治疗血管发生相关的眼部疾病的组合物和方法

专利名称：治疗血管发生相关的眼部疾病的组合物和方法
技术领域：
本发明一般涉及利用低剂量的解聚素变体治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的组合物和方法。
背景技术：
整联蛋白是异源二聚体的基质受体，其将细胞锚定至底物并且将外形上产生的信号从质膜的一端传递至另一端。整联蛋白ανβ 3是为玻璃体结合蛋白的受体的一类整联蛋白。整联蛋白ανβ 3在大多数正常细胞包括肠细胞、血管细胞和平滑肌细胞中以低水平表达。表达高水平的这一异二聚体分子的细胞类型包括骨吸收破骨细胞、活化的巨噬细胞、一小部分嗜中性粒细胞、血管生成内皮细胞和迁移的平滑肌细胞。整联蛋白ανβ3体内和体外都参与破骨细胞介导的骨吸收，以及新的血管形成。这一异源二聚体分子识别骨基质
解聚素是与血小板和其他细胞包括血管内皮细胞和一些肿瘤细胞上表达的整联蛋白allbi3 3、a5i31和ανβ3特异性结合的低分子量的包含RGD的肽家族。不同的解聚素是本领域中已知的，包括马来蝮蛇蛇毒蛋白(rhodostomin)及其变体，其包含但不限于ARLDDL。血管发生相关的眼部疾病是与来自预先存在的血管的新的血管生长相关的眼部疾病。这些疾病包括但不限于年龄相关的黄斑退行性病变、糖尿病性视网膜病、角膜新血管形成疾病、视网膜血管瘤增殖、息肉样脉络膜血管病变、缺血诱导的新血管形成视网膜病、高度近视和早产儿视网膜病。因为现有的药物在血管发生相关的眼部疾病的治疗中并不是令人满意地有效，所以有对这些疾病的新的治疗的需要。

发明内容
通常，本发明涉及利用低剂量的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的组合物和方法。术语“低剂量”是指比常规用于血管发生相关的眼部疾病的治疗的那些更低的剂量。优选地，“低剂量”是每眼约O. OOOlpg至约300ug,更优选地每眼约O. 005pg至约200ug以及甚至更优选地每眼约O. OOlpg至约IOOug的适于本发明的目的的马来蝮蛇蛇毒
蛋白变体。剂量可作为每周一次、每月一次、每季度一次或每年一次的剂量施用于有需要的受治疗者。优选地，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体与人类血清白蛋白(HSA)或HSA的变体融合。如本申请中通篇所使用的，术语“马来蝮蛇蛇毒蛋白变体”涵盖与可聚乙二醇化或以其他方式修饰的HSA或HSA变体融合的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。适于本发明中使用的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含选自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO:16的氨基酸序列或者所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐。SEQ ID NO 1表示“ARGDDP”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其是具有RGD基序变体48ARGDDP53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。SEQ ID NO :2表示“ARGDDV”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其是具有RGD基序变体48ARGDDV53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。SEQ ID NO :3表示“ARGDDL”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其是具有RGD基序变体48ARGDDL53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。SEQ ID NO :4表示“PRGDDL”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其是具有RGD 基序变体48PRGDDL53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。SEQ ID NO :5表示“ARGDDM”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其是具有RGD基序变体48ARGDDM53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。SEQ ID NO :6表示“PRGDDM”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其是具有RGD基序变体48PRGDDM53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。SEQ ID NO :7表示“PRLDMP”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其是具有RGD基序变体48PRLDMP53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。SEQ ID NO :8表示“PRLDDL”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其是具有RGD基序变体48PRLDDL53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。SEQ ID NO :9表示“ARLDDL”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其是具有RGD基序变体48ARLDDL53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。SEQ ID NO 10表示“PRIDMP”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其是具有RGD基序变体48PRIDMP53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。SEQ ID NO : 11表示“PRHDMP”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其是具有RGD基序变体48PRHDMP53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。SEQ ID NO 12表示“PRGDNP”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其是具有RGD基序变体48PRGDNP53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。SEQ ID NO 13表示“PRGDGP”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其是具有RGD基序变体48PRGDGP53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。SEQ ID NO : 14表示与HSA轭合的“ARLDDL”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO : 15表示与HSA变体轭合的“ARLDDL”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其中野生型HSA氨基酸序列的位点34处的半胱氨酸残基已经由丝氨酸代替。由SEQID NO : 15表示的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体还可称为HSA(C34S)-ARLDDL融合蛋白。所述蛋白是下列的融合产物a)HSA变体，其中HSA氨基酸序列的位点34处的半胱氨酸残基已经由丝氨酸代替，b)接头氨基酸序列和c) ARLDDL马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。SEQ ID NO : 16表示与HSA变体轭合的“ARLDDL”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列，其中野生型HSA氨基酸序列的位点34处的半胱氨酸残基已经由丙氨酸代替。相应地，在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的组合物，所述组合物包含约O. OOOlpg至约300ug的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含选自SEQ IDNO :1至SEQ ID NO 16的氨基酸序列。
最优选地，适于本发明的目的的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含SEQ ID NO :9或SEQID NO 15o优选地,本发明的组合物包含约O. 005pg至约200ug以及更优选地约O. OOlpg至约IOOug的适于本发明的目的的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。在一个实施方案中，本发明的组合物被配制为局部组合物。在另一个实施方案中，本发明的组合物适于眼内注射(即，至眼中)。在另一个实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的方法，所述方法包括向有需要的受治疗者施用所述受治疗者的每眼约O. OOOlpg至约300ug的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含选自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 16的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的方法，所述方法包括向有需要的受治疗者施用所述受治疗者的每眼约O. OOOlpg至约300ug的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含选自SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 15的氨基酸序列。在更优选的实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的方法，所述方法包括向有需要的受治疗者施用所述受治疗者的每眼约O. 0005pg至约200ug的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含选自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 16的氨基酸序列。在甚至更优选的实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的方法，所述方法包括向有需要的受治疗者施用所述受治疗者的每眼约O. OOlpg至约IOOug的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含选自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 16的氨基酸序列。优选地，本发明的方法包括施用所述受治疗者每眼约O. 005pg至约300ug以及更优选地约O. OOlpg至约IOOug的适于本发明的目的的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。在一个实施方案中，本发明的方法包括通过对所述受治疗者的玻璃体内注射施用适于本发明的目的的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。在一个实施方案中，所述血管发生相关的眼部疾病选自由年龄相关的黄斑退行性病变(AMD)、糖尿病性视网膜病、角膜新血管形成疾病、视网膜血管瘤增殖、息肉样脉络膜血管病变、年龄相关的缺血诱导的新血管形成视网膜病、高度近视和早产儿视网膜病组成的组。在另一个实施方案中，本发明的方法还包括施用治疗上有效的量的另一种活性齐U。其他活性剂可在施用适于本发明的目的的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体之前，之时或之后施用。优选地，其他活性剂选自由VEGF拮抗剂、抗血管发生剂、抗炎剂和类固醇组成的组。本发明的组合物还可包括药学上可接受的载体。从结合下文附图的下文不同实施方案的描述来看这些和其他方面将是明显的，尽管其中可进行变化和修改而不背离本公开内容的新的概念的精神和范围。应当理解的是前述的一般描述和下文的详细描述都仅是示例性和说明性的并且不限制所要求的发明。


图I是显示氧诱导视网膜病的小鼠模型中的血管发生(B)、用ARLDDL马来蝮蛇蛇毒蛋白变体治疗的氧诱导视网膜病小鼠中减少的血管发生(C)和用HSA-ARLDDL马来蝮蛇蛇毒蛋白变体治疗的氧诱导视网膜病小鼠中减少的血管发生的一套四张照片。照片(A)是常氧(对照组)。箭头指示血管概况(BVP)。图IB是显示用ARLDDL马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或HSA-ARLDDL马来蝮蛇蛇毒蛋白变体治疗的氧诱导视网膜病的小鼠模型中每个视网膜切片的减少的血管数目的图。图IC是显示用ARLDDL马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或HSA-ARLDDL马来蝮蛇蛇毒蛋白变体治疗的氧诱导视网膜病的小鼠模型中每个视网膜切片的减少的内皮细胞数目的图。图2A是显示用HSA-ARLDDL马来蝮蛇蛇毒蛋白变体以10pg、0. Ipg和O. OOlpg的 量治疗的氧诱导视网膜病的小鼠模型中每个视网膜切片的减少的血管数目的图。图2B是显示用ARLDDL马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或HSA-ARLDDL马来蝮蛇蛇毒蛋白变体以10pg、0. Ipg和O. OOlpg的量治疗的氧诱导视网膜病的小鼠模型中每个视网膜切片的减少的内皮细胞数目的图。图3A是显示与用Avastin 治疗的氧诱导视网膜病小鼠相比用HSA-ARLDDL马来蝮蛇蛇毒蛋白变体治疗的氧诱导视网膜病的小鼠模型中减少的血管数目/视网膜切片的图。图3B是显示与用Avastin⑧治疗的氧诱导视网膜病的小鼠相比用HSA-ARLDDL马来蝮蛇蛇毒蛋白变体治疗的氧诱导视网膜病的小鼠模型中减少的内皮细胞数目/视网膜切片的图。图4A是显示与用Avastin 治疗的氧诱导视网膜病的小鼠相比用HSA-ARLDDL马来蝮蛇蛇毒蛋白变体治疗的氧诱导视网膜病的小鼠模型中减少的血管数目/视网膜切片的图。图4B是显示与用Avastin 治疗的氧诱导视网膜病的小鼠相比用HSA-ARLDDL马来蝮蛇蛇毒蛋白变体治疗的氧诱导视网膜病的小鼠模型中减少的内皮细胞数目/视网膜切片的图。发明详述现在详细描述本发明的不同实施方案。如说明书和权利要求中通篇所用的，除非上下文以另外的方式清楚地表明，“一(a)”、“一(an)”和“该(the) ”的含义包括复数引用。同样，如说明书和权利要求中通篇所用的，除非上下文以另外的方式清楚地表明，“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”。此外，下文中更具体地定义本说明书中所使用的一些术语。定义在本发明的上下文中以及在每个术语所使用的具体的上下文中，本说明书中所使用的术语通常具有它们在本领域中的普通含义。下文或者在说明书中的其他地方讨论了用于描述本发明的某些术语，为医师提供了关于本发明的描述的另外的指导。提供了某些术语的同义词。一个或多个同义词的列举不排除其他同义词的使用。本说明书中任何地方的实例(包括本文所讨论的任何术语的实例)的使用仅为说明性的并且不以任何方式限制本发明或任何示例性的术语的范围和含义。本发明不限于本说明书中所给出的不同实施方案。除非以另外的方式定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的一名一般技术人员通常所理解的相同的含义。在矛盾的情况下，以本文件包括定义为准。术语“左右”、“约”或“近似”通常意指在所给出的值或范围的20个百分比之内，10个百分比之内，5、4、3、2或I个百分比之内。给出的以数字表示的数量是近似的，意指即使没有明确表明也可意味着术语“左右”、“约”或“近似”。本申请通篇中术语“肽”和“蛋白”可交换使用。
本申请通篇中术语“低剂量”和“低量”可交换使用。术语“受治疗者”和“哺乳动物”包括但不限于人类。术语“治疗”是指哺乳动物中疾病的救济方法的任何施用或应用并且包括抑制疾病、停止其发展、缓解疾病，例如通过引起退行，或者恢复或修复失去缺少的或有缺陷的功能，或者激活无效的程序。术语包括在哺乳动物中获得所期望的药理学和/或生理学作用，覆盖病理病况或病症的任何治疗。作用可以是就完全或部分预防病症或其症状而言预防性的和/或可以是就部分或完全治愈病症和/或可归因于病症的不良反应而言治疗性的。其包括(I)在易感染病症但是还没有症状的受治疗者中预防疾病的发生或复发，(2)抑制疾病，例如停止其发展，(3)结束或终止病症或至少其相关症状以使宿主不再遭受所述病症或其症状的痛苦，诸如引起所述病症或其症状的退化，例如，通过恢复或修复失去的、缺少的或有缺陷的功能或激活无效的程序，或(4)缓解、减轻或改善病症或与其有关的症状，其中改善以广义使用以指至少参数例如炎症、疼痛和/或肿瘤大小的量值上的减小。术语“药学上可接受的载体”是指任何常规类型的非毒性的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、制剂助剂或赋形剂。药学上可接受的载体在制剂中所使用的给药量和浓度是对接受者无毒性的并且是可与制剂的其他成分相容的。术语“组合物”是指通常包含载体例如在本领域中常规的并且适于为了治疗、诊断或预防目的施用至受治疗者中的药学上可接受的载体或赋形剂的混合物。其可包括细胞培养物，其中马来蝮蛇蛇毒蛋白变体存在于细胞或培养基中。例如，口服施用的组合物可形成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放的制剂、口服灌洗剂或粉末。术语“血管发生相关的眼部疾病”是指与来自预先存在的血管的新的血管的生长有关的任何眼睛的疾病。这些疾病包括但不限于年龄相关的黄斑退行性病变、糖尿病性视网膜病、角膜新血管形成疾病、视网膜血管瘤增殖、息肉样脉络膜血管病变、缺血诱导的新血管形成视网膜病、高度近视和早产儿视网膜病。术语“治疗上有效的量”是指当施用于活的受治疗者时获得对活的受治疗者的所期望的作用的量。确切的量将取决于治疗的目的并且可由本领域中的一名普通技术人员使用已知的技术来确定。如本领域中已知的，对于系统递送对比局部递送、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病况的严重度的调整可能是必须的，并且可由本领域那些技术人员用例行实验来确定。术语“RGD基序变体”是指包含跨越相应的野生型序列的RGD序列的氨基酸序列例如包含马来蝮蛇蛇毒蛋白中的RGD的序列中的修改的肽。术语“ARGDDP”是指具有RGD基序变体48ARGDDP53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。数字“48”和“53”是指野生型马来蝮蛇蛇毒蛋白的氨基酸序列中这些氨基酸的位点。ARGDDP由SEQ ID NO 1 表示。术语“ARGDDV”是指具有RGD基序变体48ARGDDV53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。数字“48”和“53”是指野生型马来蝮蛇蛇毒蛋白的氨基酸序列中这些氨基酸的位点。ARGDDV由SEQ ID NO 2 表示。术语“ARGDDL”是指具有RGD基序变体48ARGDDL53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。数字“48”和“53”是指野生型马来蝮蛇蛇毒蛋白的氨基酸序列中这些氨基酸的位点。ARGDDL由SEQ ID NO 3 表示。术语“PRGDDL”是指具有RGD基序变体48PRGDDL53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。数字 “48”和“53”是指野生型马来蝮蛇蛇毒蛋白的氨基酸序列中这些氨基酸的位点。PRGDDL由 SEQ ID NO 4 表示。术语“ARGDDM”是指具有RGD基序变体48ARGDDM53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。数字“48”和“53”是指野生型马来蝮蛇蛇毒蛋白的氨基酸序列中这些氨基酸的位点。ARGDDM由SEQ ID NO 5 表示。术语“PRGDDM”是指具有RGD基序变体48PRGDDM53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。数字“48”和“53”是指野生型马来蝮蛇蛇毒蛋白的氨基酸序列中这些氨基酸的位点。PRGDDM由SEQ ID NO 6 表示。术语“PRLDMP”是指具有RGD基序变体48PRLDMP53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。数字“48”和“53”是指野生型马来蝮蛇蛇毒蛋白的氨基酸序列中这些氨基酸的位点。PRLDMP由SEQ ID NO 7 表示。术语“PRLDDL”是指具有RGD基序变体48PRLDDL53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。数字“48”和“53”是指野生型马来蝮蛇蛇毒蛋白的氨基酸序列中这些氨基酸的位点。PRLDDL由SEQ ID NO 8 表示。术语“ARLDDL”是指具有RGD基序变体48ARLDDL53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。数字“48”和“53”是指野生型马来蝮蛇蛇毒蛋白的氨基酸序列中这些氨基酸的位点。ARLDDL由SEQ ID NO 9 表示。术语“PRIDMP”是指具有RGD基序变体48PRIDMP53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。数字“48”和“53”是指野生型马来蝮蛇蛇毒蛋白的氨基酸序列中这些氨基酸的位点。PRIDMP由SEQ ID NO 10 表示。术语“PRHDMP”是指具有RGD基序变体48PRHDMP53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。数字“48”和“53”是指野生型马来蝮蛇蛇毒蛋白的氨基酸序列中这些氨基酸的位点。PRHDMP由SEQ ID NO 11 表示。术语“PRGDNP”是指具有RGD基序变体48PRGDNP53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。数字“48”和“53”是指野生型马来蝮蛇蛇毒蛋白的氨基酸序列中这些氨基酸的位点。PRGDNP由SEQ ID NO 12 表示。术语“PRGDGP”是指具有RGD基序变体48PRGDGP53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。数字“48”和“53”是指野生型马来蝮蛇蛇毒蛋白的氨基酸序列中这些氨基酸的位点。PRGDGP由SEQ ID NO 13 表示。 术语“HSA-ARLDDL”是指一种融合蛋白，其包含a)人类血清白蛋白(HSA)变体，b)接头氨基酸序列和c)具有RGD基序变体48ARLDDL53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。其由SEQ IDNO 14表示。术语“HSA (C34S) -ARLDDL”是指一种融合蛋白，其包含a)人类血清白蛋白(HSA)变体，其中野生型HSA氨基酸序列的位点34处的半胱氨酸已经由丝氨酸代替，b)接头氨基酸序列和c)具有RGD基序变体48ARL DDL53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。其由SEQ ID NO 15表不。术语“HSA (C34A) -ARLDDL”是指一种融合蛋白，其包含a)人类血清白蛋白(HSA)变体，其中野生型HSA氨基酸序列的位点34处的半胱氨酸已经有丙氨酸代替，b)接头氨基酸序列和c)具有RGD基序变体48ARLDDL53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。其由SEQ ID NO 16表不。应当理解的是本发明包括利用其中除了 ARLDDL之外的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体通过接头氨基酸序列与HSA变体融合的融合蛋白的组合物和方法。例如，适于本发明的目的的融合蛋白包括但不限于 HSA-ARGDDP、HSA (C34S) -ARGDDP、HSA (C34A) -ARGDDP、HSA-ARGDDV、HSA (C34S) -ARGDDV、HSA (C34A) -ARGDDV 以及等等。本发明的组合物和方法本发明通过引用清楚地并入专利申请美国序列号61/226，945中所公开的所有方法和马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。通常，本发明涉及利用低剂量的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体治疗血管发生相关的眼部疾病的组合物和方法。术语“低剂量”是指比常规用于血管发生相关的眼部疾病的治疗的那些更低的剂量。优选地，“低剂量”是约O. OOOlpg至约300ug，更优选地约O. 005pg至约200ug以及甚至更优选地约O. OOlpg至约IOOug的适于本发明的目的的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。齐[J量可作为单一剂量或分份剂量施用于有需要的受治疗者，只要所施用的总剂量在所提供的范围内。优选地，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体与可聚乙二醇化或以其他方式修饰的人类血清白蛋白(HSA)或HSA的变体融合。甚至更优选地，适于本发明的目的的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体选自包含选自SEQ IDNO :1至SEQ ID NO : 16的氨基酸序列的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或者所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐。在优选的实施方案中，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体与白蛋白轭合或聚乙二醇化。甚至更优选地，适于本发明的目的的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 15用于本发明的目的的最优选的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体是由SEQ ID NO 15表示的HSA (C34S) -ARLDDLo HSA-ARLDDL C34S是包含具有RGD基序48ARLDDL53的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的重组蛋白，其中所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体与人类血清白蛋白(HSA)的变体轭合。HSA(C34S)-ARLDDL对于α νβ 3整联蛋白来说是选择性的并且与野生型马来蝮蛇蛇毒蛋白相比表现出与a IIbP 3和/或α 5β I整联蛋白的减少的结合。在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的组合物，所述组合物包含约O. OOOlpg至约300ug的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含选自SEQ ID N0:1至SEQ ID NO 16的氨基酸序列。优选地,本发明的组合物包含约O. 005pg至约200ug以及更优选地约O. OOlpg至约IOOug的适于本发明的目的的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。在一个实施方案中，本发明的组合物被配制为局部组合物。在另一个实施方案中，本发明的组合物适于玻璃体内注射(即，至眼中)。在另一个实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的方法，所述方法包括向有需要的受治疗者施用所述受治疗者的每眼约O. OOOlpg至约300ug的 马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含选自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 16的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的方法，所述方法包括向有需要的受治疗者施用所述受治疗者的每眼约O. OOOlpg至约300ug的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含选自SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 15的氨基酸序列。在更优选的实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的方法，所述方法包括向有需要的受治疗者施用所述受治疗者的每眼约O. 0005pg至约200ug的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含选自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 16的氨基酸序列。在甚至更优选的实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的方法，所述方法包括向有需要的受治疗者施用所述受治疗者的每眼约O. OOlpg至约IOOug的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含选自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 16的氨基酸序列。优选地，本发明的方法包括施用所述受治疗者每眼约O. 005pg至约300ug以及更优选地约O. OOlpg至约IOOug的适于本发明的目的的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。在一个实施方案中，本发明的方法包括通过对所述受治疗者的眼内注射施用适于本发明的目的的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。在一个实施方案中，所述血管发生相关的眼部疾病选自由年龄相关的黄斑退行性病变、糖尿病性视网膜病、角膜新血管形成疾病、视网膜血管瘤增殖、息肉样脉络膜血管病变、年龄相关的缺血诱导的新血管形成视网膜病、高度近视和早产儿视网膜病组成的组。本发明的组合物可通过系统注射例如通过玻璃体内注射或静脉注射或者通过注射或应用于相关位点例如通过当所述位点在手术中暴露时直接注射或直接应用于所述位点或者通过局部应用施用于需要治疗的受治疗者。本发明的组合物还可与另一种活性剂组合使用以治疗血管发生相关的眼部疾病。因此，在一个实施方案中，治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的方法还包括向受治疗者施用另一种活性剂。优选地，其他活性剂选自由VEGF拮抗剂、抗血管发生剂、抗炎剂和类固醇组成的组。活性剂的施用可以不同的方式获得，包括口服的，含服的，经鼻的，直肠的，非胃肠道，腹膜内的、皮内的、透皮的、皮下的、静脉内的、动脉内的、心内的、心室内的、颅内的、气管内的以及鞘内的注射、肌内注射，玻璃体腔注射(即，至眼中)，局部应用，包括但不限于滴眼剂、霜剂以及乳液、植入物和吸入剂。本发明的药物组合物可作为与本领域中已知的药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂一起的制剂来提供。这些药物载体、赋形剂和稀释剂包括USP药物赋形剂列表中所列的那些。USP和NF稀释剂，由分类第2404-2406页所列，USP 24NF 19，United StatesPharmacopeial Convention Inc. , Rockville, Md. (ISBN 1-889788-03-1)。药学上可接受的赋形剂例如媒介物、佐剂、载体或稀释剂是公众可容易地获得的。而且，药学上可接受的辅助物质例如PH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂以及类似物是公众可容易地获得的。
适合的载体包括但不限于水、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇及其组合。载体可以包含另外的剂，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂或可提高制剂的有效性的佐剂。局部载体可包括液体石油、棕榈酸异丙酯、聚乙二醇、乙醇(95% )、溶于水的聚氧乙烯单月桂酸酯(5% )或溶于水的十二烷基硫酸钠(5%)。必要时，可以加入其他材料，例如抗氧化剂、保湿剂、粘度稳定以及类似的剂。也可以包括经皮渗透促进剂例如氮酮。适于本发明的目的的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体可通过将它们在水性或非水性溶剂例如蔬菜油或其他的类似的油、合成的脂肪酸甘油酯，高级脂肪酸的酯或丙二醇中溶解、悬浮或乳化并且如果需要与常规的添加剂例如增溶剂，等渗剂，悬浮剂，乳化剂，稳定剂和防腐剂一起配制为用于注射的制品。如本领域中常规的，也可使用用于口服和非胃肠递送的其他制剂。本发明的药物组合物可配制为固体、半固体、液体或气体形式的制品，例如片剂、胶囊剂、粉末、粒料、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气溶胶。以药用剂量形式，本发明的组合物可以它们的药学上可接受的盐的形式施用，或者它们也可以单独或与其他的药学上的活性化合物适当的关联以及组合使用。主题组合物根据可能的施用的方式来配制。在下文实施例中更加具体地描述本发明，所述实施例预期仅为示例性的，因为许多修饰和变化对于本领域的那些技术人员来说的显而易见的。实施例I在氧诱导视网膜病的小鼠樽型中通过ARLDDL和HSA-ARLDDL抑制视网膜中的血管如下产生小鼠中氧诱导视网膜病的动物模型。将每组与至少两只哺乳母鼠一起的7天大的小鼠分配至含有75%氧气(氧过多)或室内空气(常氧)的氧气室中。将小鼠暴露于小于300勒的12小时循环广谱光。如果哺乳母鼠死亡更换代用母鼠。在与具有氧气和氮气的Bird 3-M氧气混合器(Palm Springs,CA)相连的孵育室中培育氧气处理的小鼠，允许氧气浓度调整至75% ±2%。I. 5L/分钟的流速每天校验两次。用Beckman氧气分析仪(Model 02, Irvine, CA)监测氧气浓度。笼温维持在23°C ±2°C。将小鼠置于具有充足食物和水的氧气室中维持它们5天。从第I天至第5天氧过多暴露期间不打开室,将动物返回室内空气7天。一旦氧气处理的小鼠返回室内空气，在第5天经由玻璃体内注射施用生理盐水 2 μ I/ 眼)、ARLDDL (2ng/ 眼或 20pg/ 眼)、HSA-ARLDDL (2ng/ 眼)或抗 VEGF 抗体(2ng/眼或20pg/眼)并且在第12天处死小鼠。将每只动物的眼睛中的一只进行切片、去石蜡化并且用苏木精和伊红染色。在内层视网膜内将每个视网膜切片的血管数目计数并且包括附着于内界膜的血管。在显微照相机(Leica)上以IOOX的放大倍数进行计数。结果示于图IB中。结果证实与生理盐水处理的组相比2ng/眼和20pg/眼的剂量的ARLDDL和HSA-ARLDDL减少了每个视网膜切片的血管数目。而且，甚至在20pg/眼的非常低的剂量，ARLDDL产生了与2ng/眼的ARLDDL、2ng/眼的HSA-ARLDDL和20pg/眼的抗VEGF抗体相比每个视网膜切片的血管数目的更大的减少。由不了解相同身份的人在神经节细胞层的前部中和视网膜的内界膜上将内皮细胞计数。结果示于图IC中。结果证实2ng/眼和20pg/眼两个剂量的ARLDDL和HSA-ARLDDL都减少每个视网 膜切片的内皮细胞数目。实施例2在氧诱导视网膜病的小鼠模型中通过非常低剂暈的ARLDDL和HSA-ARLDDL抑制视网膜中的血管发生如实施例I中描述的产生小鼠中的氧诱导视网膜病的动物模型。经由玻璃体内注射施用下列量的HSA-ARLDDL 10pg/眼、O. Ipg/眼和O. OOlpg/眼，并且在第12天处死所处理的小鼠。将来自每个动物的眼睛中的一只切片、去石蜡化并且用苏木精和伊红染色。在内层视网膜内将每个视网膜切片的血管数目计数并且包括附着于内界膜的血管。在显微照相机(Leica)上以100X的放大倍数进行计数。结果示于图2A中。结果证实与用生理盐水处理的组相比每眼10pg、0. Ipg和O. OOlpg的HSA-ARLDDL减少每个视网膜切片的血管数目。由不了解相同身份的人在神经节细胞层的前部中和视网膜的内界膜上将内皮细胞计数。结果示于图2B中。结果证实与用生理盐水处理的组相比每眼10pg、0. Ipg和O. OOlpg的HSA-ARLDDL减少每个视网膜切片的内皮细胞数目。实施例3
氣诱导视网膜病的小鼠模型中通过HSA-ARLDDL对比Avastin 抑制视网膜中
的血管发生如实施例I中描述的产生小鼠中的氧诱导视网膜病的动物模型。经由玻璃体内注射施用 ARLDDL(10pg/ 眼或 O. Ipg/ 眼)或 Avastin _ (20pg/ 眼或 O. 2pg/ 眼)并且在第 12天处死所处理的小鼠。将来自每个动物的眼睛中的一只切片、去石蜡化并且用苏木精和伊红染色。在内层视网膜内将每个视网膜切片的血管数目计数并且包括附着于内界膜的血管。在显微照相机(Leica)上以100X的放大倍数进行计数。结果示于图3A和4A中。由不了解相同身份的人在神经节细胞层的前部中和视网膜的内界膜上将内皮细胞计数。结果示于图3B和4B中。结果证实所有所施用的给药量的HSA-ARLDDL在抑制视网膜中的血管发生上比Avastin . 明显更加有效。 本串请中所使用的氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO : I表示“ARGDDP”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 2表示“ARGDDV”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 3表示“ARGDDL”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 4表示“PRGDDL”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 5表示“ARGDDM”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 6表示“PRGDDM”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 7表示“RRLDMP”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 8表示“PRLDDL”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 9表示“ARLDDL”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 10表示“PRIDMP”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 11表示“PRHDMP”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 12表示“PRGDNP”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 13表示“PRGDGP”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 14表示“HSA-ARLDDL”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 15表示“HSA(C34S)-ARLDDL”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。SEQ ID NO 16表示“HSA (C34A)-ARLDDL”马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列。上文本发明的示例性的实施方案的描述仅为了说明和描述的目的而存在并且不预期为穷举的或限制本发明至所公开的精确的形式。根据以上教导，很多修改和变化是可能的。考虑到本文公开的本发明的说明书和实行，本发明的其他实施方案对本领域中的那些技术人员来说是显而易见的。预期说明书和实施例仅被认为是示例性的，具有下文权利要求所指示的本发明的真实的范围和精神。
权利要求
1.一种用于治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的组合物，所述组合物包含低剂量的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含选自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 16的氨基酸序列。
2.如权利要求I所述的组合物，其中，所述氨基酸序列选自SEQID NO :9和SEQ ID NO:15。
3.如权利要求I所述的组合物，其中，所述氨基酸序列是SEQID N0:15。
4.如权利要求I所述的组合物，其中，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体与白蛋白轭合或聚乙二醇化。
5.如权利要求I所述的组合物，其中，所述低剂量是从约O.OOOlpg至约300ug的所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。
6.如权利要求I所述的组合物，其中，所述低剂量是从约O.0005pg至约200ug的所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。
7.如权利要求I所述的组合物，其中，所述低剂量是从约O.OOlpg至约IOOug的所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体。
8.如权利要求I所述的组合物，其中，所述组合物被配制为局部组合物。
9.如权利要求I所述的组合物，其中，所述组合物被配制为可注射的组合物。
10.一种用于治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的组合物，所述组合物包含低剂量的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列。
11.一种用于治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的方法，所述方法包括向有需要的受治疗者施用如权利要求I所述的组合物。
12.一种用于治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的方法，所述方法包括向有需要的受治疗者根据所述受治疗者的每个眼部施用低剂量的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含选自SEQ IDNO :1至SEQ ID NO 16的氨基酸序列。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述血管发生相关的眼部疾病选自由年龄相关的黄斑退行性病变、糖尿病性视网膜病、角膜新血管形成疾病、视网膜血管瘤增殖、息肉样脉络膜血管病变、年龄相关的缺血诱导的新血管形成视网膜病、高度近视和早产儿视网膜病组成的组。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述血管发生相关的眼部疾病是年龄相关的黄斑退行性病变。
15.如权利要求13所述的方法，其中，所述血管发生相关的眼部疾病是糖尿病性视网膜病。
16.如权利要求12所述的方法，其中，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体与白蛋白轭合或聚乙二醇化。
17.如权利要求12所述的方法，其中，所述受治疗者是人类并且所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体施用至所述受治疗者的眼部。
18.如权利要求12所述的方法，其中，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体被局部应用于所述受治疗者的眼部。
19.如权利要求12所述的方法，其中，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体经由玻璃体内注射而应用于所述受治疗者的眼部。
20.如权利要求11所述的方法，还包括向所述受治疗者施用在治疗上有效的量的另一种活性剂。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述另一种活性剂选自由VEGF拮抗剂、抗血管发生剂、抗炎剂和类固醇组成的组。
22.如权利要求20所述的方法，其中，所述另外的活性剂与所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体同时施用。
23.如权利要求20所述的方法，其中，所述另外的活性剂在施用所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体之前施用。
24.如权利要求20所述的方法，其中，所述另外的活性剂在施用所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体之后施用。
25.一种用于治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的方法，所述方法包括向有需要的受治疗者施用所述受治疗者每眼低剂量的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体或所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的药学上可接受的盐，所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
全文摘要
本发明一般涉及利用低剂量的马来蝮蛇蛇毒蛋白变体并且具体地低剂量的包含马来蝮蛇蛇毒蛋白变体的融合蛋白治疗和/或预防血管发生相关的眼部疾病的组合物和方法，其中所述马来蝮蛇蛇毒蛋白变体与人类血清白蛋白(HSA)的变体轭合，其中HSA氨基酸序列的位点34处的半胱氨酸残基由丝氨酸代替。
文档编号C07K14/00GK102883738SQ201080059409
公开日2013年1月16日 申请日期2010年12月22日 优先权日2009年12月23日
发明者庄韦杰, 傅文美, 黄彦伦 申请人:成功大学, 台湾大学