抗hepsin抗体及其使用方法

专利名称：抗hepsin抗体及其使用方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及分子生物学领域。更具体的说，本发明关注抗h印sin抗体，及其用途。
背景技术：
h印sin是一种在上皮细胞的表面上表达的II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)。 417个氨基酸的该蛋白质包含短的N端胞质域、跨膜域和单个清道夫受体富含半胱氨酸域，其紧压 C 端蛋白酶域(Somoza et al (2003) Structure 11 (9)，1123-1131)。不清楚h印sin的生理功能。尽管它在胚胎发生的很早期表达(Vu et al(1997)J Biol Chem272 (50)，31315-31320)，h印sin缺陷小鼠是可存活的且正常发育(Yu et al (2000) ThrombHaemost 84 (5)，865-870; Wu et al (1998) JClin Invest 101 (2)，321-326)。发现h印sin对肝再生和对于凝固相关生理功能不是至关重要的(同上)。一项最近的研究证明了 h印sin敲除小鼠听力受损(Guipponi et al. (2007)Am J Pathol 171:608-616)。然而，hepsin涉及卵巢[(Tanimoto et al(1997)Cancer Res 57(14), 2884-2887);W02001/62271]和前列腺癌。数项基因表达研究将hepsin鉴定为前列腺癌受到最高度诱导的基因之一 (Dhanasekaran et al(2001)Nature 412，822-826;Luo et al(2001)CancerRes61 (12),4683-4688;Magee et al (2001)Cancer Res 61 (15)，5692-5696;Stamey etal(2001)J Urol 166(6), 2171-2177;Stephan et al(2004)J Urol 171(I)，187-191;Welshet al (20010) Cancer Res 61 (16)，5974-5978)。发现 h印 sin RNA 水平在正常前列腺和良性增生中较低，但在前列腺癌中强烈升高，特别是晚期阶段((Dhanasekaran etal (2001)Nature 412，822-826;Luo et al(2001)Cancer Res61 (12),4683-4688;Mageeet al(2001)Cancer Res 61(15),5692-5696;Stamey etal(2001)J Urol166(6), 2171-2177; Stephan et al(2004)J Urol 171 (I)，187-191;Welsh et al(20010)Cancer Res 61 (16)，5974-5978)。用单克隆抗hepsin抗体进行的hepsin蛋白染色显示了骨转移部位处和晚期阶段原发性肿瘤中的hepsin表达最高(Xuan et al (2006) Cancer Res66 (7)，3611-3619)，与升高的h印sin RNA水平与较高的Gleason等级和肿瘤进展有关的发现一致((Luo et al (2001)Cancer Res 61(12)，4683-4688;Magee et al (2001)Cancer Res61(15), 5692-5696;Stamey et al(2001)J Urol 166(6), 2171-2177;Stephan et al(2004)JUrol 171(1), 187-191;Chen et al(2003)J Urol 169(4)，1316-1319)。hepsin在前列腺癌中的作用的实验证据来自Klezovitch等人的一项研究(Klezovitch et al (2004) Cancer Cell 6 (2)，185-195),其证明了在非转移性前列腺癌的小鼠模型中，hepsin的过表达导致原发性肿瘤进展和转移。有趣的是，h印sin过表达与基底膜破坏有关(同上)，这指出了 hepsin活性以某种方式与基底膜成分的降解有联系的可能性。在体外，hepsin能够将潜伏的生长因子肝细胞生长因子原(HGF原)转变成它的活性双链形式(HGF)，其诱导Met受体信号传导(Herter et al (2005) Biochem J 390 (PtI),125-136;Kirchhofer et al (2005)FEBS Lett 579 (9)，1945-1950;W02006/014928)。hepsin还能够将uPA原转变成其活性形式(Moran et al, (2006) J BiolChem. 281(41) :30439-46)，及在体外切割核纤层蛋白(Tripathi et al. (2008) J BiolChem. 283:30576)。因为HGF/Met途径涉及侵入性肿瘤生长和转移，所以有可能h印sin的过表达在前列腺癌中激活HGF/Met轴(Herter et al (2005) Biochem J 390 (PtI),125-136;Kirchhofer et al (2005)FEBS Lett 579 (9)，1945-1950;W02006/014928)。hepsin还显示出在体外切割其它底物,主要是凝固相关蛋白(Herter et al, id;Kazama etal (1995) JBiol Chem 270 (I)，66-72)。然而，不知道它们在肿瘤发生中的作用。清楚的是仍然需要具有最适于开发成治疗剂的临床属性的药剂。本文所述发明满足了此需求并提供了其它好处。
通过述及将本文中所引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)完整收入本文。发明概述本发明部分基于多种hepsin结合物(诸如抗体,及其片段)的鉴定。hepsin代表了一种重要的且有利的治疗靶，而且本发明提供了基于药剂对hepsin的结合的组合物和方法。如本文中所描述的，本发明的hepsin结合物提供了重要的治疗剂和诊断剂，供靶向与hepsin信号传导途径的表达和/或活性有关的病理性疾患中使用。因而，本发明提供了与hepsin结合有关的方法、组合物、试剂盒、和制品。胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(诸如hepsin)的活性位点由几个内在活动的环(“活化域”)形成(Huber and Bode, 1978) 特别地,220环形成SI袋的一部分且能在一些丝氨酸蛋白酶中米取多种构象状态(Johnson et al. , 2005; Shia et al. , 2005; Spraggon etal.，2009; Wilken et al.，2004)。然而，丝氨酸蛋白酶与活性位点抑制剂的共晶体结构显示正确形成的活性位点，最有可能是由于由抑制剂施加的稳定力(Arni et al.，1994; Shiaet al. , 2005; Spraggon et al.，2009)。推理得出丝氨酸蛋白酶抑制剂对SI袋的占据可对丝氨酸蛋白酶活性位点环灵活性施加稳定力，促进丝氨酸蛋白酶活性位点的抗体识别。如此，为了鉴定阻断hepsin酶活性的抗hepsin抗体,获得了结合与丝氨酸蛋白酶抑制剂3，4-二氯-异香豆素(DCI)复合的hepsin的抗体,所述丝氨酸蛋白酶抑制剂占据SI袋。本发明提供了结合hepsin的抗体。在一个方面，本发明的特征是一种分离的结合hepsin的抗体。在一个方面，本发明提供一种分离的抗hepsin抗体，其中该抗体的单价形式(诸如Fab形式)以约IOnM或更好的结合亲和力特异性结合人hepsin。在一些实施方案中，所述抗体以约6nM或更好的结合亲和力特异性结合人hepsin。如本领域完全确立的,配体对其受体的结合亲和力可以使用多种测定法来测定，而且以多种定量数值来表述。因而，在一个实施方案中，结合亲和力表述成Kd值，而且反映了内在结合亲和力(例如具有最小化的亲合效应)。通常且优选的是，结合亲和力是在体外测量的，无论是在无细胞背景下还是在细胞相关背景下。可以使用本领域已知的多种测定法之任一来获得结合亲和力测量，包括本文中所描述的测定法，包括例如Biacore、放射免疫测定法(RIA)、和ELISA。
在另一个方面,本发明提供结合hepsin中库尼茨(Kunitz)域结合区的抗hepsin抗体。在一个方面，本发明提供一种分离的抗hepsin抗体,其与库尼茨域竞争对hepsin的结合。在一个实施方案中，所述库尼茨域序列为HAI-I或HAI-IB的库尼茨域I (KDl)。在一个实施方案中，该库尼茨域序列为与人HAI-I的野生型KDl具有至少约70%，75%, 80%, 85%,90%, 95%, 97%, 98%, 99%序列同一性的变体KDl序列，其中所述变体序列至少具有与野生型KDl相当的抑制h印sin活性的能力。在一个实施方案中，所述库尼茨域序列为HAI-2的库尼茨域之一或二者。在一个实施方案中，变体HAI-2库尼茨域序列与野生型人HAI-2的相应库尼茨域具有约70%至99%、约75%至98%、约80%至97%、85%至95%序列同一性，其中所述序列至少具有与野生型HAI-2相当的抑制hepsin活性的能力。
在一个方面，本发明提供结合hepsin催化位点的抗hepsin抗体。在一个方面,本发明提供在si亚位点以外结合hepsin的抗hepsin抗体。在一些实施方案中，该抗体结合hepsin s2和/或s3亚位点。在一个方面,本发明提供结合催化灭活的hepsin的抗hepsin抗体。在一个方面,本发明提供对hepsin蛋白水解有抗性的抗hepsin抗体。在一些实施方案中，在容许hepsin切割hepsin底物的条件下将该抗体对hepsin暴露24小时。在一个方面，本发明提供结合复合物中存在的h印sin的抗h印sin抗体，该复合物包含hepsin和结合hepsin SI亚位点的丝氨酸蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中，复合物中存在的h印sin是灭活的。在一些实施方案中，该丝氨酸蛋白酶抑制剂为3，4- 二氯-异香豆素(3，4-dichloro-isocoumarin, DCI)。在一些实施方案中，该丝氨酸蛋白酶抑制剂结合hepsin催化性氨基酸残基Serl95和His57,由此hepsin被灭活。在一个方面，本发明提供特异性结合人h印sin且实质性抑制体内和/或体外hepsin酶活性的抗hepsin抗体。在一个实施方案中，该酶活性包含hepsin对多肽底物的切割。在一个实施方案中，h印sin的多肽底物为巨噬细胞刺激性蛋白原(MSP原)、uPA原、因子VII和HGF原中的一种或多种。h印sin对MSP原的活化记载于2009年10月22日提交的共同未决的、共同拥有的美国临时专利申请No. 61/253，990。在一个实施方案中，该酶活性包含hepsin对合成底物的切割。在一些实施方案中，该hepsin合成底物为表I所示底物。在一个方面，本发明提供抗hepsin抗体，其中该抗体实质性抑制人和/或小鼠hepsin催化活性。在一些实施方案中，单价形式的抗hepsin抗体以约(在一些实施方案中，小于或等于)4nM的Ki抑制人hepsin催化活性。在一些实施方案中，单价形式的抗hepsin抗体以约(在一些实施方案中，小于或等于)330nM的Ki抑制小鼠hepsin催化活性。在一个方面,本发明提供抗hepsin抗体,其中该抗体实质性抑制hepsin对uPA原的切割。在一些实施方案中，该抗hepsin抗体以约3nM或更强的IC50抑制hepsin对uPA原的切割。在一个方面,本发明提供抗hepsin抗体,其中该抗体实质性抑制层粘连蛋白依赖性细胞迁移。在一个方面，本发明提供抗hepsin抗体，其中该抗体通过包括选择结合复合物的抗体的方法生成，该复合物包含(a)hepsin和(b)结合hepsin SI亚位点的丝氨酸蛋白酶抑制剂的。在一些实施方案中，复合物中存在的hepsin是灭活的。在一些实施方案中，该丝氨酸蛋白酶抑制剂为3，4-二氯-异香豆素(DCI)。在一些实施方案中，该丝氨酸蛋白酶抑制剂结合hepsin催化性氨基酸残基Serl95和His 57,由此hepsin被灭活。在一些实施方案中，在选择抗体之前，将抗体与hepsin和丝氨酸蛋白酶抑制剂一起温育。在一些实施方案中，该方法进一步包括选择与库尼茨域竞争hepsin结合的抗体的步骤。在一些实施方案中，该库尼茨域为KDl。在一个方面，本发明提供抗hepsin抗体,其中该抗体通过包括选择(鉴定)与库尼茨域竞争hepsin结合的抗体的方法生成。在一些实施方案中，该库尼茨域为KDl。在一个方面,本发明提供不受hepsin实质性切割的抗hepsin抗体。在一些实施方案中，该抗hepsin抗体对hepsin切割有实质性抗性。一般地，本发明的抗hepsin抗体是拮抗性抗体。在一个方面,本发明提供一种抗hepsin抗体,其包含至少一个、两个、三个、四个、五个、和/或六个选自下组的高变区(HVR)序列(a) HVR-Ll，其包含序列 RASQSVSSAVA (SEQ ID NO: I),(b)HVR-L2，其包含序列 SASSLYS (SEQ ID NO: 2),(c) HVR-L3，其包含序列 QQYYSSYYLLT (SEQ ID NO: 3),(d) HVR-Hl，其包含序列 GFNFSYSYMH (SEQ ID NO: 4),(e) HVR-H2，其包含序列 ASIYSYYGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 5),和(f)HVR-H3，其包含序列 ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY(SEQ ID NO:6)。在一个方面，本发明提供一种抗h印sin抗体，其包含(a)轻链，该轻链包含(i) HVR-Ll,其包含序列 RASQSVSSAVA (SEQ ID NO: I) ； (ii)HVR-L2,其包含序列SASSLYS (SEQ ID NO:2);和(iii) HVR-L3，其包含序列 QQYYSSYYLLT (SEQ ID NO:3);和/或(b)重链，该重链包含⑴HVR-Hl，其包含序列GFNFSYSYMH (SEQ ID NO: 4) ； (ii)HVR-H2，其包含序列 ASIYSYYGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 5);和(iii)HVR_H3，其包含序列ARSDSffSYKSGYTQKIYSKGLDY(SEQ ID NO:6)。在一个方面，本发明提供一种抗h印sin抗体，其包含HVR-L1，该HVR-Ll包含序列SEQ ID N0:1。在一个方面，本发明提供一种抗h印sin抗体，其包含HVR-L2，该HVR-L2包含序列SEQ ID N0:2。在一个方面，本发明提供一种抗h印sin抗体，其包含HVR-L3，该HVR-L3包含序列SEQ ID N0:3。在一个方面，本发明提供一种抗h印sin抗体，其包含HVR-Hl区，该HVR-Hl区包含序列SEQ ID N0:4。在一个方面，本发明提供一种抗h印sin抗体，其包含HVR-H2区，该HVR-H2区包含序列SEQ ID N0:5。在一个方面，本发明提供一种抗hepsin抗体，其包含HVR-H3区，该HVR-H3区包含序列SEQ ID NO:6。在一个方面,抗hepsin抗体包含轻链可变区和/或重链可变区，该轻链可变区包含 HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3，其中各自依次包含序列 RASQDVN/STAVA(SEQ ID NO: 7) ,SEQ ID勵:2、3，该重链可变区包含狀1 -111、狀1 -112、和HVR-H3，其中各自依次含有SEQ ID N0:4、5、6。在一个方面,抗hepsin抗体包含轻链可变区和/或重链可变区，该轻链可变区包含 HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3，其中各自依次包含序列 RASQDVN/STAVA(SEQ ID NO: 7) ,SEQ IDNO: I、序列 SASFLYS (SEQ ID N0:8)、SEQ ID NO: 3，该重链可变区包含 HVR-H1、HVR-H2、和 HVR-H3，其中各自依次含有SEQ ID N0:4、5、6。
在一个方面，抗h印sin抗体包含轻链可变区和/或重链可变区，该轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3，其中各自依次包含SEQ ID NO:7、8、3，该重链可变区包含HVR-H1、HVR-H2、和 HVR-H3，其中各自依次含有 SEQ ID N0:4、5、6。氨基酸序列SEQ ID NO: 1-6关于各个HVR编号(即HI、H2或H3)，如图I所示，编号方式与下文所述Kabat编号系统一致。本发明的抗体可包含任何合适的可变域框架序列，前提是对hepsin的结合亲和力得到基本上保留。例如，在有些实施方案中，本发明的抗体包含人亚组III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，所述框架共有序列包含第71位、第73位和/或第78位处的替代。在这些抗体的有些实施方案中，第71位是A，第73位是T，和/或第78位是A。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8( HiiRCl^llN.UGenentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)(在美国专利 No. 6，407，213 & 5，821，337，及 Lee et al.，J. Mol.Biol. (2004),340(5) :1073-1093中也有提及)的重链可变域框架序列。在一个实施方案中，这些抗体进一步包含人K I轻链框架共有序列。在有些实施方案中，所述框架共有序列包含第66位处的替代。在有些实施方案中，第66位是G。在一个具体的实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8的轻链HVR序列，如美国专利No. 6，407，213 & 5，821，337中所记载的。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5_8 ( 11LKC 1:11N H ■ Genentech,Inc. ,South San Francisco，CA，USA)(在美国专利 No. 6，407，213 & 5，821，337，及 Lee etal. , J. Mol.Biol. (2004),340(5) :1073-1093 中也有提及)的轻链可变域序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其中框架序列包含图2A-B公开的序列，而且HVR H1、H2、和H3序列分别为SEQ ID N0:4、5、和/或6。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其中框架序列包含SEQ ID NO14-15、48、和/或16的序列，而且HVR HI、H2、和H3序列分别为SEQ ID N0:4、5、和/或6的序列。在另一个实施方案中，框架序列包含SEQ ID NO 14-15、43、和/或16的序列，而且HVR H1、H2、和 H3 序列分别为 SEQ ID N0:4、5、和 / 或 6。 在一个特别的实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列分别包含 SEQ ID NO 17-20 ;49-51 和 20 ;52-54 和 20 ;和 / 或 55-57 & 20 的序列，而且 HVR LI、L2、和L3序列分别为SEQ ID勵:1、2、和/或3。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含SEQ ID NO 17-18、58和/或20的序列，而且HVR LI、L2、和L3序列分别为SEQ ID勵:1、2、和/或3。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含SEQ ID NO 17、18、19和/或20的序列，而且HVR Ll、L2jPL3序列分别为SEQ ID勵1、2、和/或3。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域和轻链可变域，在重链可变域中，框架序列包含SEQ ID NO 14-15、43和/或16的序列，而且HVRH1、H2、和H3序列分别为SEQ ID NO:4、5、和/或6，在轻链可变域中，框架序列包含SEQ ID NO 17_18、58和/或20的序列，而且HVR L1、L2、和L3序列分别为SEQ ID吣1、2、和/或3。在另一个方面，本发明的抗体包含重链可变域和/或轻链可变域，该重链可变域包含序列SEQ ID NO: 10，该轻链可变域包含序列SEQ ID N0:9。在另一个方面，本发明的抗体包含重链可变域和轻链可变区，该重链可变域包含序列 SEQ ID NO: 10。
在另一个方面，本发明的抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含序列 SEQ ID NO:9。本发明抗体的有些实施方案包含人源化4D5抗体(huMAb4D5_8)(I [LiRCLP I IN R . Genentech, Inc. , South San Francisco, CA, USA)(在美国专利No. 6，407，213 及 Lee et al.，J. Mol. Biol. (2004)，340 (5) : 1073-1093 中也有提及)的轻链可变域，如下文SEQ ID NO: 11所描绘的。
I Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg ValThr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr GlnGlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser GlyValPro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He SerSer LeuGln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr ProPro Thr PheGly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys 107 (SEQ ID NO: 11)(HVR残基标有下划线)在一个实施方案中，huMAb4D5-8轻链可变域序列在第30位、第66位、和第91位中一个或多个位置处被修饰(分别为Asn、ArgJP His，如上文以粗体/斜体标示的)。在一个实施方案中，经修饰的huMAb4D5-8序列包含第30位Ser、第66位Gly、和/或第91位Ser0因而，在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含下文SEQID N0:45所示序列I Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg ValThr He Thr Cys ArR Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr GlnGlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser GlyValPro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He SerSer LeuGln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr ProPro Thr PheGly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys 107 (SEQ ID NO:45)(HVR残基标有下划线)。在一个方面，本发明提供了一种抗hepsin抗体，其与上文所述任何抗体竞争对hepsin的结合。在一个方面，本发明提供了一种抗hepsin抗体,其与上文所述任何抗体结合hepsin上相同或相似表位。如本领域所知道的，和如下文更详细描述的，描述抗体高变区的氨基酸位置/边界可以有所变化，这取决于本领域中已知的背景和各种定义(如下文所述的)。可变域(区)内的有些位置可以看作杂合高变位置，因为这些位置在一组标准下可认为在高变区内，而在不同的一组标准下被认为在高变区外。在延伸的高变区中也能找到这些位置中的一处或多处(如下文进一步定义的)。在有些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在其它实施方案中，该抗体是多克隆抗体。在有些实施方案中，该抗体选自下组嵌合抗体，亲和力成熟抗体，人源化抗体和人抗体。在某些实施方案中，该抗体是抗体片段。在有些实施方案中，该抗体是Fab、Fab’、Fab’ _SH、F (ab，)2、或 scFv。在一个实施方案中，该抗体是嵌合抗体，例如如下的抗体，其包含来自非人供体的抗原结合序列，且该序列被嫁接至异源的非人、人、或人源化序列(例如框架和/或恒定域序列)。在一个实施方案中，该非人供体是小鼠。在另一个实施方案中，抗原结合序列是合成的，例如通过诱变得到的(例如噬菌体展示筛选等)。在一个具体的实施方案中，本发明的嵌合抗体具有鼠V区和人C区。在一个实施方案中，该鼠轻链V区是融合至人卡帕(K )轻链的。在另一个实施方案中，该鼠重链V区是融合至人IgGlC区的。本发明的人源化抗体包括那些在框架区(FR)中具有氨基酸替代的及在所嫁接的CDR中具有改变的亲和力成熟变体。CDR或FR中的替代氨基酸不限于那些存在于供体或受体抗体中的。在其它实施方案中，本发明的抗体进一步包含Fe区中的、导致改善的效应器功能(包括增强的CDC和/或ADCC功能和B细胞杀伤)的氨基酸残基改变。本发明的其它抗体包括那些具有增强稳定性的特定改变的那些抗体。在其它实施方案中，本发明的抗体包含Fe区中的、导致降低的效应器功能(例如降低的CDC和/或ADCC功能和/或降低的B 细胞杀伤)的氨基酸残基改变。在有些实施方案中，本发明的抗体以降低的对人补体因子Clq和/或天然杀伤(NK)细胞上人Fe受体的结合为特征。在有些实施方案中，本发明的抗体以降低的对人Fe Y RI、Fe Y RIIAjP /或Fe Y RIIIA的结合(诸如结合缺失)为特征。在有些实施方案中，本发明的抗体是属于IgG类的(例如IgGl或IgG4)且包含E233、L234、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331、和 / 或 P329 (编号方式依照EU索引)中的至少一处突变。在有些实施方案中，该抗体包含突变L234A/L235A或D265A/N297A。在一个方面，本发明提供了 hepsin结合多肽，其包含本文中所提供的任何抗原结合序列，其中该hepsin结合多肽特异性结合hepsin,例如人和/或称猴和/或小鼠hepsin。
本发明的抗体结合(诸如特异性结合)hepsin,而在有些实施方案中，其可调控(例如抑制)以下的一个或多个方面h印sin活性(诸如h印sin酶活性)和/或任何生物学重要的hepsin和/或hepsin多肽底物生物学途径的破坏，和/或肿瘤、细胞增殖性病症或癌症的治疗和/或预防；和/或与hepsin表达和/或活性(诸如升高的hepsin表达和/或活性)有关的病症的治疗或预防。在有些实施方案中，该hepsin抗体特异性结合由hepsin(例如人和/或小鼠hepsin)组成的或基本上由hepsin (例如人和/或小鼠hepsin)组成的多肽。在一个实施方案中，hepsin酶活性包括h印sin对多肽底物的切割。在一个实施方案中，h印sin的多肽底物为巨噬细胞刺激性蛋白原(MSP原(pro-MSP))、uPA原(pro_uPA)、因子VII和HGF原中的一种或多种。在一个实施方案中，本发明的抗体不是2006年出版的Cancer Research第66卷第3611-3619页中记载的抗h印sin抗体(例如图4中例示的抗体1A12、85B11、94A7、A6、A174、A21和/或A24)、或PCT公开文本W02004/033630中披露的分离的hepsin抗体(例如第93页和图 15A-D 中提到的抗体 47A5、14C7、46D12、38E2、37G10、31CI、11CI 和 / 或 72H6 )、或 Xuanet al (2006) Cancer Res 66 (7)，3611 中披露的分离的 h印sin 抗体、或W02007/149932 中披露的hepsin抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体不与下述抗体竞争对人hepsin的结合2006年出版的Cancer Research第66卷第3611-3619页中记载的抗hepsin抗体(例如图4中例示的抗体 1A12、85B11、94A7、A6、A174、A21 和 / 或 A24)、或 PCT 公开文本 W02004/033630 中披露的分离的h印sin抗体(例如第93页和

图154-0中提到的抗体47么5、1扣7、46012、38￡2、37G10、31C1、11C1 和 / 或 72H6)、或 Xuan et al (2006) Cancer Res 66 (7)，3611 中披露的分离的h印sin抗体、或W02007/149932中披露的h印sin抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体不与下述抗体结合人hepsin上的相同表位2006年出版的Cancer Research第66卷第3611-3619页中记载的抗hepsin抗体(例如图4中例示的抗体 1A12、85B11、94A7、A6、A174、A21 和 / 或 A24)、或PCT 公开文本 W02004/033630中披露的分离的h印sin抗体(例如第93页和图15A-D中提到的抗体47A5、14C7、46D12、38E2、37G10、31C1、11C1 和 / 或 72H6)、或 Xuan et al (2006)Cancer Res 66(7),3611 中披露的分离的h印sin抗体、或W02007/149932中披露的h印sin抗体在一个方面，本发明提供了组合物，其包含一种或多种本发明的抗体及载体。在一个实施方案中，所述载体是药学可接受的。在另一个方面，本发明提供了核酸，其编码本发明的抗hepsin抗体。
在又一个方面，本发明提供了载体，其包含本发明的核酸。在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含一种或多种本发明的核酸及载体。在一个实施方案中，所述载体是药学可接受的。在一个方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明的核酸或载体。载体可以是任何类型的，例如重组载体，诸如表达载体。可使用多种宿主细胞中任一种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在另一个方面，本发明提供了制备本发明抗体的方法。例如，本发明提供了制备抗hepsin抗体(如本文中所定义的，其包括全长抗体及其片段)的方法，所述方法包括培养包含编码人源化抗体的核酸的宿主细胞，使得该核酸表达。在一些实施方案中，上述方法进一步包括自宿主细胞培养物回收该抗体。在一些实施方案中，自宿主细胞培养液回收该抗体。在一些实施方案中，该方法进一步包括将回收的抗体与药学可接受载体、赋形剂、或载体组合以制备包含人源化抗体的药物配制剂。在一些实施方案中，本发明提供生成抗hepsin抗体的方法，所述方法包括选择结合复合物的抗体，该复合物包含(a)hepsin和(b)结合hepsin SI亚位点的丝氨酸蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中，复合物中存在的hepsin是灭活的。在一些实施方案中，该丝氨酸蛋白酶抑制剂为3，4-二氯-异香豆素(DCI)。在一些实施方案中，该丝氨酸蛋白酶抑制剂结合hepsin催化性氨基酸残基Serl95和His 57,由此hepsin被灭活。在一些实施方案中，在选择抗体之前，将抗体与hepsin和丝氨酸蛋白酶抑制剂一起温育。在一些实施方案中，该方法进一步包括选择与库尼茨域竞争hepsin结合的抗体的步骤。在一些实施方案中，该库尼茨域为KDl。在一个方面，本发明提供了一种制品，其包含容器；和装在该容器内的组合物，其中所述组合物包含一种或多种本发明的hepsin抗体。在一个实施方案中,所述组合物包含本发明的核酸。在另一个实施方案中，包含抗体的组合物进一步包含载体，所述载体在有些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，本发明的制品进一步包含关于对个体施用组合物(例如抗体)的指示(诸如关于本文中所描述的任何方法的指示)。在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含装有组合物的第一容器，所述组合物包含一种或多种本发明的抗hepsin抗体；和装有缓冲液的第二容器。在一个实施方案中，所述缓冲液是药学可接受的。在一个实施方案中，包含抗体的组合物进一步包含载体，所述载体在有些实施方案中是药学可接受的。在另一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含关于对个体施用组合物(例如抗体)的指示。hepsin途径涉及多种生物学和生理学功能，包括例如HGF/c-met途径的激活、MSP/Ron途径的激活、基底膜破坏/降解、基质降解、等。这些功能继而常常在病症诸如癌症中失调。如此，在另一个方面，本发明提供抑制基底膜破坏/降解和/或基质降解的方法，所述方法包括使细胞或组织与本发明的拮抗剂接触，由此基底膜破坏/降解和/或基质降解受到抑制。在还有另一个方面，本发明提供抑制基底膜破坏/降解和/或基质降解的方法，所述方法包括对具有与异常基底膜破坏/降解和/或基质降解有关的状况的细胞、组织、和/或受试者施用本发明的拮抗剂，由此基底膜破坏/降解和/或基质降解受到抑制。在一个方面，本发明提供用于治疗或预防与升高的hepsin活性有关的病症的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用有效量的本发明拮抗剂，由此有效治疗或 预防所述病症。在一个实施方案中，所述病症为癌症。在又一个方面，本发明提供本发明的抗hepsin抗体在制备用于病症(诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症)的治疗性和/或预防性处理的的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为卵巢癌或肾癌。在一个方面，本发明提供本发明的核酸在制备用于病症(诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症)的治疗性和/或预防性处理的的药物中的用途。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为卵巢癌或肾癌。在另一个方面，本发明提供本发明的表达载体在制备用于病症(诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症)的治疗性和/或预防性处理的的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为卵巢癌或肾癌。在还有另一个方面，本发明提供本发明的宿主细胞在制备用于病症(诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症)的治疗性和/或预防性处理的的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为卵巢癌或肾癌。在又一个方面，本发明提供本发明的制品在制备用于病症(诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症)的治疗性和/或预防性处理的的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为卵巢癌或肾癌。在一个方面，本发明还提供本发明的试剂盒在制备用于病症(诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症)的治疗性和/或预防性处理的的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为卵巢癌或肾癌。本发明提供可用于调控与hepsin表达和/或信号传导诸如升高的表达和/或信号传导或不想要的表达和/或信号传导)有关的病症的方法和组合物(。本发明的方法可用于影响任何合适病理状态。本文中描述了例示性病症，而且包括选自下组的癌症非小细胞肺癌，卵巢癌，甲状腺癌，睾丸癌，子宫内膜癌，头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)，脑癌(例如成神经细胞瘤或脑膜瘤)，头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)，脑癌(例如成神经细胞瘤或脑膜瘤)，皮肤癌(例如黑素瘤、基底细胞癌、或鳞状细胞癌)，膀胱癌(例如移行细胞癌)，乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌(CRC)，肝细胞癌，宫颈癌，肺癌，胰腺癌，前列腺癌，和肾癌，和子宫内膜癌。在一个实施方案中，本发明的方法所靶向的细胞是癌细胞。例如，癌细胞可以是选自下组的癌细胞乳腺癌细胞，结肠直肠癌细胞，肺癌细胞(例如非小细胞肺癌细胞)，甲状腺癌细胞，多发性骨髓瘤细胞，睾丸癌细胞，乳头状癌细胞，结肠癌细胞，胰腺癌细胞，卵巢癌细胞，宫颈癌细胞，中枢神经系统癌细胞，骨源性肉瘤细胞，肾癌细胞，肝细胞癌细胞，膀胱癌细胞(例如移行细胞癌细胞)，胃癌细胞，头颈鳞癌细胞，黑素瘤细胞，白血病细胞，子宫内膜癌细胞，和结肠腺瘤细胞。在一个实施方案中，本发明的方法所靶向的细胞是高度增殖性和/或增生性细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法所靶向的细胞是发育异常细胞。在还有另一个实施方案中，本发明的方法所靶向的细胞是转移性细胞。
本发明的方法可进一步包含别的治疗步骤。例如，在一个实施方案中，该方法进一步包含将被IE定的细胞和/或组织(例如癌细胞)暴露于福射处理(radiation treatment)或化疗剂的步骤。在一个方面，本发明提供了如下的方法，其包括与有效量的另一种治疗剂组合地施用有效量的抗hepsin抗体，所述另一种治疗剂诸如抗血管发生剂、另一抗体、化疗剂、细胞毒剂、免疫抑制剂、前体药物、细胞因子、细胞毒性放疗、类固醇、止吐药、癌症疫苗、镇痛药、或生长抑制剂。例如，与抗癌剂或抗血管发生剂组合地使用抗hepsin抗体以治疗各种赘生性或非赘生性疾患。根据要治疗的具体癌症适应证，本发明的组合疗法可以与别的治疗剂诸如化疗剂或别的疗法诸如放疗或手术组合。许多已知的化疗剂可以在本发明的组合疗法中使用。优选地，会使用那些作为具体适应证的标准治疗的化疗剂。要组合使用的每种治疗剂的剂量或频率优选与相应药剂在没有其它药剂的情况中使用时的剂量或频率相同、或小于相应药剂在没有其它药剂的情况中使用时的剂量或频率。在另一个方面,本发明提供了本文所述任何抗hepsin抗体,其中该抗hepsin抗体包含可检测标记物。在另一个方面,本发明提供了本文所述任何抗hepsin抗体与hepsin的复合物。在有些实施方案中，该复合物是在体内的或在体外的。在有些实施方案中，该复合物包含癌细胞。在有些实施方案中，所述抗hepsin抗体是可检测标记的。附图简述图I :抗h印sin抗体的重链和轻链HVR环序列。该图显示重链HVR序列，H1、H2和H3，及轻链HVR序列，LI、L2和L3。序列编号方式如下:克隆25 (HVR-Hl是SEQ ID NO:4 ；HVR-H2 是 SEQ ID NO: 5 ;HVR_H3 是 SEQ ID NO: 6 ;HVR_L1 是 SEQ ID NO: I ;HVR_L2 是 SEQ IDNO:2 ；HVR-L3是SEQ ID NO:3);氨基酸位置是如下文所述依照Kabat编号系统给编号的。图2A、2B、和3描绘了例示性的受体人共有框架序列，用于以如下序列标识符实施本发明。重链可变域(VH)共有框架(图2A、2B)人VH亚组I共有框架减去Kabat CDR (分别为SEQ ID NO: 21-23和16)
人VH亚组I共有框架减去延伸的高变区(分别为SEQ ID NO: 24_25、23和16 ;24-26 和 16 ;及 24-25,27 和 16)人VH亚组II共有框架减去Kabat CDR (分别为SEQ ID NO: 28-30和16)人VH亚组II共有框架减去延伸的高变区(分别为SEQ ID NO: 31_32、30和16 ;31-33 和 16 ;及 31-32,34 和 16)人VH亚组II共有框架减去延伸的人VH亚组III共有框架减去Kabat CDR (分别为SEQ ID NO: 35-37和16)人VH亚组III共有框架减去延伸的高变区(分别为SEQ ID NO: 14_15、37和16 ;14-15,38 和 16 ;及 14-15,43 和 16) 人VH 受体框架减去 Kabat CDR (分别为 SEQ ID N0:39、36、40 和 16)人VH受体框架减去延伸的高变区(分别为SEQ ID NO: 14-15,40 16 ;及14-15、41 和 16)人VH 受体 2 框架减去 Kabat CDR (分别为 SEQ ID N0:39、36、42 和 16)人VH受体2框架减去延伸的高变区(分别为SEQ ID NO: 14-15,42和16 ;14_15、44 和 16 ;及 14-15,48 和 16)轻链可夺域(VL)共有框架(图3)人VLk亚组I共有框架(分别为SEQ ID NO: 17-20)人VL K亚组II共有框架(分别为SEQ ID NO: 49-51和20)人VL K亚组111共有框架(分别为SEQ ID NO: 52-54和20 )人VL K亚组IV共有框架(分别为SEQ ID NO: 55-57和20)图4描绘了 huMAb4D5-8轻链(以出现的次序，分别为SEQ ID NO: 17-18,58和20)和重链(以出现的次序，分别为SEQ ID N0:14-15、48和16)的框架区序列。以上标/粗体表示的数字指出依照Kabat的氨基酸位置。图5描绘了 huMAb4D5-8轻链(以出现的次序，分别为SEQ ID NO: 17-20)和重链(以出现的次序，分别为SEQ ID NO: 14-15,43和16)的修饰的/变异的框架区序列。以上标/粗体表示的数字指出依照Kabat的氨基酸位置。图6描绘了抗h印sin抗体单抗25重链可变区(SEQ ID NO: 10)和轻链可变区(SEQID NO:9)。图7 :天然人hepsin的氨基酸序列的一个实施方案。图8A和B :天然人h印sin的氨基酸序列的另一个实施方案。图9 :3，4- 二氯-异香豆素(DCI)对h印sin的灭活。A.将h印sin与浓度渐增的DCI —起温育40分钟后针对S2765底物的酶活性的浓度依赖性抑制。B.依照(Powers etal.，1989)，DCI的化学结构及其与h印sin的潜在加合物。图10 =KDl与抗h印sin Fab噬菌体竞争对h印sin的结合。浓度渐增的KDl存在下Fab25卩遼菌体对hepsin的结合。图11 :Fab25对人和鼠hepsin酶活性的抑制。将人(hu)和鼠(mu)hepsin与Fab25或对照Fab (ctrl Fab) 一起温育40分钟，之后添加S2765底物。在动力学微量板读数仪上测量初始线性速度，并将酶活性表述为分数活性(vi/vo)。图12 :Fab25的特异性。将Fab25 (I ii M)与h印sin和9种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶一起温育40分钟，之后添加合成的对硝基苯胺(pNA)底物。在动力学微量板读数仪上测量初始线性速度，并将酶活性表述为分数活性(vi/vo)。图13 :Fab25对h印sin的大分子底物加工的抑制。A. Fab25对uPA原活化的抑制。在两阶段酶测定法中测定Fab25对h印sin介导的uPA原加工的影响。在动力学微量板读数仪上测量初始线性速度，并将酶活性表述为分数活性(vi/vo)。通过使用uPA标准曲线，无h印sin抑制的uPA形成速率测定为0.81 ±0.22 ii M uPA/min(n=3)。对3种已知底物实施Fab25对h印sin底物加工的抑制B.因子VII (FVII) ;C. HGF原JPD.MSP原。h印sin对因子VII的切割在Fab25和对照Fab (ctrl Fab)存在或缺失下进行0. 5小时和2. 0小时，而HGF原和MSP原切割实验实施30分钟。通过SDS-PAGE (还原性条件)分析反应等分试样并对凝胶染色。图14 :延长对h印sin的暴露后，Fab25完整性的影响。Fab25中的⑶R-H3环含有能够被h印sin潜在切割的三个赖氨酸和一个精氨酸残基，但是在pH6. 0或pH 8. 0温育24 小时后没有观察到hepsin对Fab25的蛋白水解加工。通过4_20%(w/v)聚丙烯酰胺梯度凝胶上的凝胶泳动率变动来监测蛋白水解，并用考马斯亮蓝染色。图15:Fab25对DU145细胞的层粘连蛋白依赖性迁移的抑制。A.将无血清Dulbecco氏改良Eagle氏培养基中的DU145细胞(2xl04)添加至f Iuoroblok插件经预处理的上室，并允许于37° C迁移5小时。温育后，清洗非迁移细胞和培养基，并将那些迁移至滤器底部的细胞固定、用YO-PRO-I染色、并使用倒置显微镜成像。对固定有细胞的经预处理的滤器(层粘连蛋白、与hepsin共温育的层粘连蛋白、与hepsin:Fab25复合物共温育的层粘连蛋白或PBS对照)采集代表性图像。B.来自用YO-PRO底物染色的细胞的相对荧光单位(R.F.U)的测量，它们减去了参照PBS孔。用经h印sin加工的层粘连蛋白处理的DU145细胞具有与用层粘连蛋白单独处理的细胞相比显著升高的迁移。Fab25存在下h印sin对层粘连蛋白的加工缺失使得DU145迁移降低。图16 A. LnCap-34细胞中细胞表面表达的h印sin对MSP原的活化。将稳定过表达h印sin的LnCap-34细胞血清饥饿并用125I-MSP原单独或与不同抑制剂组合处理3小时。重组h印Sin(IOnM)用作阳性对照。在3小时后观察到MSP原加工与实验起点相比的显著升高。抑制剂KQLR(SEQ ID NO: 12)、KDl和抗h印sin抗体Fab25有效阻断MSP原的活化。B. LnCap-34细胞中细胞表面表达的h印sin对HGF原的活化。将LnCap-34细胞在不同浓度的Fab25(20nM - 0. 15nM)存在下用125I-HGF原处理并温育3小时。重组hepsin(IOnM)用作阳性对照。在3小时后观察到HGF原加工与实验起点相比的显著升高。抗hepsin抗体Fab25以浓度依赖性方式有效阻断HGF原的活化。图17 A.使用表面等离振子共振来测量Ab25对活性人h印sin的结合亲和力。对捕捉有Ab25的CM5生物传感器芯片注射h印sin的连续稀释液(0. 39nM至200nM)注射3分钟，并监测解离15分钟。实验数据的拟合给出平衡解离常数速率(KD)10.6nM。B.因为Ab25对h印sin原的结合展现出快速的动力学，所以通过稳态亲和力测量法测量结合亲和力。对捕捉有Ab25的CM5生物传感器芯片注射h印sin原的连续稀释液(195nM至80 y M) 2分钟。通过稳态分析自Req针对hepsin原浓度的曲线图确定平衡解离速率(KD=5. 52 y M)。图18 Fab25结合活性hepsin的等温滴定测热实验。结合反应是放热的，而且结合的化学计量为I : 1，如预测的。来自ITC的解离常数(Kd)为6. InM,与先前来自BIAcore的数据相关性极好。结合的洽(AH)和熵(TAS)为-27. 5kcal/mol和-16. 3kcal/mol,显示了该结合是焓驱动的，具有不利的熵。发明详述 本文中的发明提供了抗hepsin抗体,其对于例如与hepsin的表达和/或活性(诸如升高的表达和/或活性或不想要的表达和/或活性)有关的疾病状态的治疗或预防是有用的。在有些实施方案中，本发明的抗体用于治疗肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。在另一个方面，本发明的抗h印sin抗体作为用于h印sin的检测和/或分离，诸如各种组织和细胞类型中hepsin的检测的试剂找到了效用。本发明进一步提供了制备和使用抗hepsin抗体的方法,及编码抗hepsin抗体的多核苷酸。通用技术本文中描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通常利用常规方法得以采用，诸如例如下列文献中记载的广泛应用的方法Samtoooket al. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd. edition(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y ;CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(F. M. Ausubel, et al. eds. , (2003))；丛书 METHODS IN ENZYM0L0GY(AcademicPress, Inc.) : PCR2:A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Tayloreds. (1995)) ；Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, ALAB0RAT0RY MANUAL ;及 ANIMALCELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))。定义“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(I)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)及使用Coomassie蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。“分离的”核酸分子指已经鉴定且与核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该核酸(例如抗体编码核酸)的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。术语“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式，，及其变体指 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)中的抗体编辑用于重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准” Kabat编号序列比对同源区来确定。短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值(通常一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体)之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较抗体该数值的函数，所述两个数值之间的差异优选小于约50%、优选小于约40%、优选小于约30%、优选小于约20%、或优选小于约10%。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。希望Kd是1x10'1x10'5x10'1x10'3xl0_9、5x10_9、或甚至1x10,或更强。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速地结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方案。在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的125I标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen等，J MolBiol 293:865-881 (1999)) o 为了确定测定条件，用 50mM 碳酸钠(pH 9. 6)中的 5 y g/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2%(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23° C)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc #269620)中，将IOOpM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab混合(例如与Presta等,CancerRes. 57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间(例如65个小时)以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温(例如I小时)。然后除去溶液，并用含0. 1% Tween-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150 ii I/孔闪烁液(MicroScint-20; Packard),然后在Topcount伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ)在 25 ° C 使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸钠pH 4. 8将抗原稀释至5 u g/ml (约0. 2 ii M)，然后以5 iil/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25° C以约25 u I/分钟的流速注入在含0. 05% Tween 20的PBS (PBST)中两倍连续稀释的Fab (0. 78nM至500nM)。在一些实施方案中，对表面等离振子共振测定法使用下述修改将抗体固定化至CM5生物传感器芯片以实现大约400RU，并为了动力学测量，以约30ul/min的流速注射靶蛋白(例如h印sin-IIIb或-IIIc)在25° C的PBST缓冲液中的两倍连续稀释液(始于67nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcoreEvaluation Software 3. 2版)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(km)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率k Jkm计算。参见例如Chen，Y.等，J Mol Biol293:865-881 (1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过IO6 M—1 S—1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-f low equipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7. 2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25° C的荧光发射强度(激发=295nm ;发射=340nm, 16nm带通)的升高或降低。依照本发明的“结合速率”(on-rate,rate of association, association rate)或“kp”也可通过上文所述相同的表面等离振子共振技术使用BIAcOreTM-2000或BIAcoreTm-3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway, NJ)在25° C使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应 单位(RU)来测定。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5, BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸钠pH 4. 8将抗原稀释至5 y g/ml (约0. 2 y M)，然后以5 Ul/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25° C以约25 Ul/分钟的流速注入在含0. 05%Tween 20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0. 78nM至500nM)。在一些实施方案中，对表面等离振子共振测定法使用下述修改将抗体固定化至CM5生物传感器芯片以实现大约400RU，并为了动力学测量，以约30ul/min的流速注射靶蛋白(例如h印sin-IIIb或-IIIc)在25° C的PBST缓冲液中的两倍连续稀释液(始于67nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software 3. 2版)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kj和解离速率(kf)。平衡解离常数(Kd)以比率kf/km计算。参见例如Chen, Y.等，J Mol Biol 293:865-881(1999)。然而，如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过IO6 M-1 S—1，那么结合速率优选使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7. 2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25° C的荧光发射强度(激发=295nm ;发射=340nm, 16nm带通)的升高或降低。术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰 诸如例如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如a端基异构核酸(anomericnucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体或半固体支持物。5’和3’末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2’ -氧-甲基、2’ -氧-烯丙基、2’ -氟-或2’ -叠氮-核糖，碳环糖类似物，a -端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S (“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S (“二硫代酸酯”(dithioate) )、(0)NR2 (“酰胺酯”(amidate) )、P (0) R、P (0) OR’、CO 或 CH2 (“ 甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R’各自独立为H或者取代的或未取代的烃基(1_20个C)，任选含有醚(-0-)连接、芳基、烯基、环烃基、环烯基或芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。关于肽或多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量比对的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的，其中下文表A中提供了 ALIGN-2程序的完整源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyright Office, Washington D. C.，20559)，并以美国版权注册号 TXU510087 注册。公众可通过 Genentech 公司(South San Francisco, California)得到 ALIGN-2 程序，或者可以自例如W02007/001851中提供的源代码来汇编。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIX V4. OD上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算分数X/Y 乘 100其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一丨I"生。在一些实施方案中，两种或更多种氨基酸序列是至少50%、60%、70%、80%、或90%相同的。在一些实施方案中，两种或更多种氨基酸序列是至少95%、97%、98%、99%、或甚至100%相同的。除非另有具体说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。如本文中所使用的，除非另有明确的或上下文说明，术语“h印sin”指任何天然的或变异的hepsin多肽。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短形式(例如胞外结构域序列或跨膜亚基序列)、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。术语“野生型h印sin”通常指包含天然存在h印sin蛋白质的氨基酸序列的多肽。术语“野生型hepsin序列”通常指在天然存在hepsin中找到的氨基酸序列。在一个实施方案中，天然序列h印sin多肽包含SEQ ID N0:46的氨基酸序列(见图7)。在一些实施方案中，天然序列hepsin多肽包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列(见图8)。“hepsin多肽变体”或其变异意指与本文中所公开的天然序列hepsin多肽序列具有至少约80%氨基酸序列同一丨丨生的hepsin多肽,一般是本文中所定义的活性hepsin多肽。此类hepsin多肽变体包括例如在天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的hepsin多肽。通常，hepsin多肽变体与本文中所公开的天然序列hepsin多肽序列具有至少约80%的氨基酸序列同一性，或者至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的氨基酸序列同一性。通常，hepsin变异多肽的长度为至少约10个氨基酸，或者长度为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600 个氨基酸，或更多。任选的是,hepsin变异多肽与天然hepsin多肽序列相比具有不超过一处保守氨基酸替代,或者与天然h印sin多肽序列相比具有不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10处保守氨基酸替代。“酪氨酸激酶抑制剂”指一定程度抑制酪氨酸激酶(诸如h印sin受体)的酪氨酸激酶活性的分子。
“抑制”指与参照相比减小或降低活性、功能、和/或量。蛋白质“表达”指基因中编码的信息转换成信使RNA(mRNA)，然后转换成蛋白质。
在本文中，“表达”感兴趣蛋白质(诸如hepsin)的样品或细胞指其中测定出存在编码该蛋白质的mRNA或蛋白质(包括其片段)的样品或细胞。“免疫偶联物”(可互换地称作“抗体-药物偶联物”或“ADC”)指抗体偶联至一种或多种细胞毒剂，诸如化疗剂，药物，生长抑制剂，毒素(例如蛋白质毒素，细菌，真菌，植物，或动物起源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即放射偶联物)。“阻断性”抗体或抗体“拮抗剂”指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体完全抑制抗原的生物学活性。“裸抗体(裸露的抗体)”指未偶联异源分子诸如细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。
具有指定抗体的“生物学特征”的抗体指拥有该指定抗体区别于其它结合相同抗原的抗体的一项或多项生物学特征的抗体。为了筛选结合抗原上感兴趣抗体所结合的表位的抗体，可以实施常规交叉阻断测定法，诸如 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlowand David Lane (1988)中所记载的。为了延长包含本发明氨基酸序列的抗体或多肽的半衰期，可如例如美国专利No. 5，739，277中所记载的将补救受体结合表位附着于抗体(尤其是抗体片段)。例如，可以将编码补救受体结合表位的核酸分子与编码本发明多肽序列的核酸在同一读码框内相连接，使得由改造后的核酸分子编码的融合蛋白包含补救受体结合表位和本发明的多肽序列。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgGp IgG2, IgG3*IgG4)的Fe区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位(例如Ghetie et al. , Ann.Rev. Immunol. 18:739-766(2000),表I)。其Fe区中有替代且血清半衰期延长的抗体还记载于 TO00/42072 ;W0 02/060919 ；Shields et al. , J. Biol. Chem. 276:6591-6604(2001)；Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004))。在另一个实施方案中，还可以通过例如附着其它多肽序列来延长血清半衰期。例如，可以将在本发明的方法中有用的抗体或其它多肽附着于血清清蛋白或血清清蛋白中结合FcRn受体或血清清蛋白结合肽的那部分，使得血清清蛋白结合该抗体或多肽，例如此类多肽序列披露于W001/45746。在一个优选的实施方案中，待附着的血清清蛋白肽包含氨基酸序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO: 13)。在另一个实施方案中，Fab的半衰期通过这些方法得到了延长。血清清蛋白结合肽序列还可参见Denniset al.，J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002)。“片段”指多肽和核酸分子的一部分，其优选含有参比核酸分子或多肽全长的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更多。所述片段可含有 10、20、30、40、50、60、70、80、90、或 100、200、300、400、500、600、或更多个核苷酸，或者 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、190、200 或更多个氨基酸。术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体(例如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某些抗体片段(如本文中更为详细描述的)。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区(CDR)或高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取￠-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成￠-折叠片结构一部分的三个⑶R连接。每条链中的⑶R通过FR非常接近地保持在一起，并与另一条链的⑶R —起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版，National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的(细胞)毒性中抗体的参与。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及剩余的“Fe”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab' )2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，此区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连，使得轻链和重链能在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，各可变域的三个⑶R相互作用而在VH-VL 二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CHl)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于重链CHl结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab’的称谓。？(&13’)2抗体片段最初是作为在Fab’片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab’片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(K)和拉姆达(入)。根据其重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1' IgG2,IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作a、S、e、Y和U。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fe区的抗体片段，保留与Fe区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fe序列相连。术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变 和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区三个在VH中(HI、H2、H3)，三个在VL中(LI、L2、L3)。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(O)R)是以序列变异性为基础的,而且是最常用的(Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第 5版，Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991))。Chothia 改为指结构环的位置(Chothia 和 Lesk, J. Mol.Biol. 196:901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触(contact) ”高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。
权利要求
1.一种分离的抗hepsin抗体，其中单价形式的该抗体以小于或等于IOnM或更好的亲和力结合人hepsin,其中单价形式的该抗体以小于或等于330nM的亲和力结合小鼠hepsin,且其中该抗体结合复合物中存在的hepsin,该复合物包含hepsin和结合人hepsinSI亚位点的丝氨酸蛋白酶抑制剂。
2.权利要求I的抗体，其中该丝氨酸蛋白酶抑制剂为3，4-二氯-异香豆素(DCI)。
3.权利要求I的抗体，其中该抗体结合hepsin的库尼茨(Kunitz)域结合区。
4.权利要求I的抗体，其中该抗体阻断底物结合hepsin亚位点2和/或hepsin亚位点3。
5.权利要求I的抗体，其中该抗体抑制hepsin介导的巨噬细胞刺激性蛋白(MSP)活 化。
6.权利要求I的抗体，其中该抗体抑制层粘连蛋白依赖性细胞迁移。
7.权利要求I的抗体，其中该抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个、和/或六个选自下组的高变区(HVR)序列 ID NO: I)； (b)HVR-L2，其包含序列SASSLYS(SEQ ID NO:2)； (c)HVR-L3，其包含序列QQYYSSYYLLT(SEQ ID NO:3)； (d)HVR-Hl，其包含序列GFNFSYSYMH(SEQ ID NO:4)； (e)HVR-H2，其包含序列ASIYSYYGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:5);和(f)HVR-H3，其包含序列ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY(SEQ ID NO:6)。
8.权利要求7的抗体，其中该抗体包含(a)HVR-H3，其包含序列ARSDSffSYKSGYTQKIYSKGLDY(SEQ ID NO:6) ; (b)HVR-L3，其包含序列 QQYYSSYYLLT(SEQ IDNO: 3);和(c) HVR-H2，其包含序列 ASIYSYYGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 5)
9.权利要求7的抗体，其中该抗体包含(a)HVR-Hl，其包含序列GFNFSYSYMH (SEQ IDNO: 4) ; (b)HVR-H2，其包含序列 ASIYSYYGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 5);和(c) HVR-H3，其包含序列 ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY(SEQ ID NO:6)。
10.权利要求9的抗体，其进一步包含(a)HVR-Ll，其包含序列RASQSVSSAVA (SEQID NO: I) ; (b)HVR-L2，其包含序列 SASSLYS (SEQ ID NO: 2);和(c)HVR_L3，其包含序列QQYYSSYYLLT(SEQ ID NO:3)。
11.权利要求7的抗体，其中该抗体包含(a)HVR-Ll，其包含序列RASQSVSSAVA (SEQID NO: I) ;(b)HVR-L2，其包含序列 SASSLYS (SEQ ID NO: 2);和(c)HVR_L3，其包含序列QQYYSSYYLLT(SEQ ID NO:3)。
12.权利要求9或11的抗体，其进一步包含图3，4，5，或6所示重链可变域或轻链可变域框架序列。
13.权利要求I的抗体，其包含(a)VH序列，其与氨基酸序列SEQ ID N0:10具有至少95%序列同一性；或(b) VL序列,其与氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少95%序列同一性；或(c) (a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
14.权利要求13的抗体，其包含VH序列SEQID NO: 10。
15.权利要求13的抗体，其包含VL序列SEQID NO:9。
16.权利要求13的抗体，其包含VH序列SEQID NO: 10和VL序列SEQ ID NO:9。
17.前述权利要求任一项的抗体，其为全长IgGl抗体。
18.前述权利要求任一项的抗体,其中该抗体包含人K亚组共有框架序列。
19.前述权利要求任一项的方法，其中该抗体包含重链人亚组III共有框架序列。
20.分离的核酸，其编码前述权利要求任一项的抗体。
21.宿主细胞，其包含权利要求20的核酸。
22.—种用于生成抗体的方法，包括培养权利要求21的宿主细胞，使得该抗体生成。
23.权利要求22的方法，其进一步包含自该宿主细胞培养物回收该抗体。
24.一种免疫偶联物，其包含权利要求I的抗体和细胞毒剂。
25.一种药物配制剂，其包含权利要求I的抗体和药学可接受载体。
26.权利要求25的药物配制剂，其进一步包含别的治疗剂。
27.权利要求I的抗体，其作为药物使用。
28.权利要求I的抗体，其供治疗癌症中使用。
29.权利要求I的抗体,其供治疗免疫病症中使用。
30.权利要求I的抗体，其供抑制细胞迁移中使用。
31.权利要求I的抗体，其供抑制hepsin酶活性中使用。
32.权利要求I的抗体在制备药物中的用途。
33.权利要求32的用途，其中该药物用于治疗癌症。
34.权利要求32的用途，其中该药物用于治疗免疫病症。
35.权利要求32的用途，其中该药物用于抑制细胞迁移或抑制hepsin酶活性。
36.一种生成抗丝氨酸蛋白酶抗体的方法，其包括选择结合复合物中存在的丝氨酸蛋白酶的抗体，该复合物包含(a)丝氨酸蛋白酶和(b)结合SI亚位点的丝氨酸蛋白酶抑制剂的。
37.权利要求36的方法，其中该丝氨酸蛋白酶为hepsin。
38.权利要求36的方法，其中该丝氨酸蛋白酶抑制剂为3，4-二氯-异香豆素。
39.权利要求36的方法,其中该丝氨酸蛋白酶抑制剂结合hepsin催化性氨基酸残基Serl95 和 His57,由此 hepsin 被灭活。
40.权利要求36的方法，其中在选择该抗体之前，将该抗体与丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂一起温育。
41.权利要求37的方法,其进一步包括选择与库尼茨域竞争hepsin结合的抗体。
42.权利要求41的方法，其中该库尼茨域为KD1。
全文摘要
本发明提供了hepsin抗体，及包含这些抗体的组合物和使用这些抗体的方法。
文档编号C07K16/44GK102648211SQ201080055073
公开日2012年8月22日 申请日期2010年10月21日 优先权日2009年10月22日
发明者D.科赫霍弗, P.M.莫兰, R.甘尼森, 张映楠 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司