专利名称：改进的lov-d酰基转移酶介导的酰化作用的制作方法
改进的LOV-D酰基转移酶介导的酰化作用I.相关申请的交叉引用本申请要求都在2009年9月30日递交的美国临时申请第61/247，253和61/247，274号的权益，其全部内容在此通过引用整体并入。2.序列表的引用本文通过引用并入根据37CFR§ I. 821通过EFS-网以计算机可读形式(CRF)文件名为CX2-032. txt随此同时递交的序列表。在2010年9月24日创建了该序列表的电子副本，文件大小是52千字节。3.背景 本发明涉及使用改进的LovD酰基转移酶介导的酰化作用形成斯伐他汀或斯伐他汀前体的工艺。酶是催化化学底物向产物转化的生物分子且已用于有价值的天然产物和药物的化学合成中。有利地，酶可发挥功能以增加底物到产物化学转化速率(通过降低反应的活化能)并指导官能团的置换，即区域选择性地和/或立体选择性地将官能团放置到底物上。称作抑制剂的其他分子可影响酶活性。这些抑制剂发挥功能以减少酶活性且可极大地限制起始底物向产物的转化或转化速率。一组特别有用的酶包括转移酶。转移酶是催化官能团例如烷基、酰基或磷酸基从一个底物(指定为供体且有时称为辅酶)向另一个底物(指定为受体)转移的酶。因此酶催化化合物之间的反应，这种反应导致供体失去官能团和受体得到官能团。除了其他物质以外，已使用酰基转移酶的亚类以区域选择性地酰化化学底物例如红曲菌素J(monacolinJ)以形成斯伐他汀。斯伐他汀是天然产品洛伐他汀的半合成衍生物，洛伐他汀可从土曲霉(Aspergi I Ius terreus)的发酵液中分离到。洛伐他汀和斯伐他汀都是降低胆固醇的药物，明显降低成人患心脏病的风险。之前已描述了土曲霉中生物合成洛伐他汀的基因簇，例如在美国专利第6，391，583号中。该基因簇中编码的是称为LovD的46kD的蛋白质，其起酰
基转移酶作用。一旦在宿主土曲霉中通过发酵产生洛伐他汀，可通过半合成途径从洛伐他汀产生斯伐他汀。在从发酵液中分离和纯化洛伐他汀之后，可在碱存在下通过2-丁酸甲酯侧臂的水解进行典型的半合成以产生中间产物红曲菌素J。红曲菌素J是斯伐他汀的直接前体。水解之后，游离酸被内酯化，C13上的游离羟基被保护，且C8醇被酰化以提供斯伐他汀的受保护的类似物。随后的去保护提供了斯伐他汀。例如，见WO 2007/139871。还已研究使用脂肪酶和酯酶的酶促转化作为化学衍生的替代方法。例如，见PCTWO 2005/040107、PCT WO 94/26920 和 T. G. Schimmel 等人在 Appl. Environ. Microbiol.(1997)63 :1307-1311中所述的。酶变体受累于降低的底物处理量、高负载量要求、缓慢的酶转化速率或差的酶周转。因此，提供在最少的分离步骤下良好至高的产率，良好的酶周转和转化速率和/或合理的负载量要求的产生斯伐他汀的酶促方法，例如通过红曲菌素J的CS羟基的选择性酰化，对于斯伐他汀和其他抑制素(statin)类似物的有效合成来讲是重要的。因此，一直渴望需要克服现有技术的ー个或多个缺点的酶エ艺，从而使用酰基转移酶提供化学底物例如洛伐他汀或红曲菌素J的有效且方便的酰化。4.概述已令人惊奇地发现LovD酰基转移酶介导的斯伐他汀前体的酰化作用是ー个平衡过程且这个平衡过程可通过ー种或多种方式调节以产生底物向产物的较高转化和/或转化速率。还已令人惊奇地发现在LovD酰基转移酶介导的酰化反应期间，斯伐他汀可以在斯伐他汀前体的酰化作用中作为不溶性盐沉淀，这导致平衡移动，从而提供底物向产物的较高转化和/或转化速率。
已令人惊奇地发现酰化红曲菌素J羟酸盐期间产生的硫醇副产物可抑制LovD酰基转移酶。更特别地，已发现虽然LovD酰基转移酶可以以高产率介导将红曲菌素J羟酸盐酰化成相应的斯伐他汀酸，可通过防止硫醇副产物对LovD酶的抑制提高转化反应速率。因此，在一个或多个实施方式中，本公开内容涉及通过加入硫醇清除剂防止抑制酶LovD酰基转移酶的方法。见图I。有利地，已发现当包括酰基部分的硫酯化合物用作共底物时，加入硫醇清除剂例如活性炭提高了红曲菌素J底物到其酰化类似物的转化速率。使用酶LovD酰基转移酶，本文所述的方法克服了现有技术的ー个或多个缺点并满足了对有效且方便地合成斯伐他汀和斯伐他汀前体的长期渴望的需要。在一个或多个实施方式中，本公开内容还提供了产生斯伐他汀的方法，该方法克服了新发现的硫醇副产物对LovD酰基转移酶的抑制并将平衡向反应产物方向移动。还已发现加入硫醇清除剂例如活性炭防止或减轻了酶抑制。这使得底物向目标化合物的酶转化得到提高且因此提供了产生斯伐他汀的有利方法。在特定实施方式中，描述了为利用改进的酶转化工艺而设计的方法和材料。更特别地，在一个或多个实施方式中，本公开内容涉及产生酶酰化的化学底物(斯伐他汀或斯伐他汀前体)的方法，其中使用硫醇清除剂防止对酶酰基转移酶的抑制。见
图1(示出了示例性的和概括的LovD酰基转移酶反应，其中硫醇清除剂被多价螯合(sequester))。在一个或多个实施方式中，该方法包括步骤将反应介质中的酶LovD酰基转移酶与(i)硫醇清除剂和/或(ii)沉淀剂、含有游离羟基部分的底物和含有酰基部分的硫酯组合。酰基转移酶介导将酰基部分从硫酯给予游离羟基部分，从而产生目标化合物。虽然不期望被任何工作原理约束，在其中使用硫醇清除剂的实施方式中，认为硫醇清除剂多价螯合(结合或以其他方式失活)所得到的硫醇副产物。硫醇副产物可起LovD的酶抑制剂作用，从而降低酶活性和底物向产物的转化。酶抑制可能是抑制剂竞争结合酶的結果。另夕卜，再次虽然不期望被任何工作原理约束，在其中使用沉淀剂的实施方式中，认为通过沉淀从反应介质中移除产物导致反应平衡的有利移动。移除硫醇副产物也可提供平衡的有利移动。本文所述的实施方式还包括使用改进的LovD酰基转移酶反应通过最少的化学步骤产生斯伐他汀的方法。有利地，例如在“一歩法”化学合成法中，改进的酰基转移酶反应任选与另外的化学步骤组合以提供由洛伐他汀产生斯伐他汀而不需要分离和纯化红曲菌素J中间产物的方法。例如，洛伐他汀可以水解成红曲菌素J且将粗反应产物用作酶介导的酰化反应的底物。本公开内容还提供了为利用改进的LovD酶工艺而设计的方法和材料，例如制备洛伐他汀的方法，以产生相关化合物例如普伐他汀衍生物辉伐他汀。本领域技术人员将应理解本文提供的公开内容允许技术人员提出多种多样的实施方式。在一个示例性的实施方式中，通过在LovD酰基转移酶、(i)硫醇清除剂(包含例如活性炭)和/或(ii)沉淀剂(例如氢氧化铵(NH4OH))和LovD酰基转移酶存在下将红曲菌素J或红曲菌素J衍生物(优选红曲菌素J羟酸)、向红曲菌素J (或衍生物)的CS羟基提供酰基部分的硫酯组合在一起而产生斯伐他汀。LovD酰基转移酶发挥功能以介导来自硫酯的酰基的转移以区域选择性地酰化红曲菌素J(或衍生物)的CS羟基，从而产生斯伐他汀。当存在硫醇清除剂时，所得到的副产物硫醇被多价螯合(被硫醇清除剂结合或失活)。当存在沉淀剂时，反应产物被沉淀。有利地，反应速率引人注意地或明显地提高。相关的实施方式提供了制备斯伐他汀的方法，包括以下步骤在LovD酰基转移酶、⑴硫醇清除剂(包含例如活性炭)和/或(ii)沉淀剂(例如氢氧化铵(NH4OH))和 LovD酰基转移酶存在下将洛伐他汀、向红曲菌素J的CS羟基提供酰基部分的硫酯组合在一起。在该方法的这个实施方式中，在使用酰基转移酶通过红曲菌素J的CS羟基的区域选择性酰化作用转移硫酯的酰基之前允许LovD酰基转移酶将洛伐他汀水解成红曲菌素J，从而提供斯伐他汀。当存在硫醇清除剂时，所得到的副产物硫醇被多价螯合(被硫醇清除剂结合或失活)。当存在沉淀剂时，反应产物被沉淀。有利地，提高了反应速率且实现了高转化率。用来制备斯伐他汀的本文所述的方法和材料可适合于产生其他化合物，包括结构上与斯伐他汀相似的那些化合物，例如辉伐他汀。就此而论，提供了制备辉伐他汀的方法，其包括以下步骤在LovD酰基转移酶、(i)硫醇清除剂(包含例如活性炭)和/或(ii)沉淀剂(例如NH4OH)和LovD酰基转移酶存在下将水解的普伐他汀四醇、向水解的普伐他汀四醇的CS羟基提供酰基部分的硫酯组合在一起。允许LovD酰基转移酶使用硫酯的酰基区域选择性地酰化水解的普伐他汀四醇的CS羟基，从而制备辉伐他汀。认为硫醇清除剂(当存在时)再次通过多价螯合硫醇副产物而发挥作用，从而防止对LovD酶抑制，导致酶反应速率提高且平衡向反应产物方向移动。认为沉淀剂(当存在时)通过从溶液中移除反应产物而使平衡向反应产物方向移动。还在另一个实施方式中，可直接从普伐他汀制备辉伐他汀。将普伐他汀与LovD酰基转移酶组合以将普伐他汀水解成中间产物水解的普伐他汀四醇。然后一经加入(i)硫醇清除剂和/或(ii)沉淀剂，和包含酰基部分的硫酯，可进行经由LovD酰基转移酶的酰化作用。在本文所述的多种方法的典型实施方式中，官能团供体是酰基供体。硫酯是一组非常优选的供体化合物，其可在LovD酰基转移酶和清除剂化合物存在下将酰基部分给予化学底物。例如，可在LovD酰基转移酶存在下通过硫酯酰化红曲菌素J的CS羟基。本文公开了多种此类硫酯。例如，见图4(示出了某些优选的硫酯化合物)。除了图4的优选硫酯，其他优选的硫酯包括丁酰硫酯、N-乙酰半胱胺硫酯或巯基乙酸甲酯硫酯。生物来源的硫酯化合物例如乙酰辅酶A(乙酰CoA)可用于一个或多个实施方式中。乙酰CoA包括辅酶A(硫醇)和乙酸(酰基载体)之间的硫酯。因此，包含酰基供体的其他化合物包括酰基_CoA、丁酸_CoA、苯甲酸-CoK、乙酸乙酸-CoK、^ -轻基丁酸-CoA、丙二酸-CoA和掠桐酰-CoA。硫酯基团可包括ー种或多种官能团诸如例如烃基连接体链、烃基、芳基、酷、酰胺、磺酸酷、磷酸酯等。优选地，硫醇包括終止于酯或酰胺的短的烃基链，或硫酯可只包括烃基链。还考虑了具有提供酰基能力的其他官能团供体作为合适供体。经LovD-介导的目标底物的酰化作用形成硫醇副产物的其他酰基供体基团将受益于本公开内容的ー个或多个实施方式的方法，尤其是加入多价螯合一个或多个硫醇部分的清除剂，和/或加入沉淀剂。任选地，硫酯包括ー种或多种短(C1-C2)、中(C3-C6)或长(> C7)链长的酰基部分，其可以是支化的、未支化的或环状的。设想在某些情况下，酰基部分可被官能化。一些代表性的硫酯是α - ニ甲基丁酰-S-巯基丙酸甲酯(a-dimethylbutyryl-S ' -methyl-mercaptopropionate,也称作 3-(2,2-ニ 甲基硫代丁酰)丙酸甲酯(methyl 3-(2,2-dimethylbutanoylthio) propanoate)), DMB-S-MMP)、ニ 甲基丁 酸基-S-疏基丙酸こ酯(dimemylbutyryl-S-ethyl mercaptopropionate, DMB~S~EMP)、ニ 甲基丁酿基-S-琉基こ酸甲酯(dimethylbutyryl-S-methyl thioglycolate, DMB-S-MTG)和 ニ 甲基丁 酸基-S-疏基丁酸甲酯(dimethylbutyryl-S-methyl mercaptobutyrate, DMB-S-MMB)。在说明性和优选的实施方式中，硫酯是S-2-こ酰氨基こ基2，2-ニ甲基硫代丁酸酯(S-2-acetamidoethyl 2, 2-dimethylbutanethioate)、S-こ酸氨基甲基 2, 2_ ニ 甲基硫代 丁酸酯(S-acetamidomethyl 2, 2_dimethylbutanethioate)、2_(2, 2_ ニ甲基硫代丁酸)乙酸甲酯(methyl 2- (2, 2-dimethylbutanoylthio) acetate)和/ 或 3_ (2, 2_ ニ 甲基硫代丁酸)丙酸甲酯(methyl 3_ (2, 2-dimethylbutanoylthio) propanoate)。可通过本领域已知的方法制备硫酷。在示例性エ艺中，可在N，N-ニ异丙基こ胺(DIPEA)存在下通过用2，2-ニ甲基丁酰氯酰化3-巯基丙酸甲酯制备非常优选的硫酯DMB-S-MMP。通过在酰化3-巯基丙酸甲酯中使用其他酰基氯(或卤化物)和无机或有机碱可制备其他酰基硫酷。在本文所述的方法中有用的酶酰基转移酶是LovD酰基转移酶。LovD酰基转移酶可以是可从土曲霉获得的野生型LovD酰基转移酶或其突变体，诸如例如在BiotechnolBioeng，2009年I月；102(1) :20_8中所述的突变体。在2009年9月30日递交的名称为“LovD Variants and Their Uses (LovD变体和其用途)的专利申请第61/247，253号”和随此同时提交的相同名称的代理人申请案号为376247-043US(105191) {CX2-022}的申请第号中描述了具体示例性的LovD酰基转移酶，与可有利地用于本文所述的方法中的来自土曲霉的野生型LovD酰基转移酶相比，其以大幅增加的反应速率和产率催化本文所述的方法。以下在第6部分中也描述了合适的LovD酰基转移酶(例如见表2)。本文公开的方法使用ー种或多种清除剂化合物或试剂。适合清除硫醇化合物的清除剂化合物包括例如活性炭、靛红酸酐、氟代2，4- ニ氯-I，3，5-三嗪(F-DCT)、こ烯基醚、ニ氢吡喃、N-こ基马来酰亚胺、对-(氯汞基)苯甲酸酷、铜离子和其变体。硫醇清除剂可适应于整合到固相支持体上且可单独使用或与其他清除剂组合使用，其他清除剂包括非硫醇清除剂，即结合或失活抑制酶活性的其他官能团而发挥作用的清除剂。在优选的实施方式中，使用活性炭。除了或排除掉ー种或多种清除剂化合物或试剂，本文所述的方法也可使用ー种或多种沉淀剂。优选的沉淀剂是发挥功能以将反离子给予酰化底物的化合物，这使得化合物不溶于反应介质。例如，氢氧化铵发挥功能以提供铵反离子(NH4+)。在本文所述的某些实施方式中，该方法导致LovD酶活性提高。LovD酶活性提高对应于酶稳定性提高、酶速率即修饰例如酰化底物的速率提高，和/或酶负载量要求例如在给定时间范围内达到既定转化率所需要的酶量提高。在示例性和优选的实施方式中，提高了酶速率。例如，如在以下提供的实例中举例证明的，可提高实现将红曲菌素J羟酸钠盐酰化成对应的斯伐他汀羟酸钠盐的速率，即完全的平衡转化，意味着不再有底物被酰化的时刻在较短的时间内发生。使用改进的LovD酰基转移酶反应制备斯伐他汀和相关化合物的方法的某些实施方式可包括纯化这些化合物的其他步骤。例如，本公开内容的实施方式可包括至少一个纯化步骤，该纯化步骤包括裂解组合中存在的分离的生物体细胞。实施方式还可包括至少一个纯化步骤，该纯化步骤包括离心组合中存在的分离的生物体的细胞或细胞裂解液。另夕卜，实施方式可包括至少一个纯化步骤，该纯化步骤包括沉淀组合中存在的一种或多种化合物。沉淀步骤的一个实施方式包括沉淀游离酸形式的斯伐他汀。任选地在这些实施方式中，技术人员然后可将这种游离酸形式的斯伐他汀转化为斯伐他汀盐。本公开内容的实施方式还可包括至少一个纯化步骤，该纯化步骤包括组合中存在的一种或多种化合物的过滤或色谱。另外，实施方式可包括至少一个分析步骤，该分析步骤包括分光光度法例如质子或 碳NMR或色谱例如快速色谱、薄层色谱、气相色谱和/或高效液相色谱(HPLC)。以下讨论了其他实施方式。5.附图简述图I提供了 LovD酰基转移酶介导的通过供体化合物酰化羟基和随后“清除”硫醇副产物的概括方案；图2示出了洛伐他汀(100)的水解，其可被化学水解或酶水解以产生(a)LovD水解的洛伐他汀(110)，(b)红曲菌素J羟酸(120)或(c)红曲菌素J羟酸钠盐(140)；图3示出了多种酰基转移酶介导的红曲菌素J羟酸和其盐的酰化；图4示出了包含酰基的一些代表性硫酯；图5用化学编号和标记示出了洛伐他汀(100)和斯伐他汀(160);和图6示出了经由LovD水解的洛伐他汀(110)从洛伐他汀(100)合成斯伐他汀
(160)。6.详述LovD酰基转移酶介导的抑制素前体例如红曲菌素J或其类似物和其衍生物的酰化是一个平衡过程。这是指反应产物可抑制另外的产物形成。通过(i)增加硫酯负载量；(ii)去除/多价螯合硫醇副产物；或(iii)沉淀产物可使平衡过程向反应产物方向移动。本公开内容的工艺使用了一种或多种平衡移动技术以提高底物向产物的转化百分率和/或反应速率。例如，在某些实施方式中，使用增加硫酯负载量提高反应产率/速率。在其他的实施方式中，清除硫醇副产物以提高反应产率/速率。还在其他的实施方式中，在反应期间沉淀产物，从而提高反应产率/速率。可组合使用平衡移动技术。例如，在某些实施方式中，使用其他硫酯共底物和产物沉淀(加或不添加硫醇清除剂)。在一个或多个实施方式中，本公开内容提供了使用LovD酰基转移酶改进酰化化学底物的新工艺。优选的实施方式包括通过添加清除剂化合物提高LovD或其变体的酰基转移酶活性的方法。另一个优选的实施方式包括使用沉淀剂。另外的优选实施方式还包括使用LovD酰基转移酶、包含酰基部分的硫酯和(i)清除剂化合物和/或(ii)沉淀剂产生酰化的化学底物的方法。ー种或多种优选实施方式举例说明的是使用LovD酰基转移酶、包含酰基部分的硫酯和(i)清除剂化合物和/或(ii)沉淀剂酰化且由此从洛伐他汀或红曲菌素J(或其羟酸盐)产生斯伐他汀的改进エ艺。一个示例性的且优选的清除剂化合物是活性炭。不被任何ー个工作原理约束，假设活性炭捕捉抑制LovD酶的硫醇副产物和/或将硫醇副产物转化(“失活”)成不干扰酶活性的ニ硫化物。不干扰酶活性且结合或失活硫醇副产物的其他硫醇清除剂也是优选的。6. I 定义如本文使用的，期望以下术语具有以下含义“洛伐他汀”(Mevacor )是由土曲霉产生的真菌聚酮化合物。參见例如，A. ff. Alberts, J.等人 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，1980，77，3957-3961 和 A. Endo,J. Antibiot. 1980，33，334-336 ；和 J. K. Chan,等人 J. Am. Chem. Soc. 1983，10 5，3334-3336 ；和 Y. Yoshizawa,等人 J. Am. Chem. Soc. 1994，116，2693-2694。由于其对羟基甲基戊ニ酰辅酶A还原酶(HMGR)的有力抑制活性，即胆固醇合成的限速步骤，其是药学上重要的化合物。且因此其被广泛用于治疗高血脂症、高胆固醇血症等。见图5的洛伐他汀(100)的化学编号和标记。“斯伐他汀”是洛伐他汀的类似物。其优于洛伐他汀是因为不存在有害的副作用且其胃吸收性高。另外，已报道斯伐他汀通过妨碍Ab42(—种与AD有关的β-淀粉样蛋白质)的产生而防止阿尔茨海默病(AD)并降低阿尔茨海默病(AD)的风险。本领域中已知可合成制备斯伐他汀。參见，例如美国专利第4，444，784,4, 582，915,5, 393，893,5, 763，646和5，763，653号、欧洲专利第299，656号和国际专利公布号WO 99/45003。见图5的斯伐他汀(160)的化学编号和标记。本文所用的“洛伐他汀衍牛物”包括洛伐他汀衍牛物或前体,例如:普伐他汀、辉伐他汀和斯伐他汀。“红曲菌素J变体”是指本领域公开的红曲菌素J变体，例如水解的普伐他汀四醇或6-羟基-6-去甲基红曲菌素J等。在本公开内容的某些实施方式中，“红曲菌素J变体”是指具有C6位置取代的红曲菌素J化合物或是指红曲菌素J的羟酸(和其盐)形式。技术人员将理解洛伐他汀、红曲菌素J和斯伐他汀以及其类似物和其衍生物可以以多种形式存在，包括酸、酷、酰胺和内酯形式。酸、酷、酰胺和内酯形式也可以是盐形式。以下说明了这些化合物的酸(R = _0H)、酷(R = _0(烃基))、酰胺0 =,(烃基)2)和内酯形式。除非另外指明，本文所用的“洛伐他 ”包括酸、酷、酰胺、内酯和盐形式，本文所用的“红曲菌素J”包括酸、酷、酰胺、内酯和盐形式，且本文所用的“斯伐他汀”包括酸、酷、酰胺、内酯和盐形式。这些形式可用于本文所述的方法。
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权利要求
1.一种制备抑制素化合物的方法，所述方法包括在硫酯供体和选自硫醇清除剂、沉淀剂和其组合的试剂存在下，在产生抑制素化合物的条件下使LovD酰基转移酶底物与LovD酰基转移酶接触。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述LovD酰基转移酶底物是红曲菌素J。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述红曲菌素J是红曲菌素J羟酸盐。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述红曲菌素J是红曲菌素J内酯。
5.根据权利要求I所述的方法，其中所述LovD酰基转移酶底物是洛伐他汀。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述洛伐他汀是洛伐他汀羟酸盐。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述洛伐他汀是洛伐他汀内酯。
8.根据权利要求I所述的方法，其中所述LovD酰基转移酶底物是6-羟基-6-去甲基_红曲菌素-J。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述6-羟基-6-去甲基-红曲菌素J是6-羟基-6-去甲基-红曲菌素J羟酸盐。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述6-羟基-6-去甲基-红曲菌素J是6-羟基_6_去甲基-红曲菌素J内酯。
11.根据权利要求I所述的方法，其中所述LovD酰基转移酶底物是普伐他汀。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述普伐他汀是普伐他汀羟酸盐。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述普伐他汀是普伐他汀内酯。
14.根据权利要求1-13任一项所述的方法，其中所述硫酯供体是α-二甲基丁酰硫酯。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述α-二甲基丁酰硫酯选自由α-二甲基丁酰-S-巯基丙酸甲酯(DMB-S-MMP)、二甲基丁酰-S-巯基丙酸乙酯(DMB-S-EMP)、二甲基丁酰-S-巯基乙酸甲酯(DMB-S-MTG)、二甲基丁酰-S-巯基丁酸甲酯(DMB-S-MMB)、S_2_乙酰氨基乙基2，2- 二甲基硫代丁酸酯、S-乙酰氨基甲基2，2- 二甲基硫代丁酸酯和2-(2，2- 二甲基硫代丁酰)乙酸甲酯组成的组。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述α-二甲基丁酰硫酯是DMB-S-MMP。
17.根据权利要求14所述的方法，所述方法在pH范围约pH8至pH9. 5的水性介质中进行。
18.根据权利要求14所述的方法，所述方法在具有约pH9的初始pH的水性缓冲液中进行。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述试剂是硫醇清除剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述硫醇清除剂是活性炭。
21.根据权利要求14所述的方法，其中所述试剂是沉淀剂。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述沉淀剂是氢氧化铵。
23.根据权利要求14所述的方法，其中所述LovD酰基转移酶是具有选自表2的氨基酸序列的LovD变体。
24.根据权利要求14所述的方法，其中所述LovD酰基转移酶是具有对应于SEQID NO:116的氨基酸序列的LovD变体。
25.一种制备斯伐他汀羟酸铵盐的方法，所述方法包括在α-二甲基丁酰硫酯供体和氢氧化铵存在下，在产生斯伐他汀羟酸铵盐的条件下使红曲菌素J或洛伐他汀与LovD酰基转移酶接触。
26.根据权利要求25所述的方法，所述方法在pH范围约pH8至pH9. 5的水溶液中进行。
27.根据权利要求25所述的方法，所述方法在具有约pH9的初始pH的水性缓冲液中进行。
全文摘要
提供了使用LOV-D酰基转移酶、具有酰基的硫酯和(i)硫醇清除剂和/或(ii)沉淀剂改进化学底物的酰化作用的方法。还提供了使用(i)活性炭作为硫醇清除剂和/或(ii)氢氧化铵作为沉淀剂产生斯伐他汀的改进方法。
文档编号C07K14/00GK102712678SQ201080043043
公开日2012年10月3日 申请日期2010年9月24日 优先权日2009年9月30日
发明者乔利·苏库玛兰, 史蒂文·詹姆斯·科利尔, 张易玲, 徐俊业, 罗伯特·约翰·威尔逊 申请人:科德克希思公司