置换， 以便从蛋白质溶液中去除所有氧化还原种类以及将缓冲液换为pH 8. 3的IOOmM TRIS缓冲液。通过离心过滤系统Amicon Microcon YM-IO以10. 000的截留进行缓冲液置换。使用 Eppendorf离心机在IOOOOg下进行5个过滤循环，此后MW在10. OOODa以下的98-99%分子被去除。获得的溶液在室温下孵育48小时。
12
如实施例2中所述确定获得的产物的特征，获得同等的结果，证明形成含有三个链间二硫键的二聚体。实施例6 [DIM3]PlGF-I 的生产3mL 纯化的 DIM1/2 PlGF-1 (浓度 O. 9mg/mL，pH 7· 2)用 10 μ L 二硫苏糖醇(DTT) (13. 3mg/mL)进行还原，获得为10/1的还原剂/蛋白质摩尔比(还原时间100min)。此反应之后，链间二硫桥被还原，而链内二硫桥保持完整，从而获得单体形式的P1GF。2. 5mL还原的蛋白质溶液加载至ro-ΙΟ柱以便去除还原剂，以及进行缓冲液置换，用pH 9的3mL 50mM NH4H2PO4缓冲液洗脱样本。获得的溶液在室温下孵育24小时。如实施例2中所述确定获得的产物的特征，获得同等的结果，证明形成含有三个链间二硫键的二聚体。实施例7 :从包涵体中牛产HHM31P1GF-1足量的包涵体溶解于含有尿素8M和乙二胺20mM的Tris*HCl缓冲液50mM pH 8 中，来获得大概lmg/mL终浓度的PlGF-I。3mL上述溶液用IOyL 二硫苏糖醇(DTT) (13. 3mg/ mL)进行还原，获得为10/1的还原剂/蛋白质摩尔比(还原时间100min)。此反应之后， 获得可溶单体形式的PlGF-I。2. 5mL还原的蛋白质溶液在室温下由20(倍)体积的pH 9.2 的50mM NH4H2PO4透析16小时，以便去除还原剂和变性剂。如实施例2中所述确定获得的产物的特征，获得同等的结果，证明形成含有三个链间二硫键的二聚体。实施例8 :从包涵体中牛产HHM31P1GF-1足量的包涵体溶解于含有尿素8M和乙二胺20mM的Tris*HCl缓冲液50mM pH 8 中，来获得大概lmg/mL终浓度的PlGF-I。3mL上述溶液用IOyL 二硫苏糖醇(DTT) (13. 3mg/ mL)进行还原，获得为10/1的还原剂/蛋白质摩尔比(还原时间IOOmin)。此反应之后， 获得可溶单体形式的P1GF-1。2. 5mL还原的蛋白质溶液加载至PD-10柱以便去除还原剂和变性剂，以及进行缓冲液置换，且用PH 9. 2的3mL50mM NH4H2PO4缓冲液洗脱样本。获得的溶液再在室温下孵育24小时。如实施例2中所述确定获得的产物的特征，获得同等的结果，证明形成含有三个链间二硫键的二聚体。实施例9 :从包涵体中牛产HHM31P1GF-1根据W0-A-03/066676, 2. 5mL 纯化的 DIM1/2 PlGF-1 (浓度 4. 5mg/mL, pH 7. 2)用
20.8μ L 二硫苏糖醇(DTT) (30. 7mg/mL)进行还原，获得为11/1的还原剂/蛋白质摩尔比 (还原时间120min)。此反应之后，链间二硫桥被还原，而链内二硫桥保持完整，从而获得单体形式的P1GF。2. 5mL还原的蛋白质溶液加载至TO-IO柱以便去除还原剂以及，为了进行缓冲液置换，用PH 9的3mL 50mM NH4H2PO4洗脱样本。获得的溶液在室温下孵育24小时。如实施例2中所述确定获得的产物的特征，获得同等的结果，证明形成含有三个链间二硫键的二聚体。实施例10 :稳定件评价如实施例2至7任一项所述获得的QHM3]PlGF-I样本，以及DM1/2样本在室温下保存一个月。通过HPLC-UV (为了证实溶液中蛋白质浓度)和HPLC-MS (为了证实样本的真实性)分析样本。获得的结果显示[DIM3]P1GF-1在测试条件下稳定；实际上，既没有检测到蛋白质沉淀物也没有检测到结构上的修饰。与之相反，DIM1/2蛋白质样本中观察到部分沉淀。实施例U趋化分析用于测试QHM1/2]PLGF-I和QHM3]PlGF-I能力的细胞，从正常捐献者肝素血的血沉掠黄层获得(意大利 Centro Trasfusionale, Ospedale S. Salvatore, L’Aquila 赠送)。通过在Ficoll/Hipaque上离心获得单核细胞。如通过台盼蓝染色排除所测量的,所有实验中细胞活性> 95%。用48-孔微-趋化小室评价单核细胞迁移，如前所述(Bizzarri C.等人，Biochem. Pharm.，2001，虹，1429-1437)。简要地，29 μ I 对照培养基(PBS+0. 2 % BSA)或提高浓度的蛋白质溶液接种至趋化小室的下层。50 μ I细胞悬浮液(3X106PBMC/ml) 接种至上层。趋化小室的两层通过5-μ m聚碳酸酯滤器(膜)隔开。小室在371在5%0)2 氛围中孵育2小时。孵育结束时，移去滤器(膜)，混合，用Diff-Quik染色，样本编号之后在高放大倍数(100X)下计数五个油浸区域。在剂量-反应实验中比较QHM3] PlGF-I和QHM1/2] PLGF-I。如图8所示，结果显示趋化是浓度-依赖性的。实际上，尽管QHM3]PlGF-I和 [DIM1/2]PlGF-I (O. IlnM vs. O. 15nM)有相似的 EC5tl 值，在此体外分析中[DIM3]PlGF-I 明显有更高的固有活性。这种更高的活性说明和DHM1/2]P1GF-1相比产生生物趋化作用的更强能力。实施例12 :动员和集落-形成细胞分析。在动物模型(BALB/c小鼠)中获得QHM3]P1GF-1改进的生物活性的另一个且很重要的验证，所述模型允许模拟临床情况中的PBMC动员。动员操作由在6-至8-周龄雌性BALB/c小鼠(体重20_25g)中i. p.注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF ；10 μ g/天，第1-5天)组成。联合治疗由用rhG_CSF(10 μ g/ 天)加[DIM1/2]P1GF-1(5U0 或 15μ g/天)或[DIM3] PlGF-I (I. 7,3. 3 或 5 μ g/天)处理 5_天组成。用于联合研究的PlGF-I的剂量范围在预实验中确定。各实验进行至少三次， 且最后一次处理的2-3小时后处死动物。外周血收集至含有肝素的管中，且WBC计数后，用 PBS稀释,并通过Ficoll连续梯度离心分离单核细胞。如(Carlo-Stella C.等人,Cancer Res. ,2002,62,6152-6157)所述在甲基纤维素培养基中评价总集落形成细胞(CFC)。获得的结果显示QHM3]P1GF-1协同G-CSF增加广泛的循环造血祖细胞的频率和绝对数，包括定向分化的集落形成细胞(CFC)、高增殖潜能-CFC (HPP-CFC)、原始长期培养-启动细胞(LTC-IC)和辐射保护细胞。详细来说，图9显示G-CSF和QHM3]PlGF-I的组合对比G-CSF和QHM1/2]PlGF-I的组合对增加CFC/ml数目(描述造血活性的参数)的作用。如可观察的，和单独G-CSF的相比，和QHM1/2]或QHM3] PlGF-I的组合都在增加 CFC数目/ml方面强烈协同G-CSF作用至少三倍。然而，令人惊奇的是，和[DIM1/2]P1GF相比，在明显更低的QHM3]PlGF-I浓度获得这种作用(QHM3]PlGF-I/[DM1/2]PlGF-I剂量比I 3)。这清楚地说明，都联合G-CSFJP QHM1/2]PlGF-I相比，[DM3]PlGF-I更高的造血活性。实施例13 :评价QHM3] PlGF-I的血管生成活性
如Maglione等人已经描述的，用鸡绒毛膜尿囊膜血管形成测试(CAM)比较QHM3] PlGF-U [DIM1/2]PLGF-I因子以及作为阳性参考的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的血管生成活性(“II Farmaco”如上)。各种量的[DIM3]PlGF-I QHM1/2]P1GF-1 (O 至 3mcg/ 海绵之间)吸收到Imm3明胶海绵上，然后植入到CAM表面。12天后，切下接触样本的CAM 区，染色并使用称为“点计数”的形态测量技术定量血管生成作用。尤其是，在显微镜下在具有144个交叉点的网格上分析CAM切片，且结果以横截面上被毛细血管占据的交叉点的百分比表示(生成血管的面积百分比)。结果显示(图10) QHM3]PlGF-I和[DIM 1/2]PlGF-1 基本等同的血管生成活性。实施例14 :评价QHM3] PlGF-I对异丙肾上腺素诱导的心脏缺血的作用如Maglione等人(如上)关于野生型因子所述的，QHM3]P1GF-1对心脏缺血和梗塞的作用可以在动物模型中通过异丙肾上腺素诱导的缺血上进行评价。在兔子上进行实验,用160mcg/Kg[DIM3]PlGF-I的单次每日剂量或仅用等体积赋形剂处理,在第I至5天静脉内施用。在第I和2天皮下施用异丙肾上腺素。监测表示主要缺血损伤的心电图(ECG) 典型特征，比如T波倒置、S波变宽和Q波突起。以从O至6的点数等级评价处理和未处理的动物ECG中的改变，如下报道0，没有损伤；1，S波突起；2，T波突起；3，Τ波降臂的下移(expression) ;4，S波变宽；5，T波倒置；6，Q波突起。计算处理和未处理的动物5天测试期间通过ECG点确定的曲线下总面积。心电图谱强调的结果可以通过宏观和微观观察缺血组织来证实。所述检查显示，相对于仅用赋形剂处理的动物心组织中所观察到的，存在缓和严重程度的缺血损伤和组织学改变。实施例15 :评价QHM3] PlGF-I对新霉素-诱导的硬皮病的作用Yamamoto等人(如上)所述，可以在动物硬皮病模型上研究QHM3] PlGF-I对新霉素-诱导的硬皮病的作用。第一组C3H小鼠用博莱霉素(lOOmcg/ml)持续3周每天皮下注射来处理。其它三组C3H小鼠同样地如上处理，除了分别O. 1、1和10mcg/ml的PlGF-ICG突变蛋白质加入至每日注射中。处理三周之后，处死动物，且获取来自处理区域的皮肤样本， 并进行组织学分析。用[DIM3]P1GF-1治疗的作用突出体现在归因于博莱霉素诱导的皮肤硬化的组织学现象的减少，尤其是皮肤增厚和羟脯氨酸水平。
权利要求
1.一种分离的胎盘生长因子(PlGF)同型二聚体，其特征在于形成所述同型二聚体的两个单体蛋白质的C-端半胱氨酸残基参与单体间二硫键。
2.根据权利要求I所述的PlGF同型二聚体，其特征在于所述同型二聚体含有两个或三个单体间二硫桥。
3.根据权利要求I或2所述的PlGF同型二聚体，其特征在于所述C-端二硫桥在各单体中选自如下位置的两个Cys-残基之间重组PLGF-I的位点125、WtPLGF131的位点124、 重组PLGF-2的位点146、WtPLGF152的位点145、重组PLGF-3的位点197、WtPLGF203的位点 196、重组 PLGF-4 的位点 218、WtPlGF224 的位点 217。
4.根据权利要求I或3所述的PlGF同型二聚体，其特征在于PLGF是重组PLGF-I以及所述二硫桥在 Cys6ci-Cys69、Cys69-Cys60 和 Cys125-Cys125 之间。
5.一种用于制备根据权利要求I至4任一项所述PlGF同型二聚体的方法，包括如下步骤I.获得PlGF单体蛋白质；II.通过将其孵育在具有从中性到碱性PH的缓冲液中和/或以不干扰氧化的程度去除任何还原剂，如果有的话，或者使还原剂失活来氧化所述单体，从而获得所述PLGF同型二聚体；以及任选地III.纯化所述PLGF同型二聚体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述步骤I包括在含有还原剂且具有从中性至碱性PH的缓冲液中孵育含有三个以内链间二硫桥的PlGF同型二聚体，从而获得PLGF单体蛋白质。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述步骤I包括在含有变性剂的缓冲液中孵育含有PLGF的细菌包涵体，并用还原剂还原如此获得的蛋白质溶液。
8.根据权利要求5至7任一项所述的方法，其中所述还原剂选自三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP*HC1)和二硫苏糖醇(DTT)或其混合物。
9.根据权利要求5至8任一项所述的方法，其中以5 1-100 I范围以内的还原剂 /PLGF蛋白质摩尔比使用所述还原剂。
10.根据权利要求5至9任一项所述的方法，其中使用所述还原剂进行范围从10至30 小时时间的孵育。
11.根据权利要求50至10任一项所述的方法，还包括纯化所述PLGF单体蛋白质。
12.根据权利要求5所述的方法，其中通过在包括15°至30°C度之间的温度下在缓冲液中孵育来进行步骤II中的氧化。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述氧化进行包括12至48小时之间的时间。
14.根据权利要求5至13任一项所述的方法，其中通过稀释、透析或用不含任何还原剂的缓冲液置换所述缓冲液进行步骤II中去除还原剂或使还原剂失活。
15.根据权利要求5至13任一项所述的方法，其中通过纯化单体进行还原剂的去除。
16.根据权利要求5所述的方法，其中通过色谱纯化进行步骤III中所述纯化。
17.根据权利要求I至4任一项所述的分离的PlGF同型二聚体，用于医学治疗。
18.根据权利要求17所述的PlGF同型二聚体，用于在有此需求的受试者中促进血液干细胞的动员。
19.根据权利要求18所述的PlGF同型二聚体，其中所述受试者是经受化疗的患者。
20.根据权利要求17所述的PlGF同型二聚体，其中所述医学治疗是缺血性疾病的治疗。
21.根据权利要求20所述的PLGF同型二聚体，其中所述缺血性疾病是心肌组织缺血、 心肌梗塞、缺血性发作和慢性缺血性心肌疾病脑缺血和缺血性发作、肠缺血、四肢外周缺血。
22.根据权利要求17所述的PlGF同型二聚体，其中所述医学治疗是皮肤型硬皮病或进行性系统性硬皮病的治疗。
23.根据权利要求22所述的PlGF同型二聚体，其中硬皮病是心肌硬皮病。
24.根据权利要求17所述的PlGF同型二聚体，其中所述医学治疗是皮肤溃疡、创伤、烧伤、术-后疗法的治疗。
25.根据权利要求17所述的PlGF同型二聚体，其中所述医学治疗是皮肤组织的自然或过早老化的治疗。
26.根据权利要求17所述的PlGF同型二聚体，其中所述医学治疗是病理性脱发的治疗。
27.包括混合有至少一种可药用赋形剂的如权利要求I至4任一项所述的PlGF同型二聚体的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及重组PlGF-1的新型同型二聚体形式、其制备方法以及含有所述同型二聚体形式的组合物。
文档编号C07K14/515GK102596990SQ201080039783
公开日2012年7月18日 申请日期2010年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者F·马丁, G·丹尼巴莱, G·萨尔维娅 申请人:冬姆佩股份公司, 盖莫纳股份公司