专利名称：针对非功能性低聚p2x7受体的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及嘌呤受体、其抗体以及相关的用于结合到所述受体上的片段，涉及所述抗体以及片段的生产，并且涉及所述抗体和片段用于癌症检测和治疗的用途。
背景技术：
在本说明书中对于任何现有技术的引用不是、并且不应当被当成是这样一种承认或任何形式的建议，即该现有技术形成了在澳大利亚或任何其他司法管辖区域中的公知常识的一部分或该现有技术可以由本领域的普通技术人员合理地被预期被确定、理解并且视为是相关的。嘌呤(P2X)受体是ATP-门控阳离子选择通道。每个受体由三种蛋白质亚基或单体组成。迄今为止，已经鉴定了七种分离的编码P2X单体的基因fZXpPZXyPZXyPZXpPZXp P2X6、P2X7。P2X7受体是特别感兴趣的，因为这些受体的表达被理解为是限于具有经历程序性细胞死亡可能性的细胞，例如胸腺细胞、树突状细胞、淋巴细胞、巨噬细胞以及单核细胞。在正常稳态(例如在红细胞上)中存在一些P2X7受体的表达。有趣的是，在被理解为不能经历程序性细胞死亡的细胞(例如癌前期细胞以及肿瘤细胞)上已经发现了含有一种或多种在Pro210(根据SEQ ID NO 1)处具有顺式异构化并且缺乏ATP结合功能的单体的P2X7受体。该受体的这种同种型已经被称为“非功能”受体。抗体是从用一种包含Pro210的肽的进行免疫产生的，Pro210处于与非功能性P2X7受体的顺式结合。然而，它们并不结合到能够结合ATP的？2&受体上。因此，这些抗体对于选择性地检测许多形式的癌以及造血癌症(haemopoietic cancer)以及用于治疗这些病症的一些是有用的。W002/057306A1和W003/020762A1均讨论了用于在处于单克隆抗体形式的功能性P2X7抗体与非功能性P2X7抗体之间进行区分的探针。迄今为止，获得以所希望的亲和力结合到活细胞上的非功能性P2X7受体的血清学试剂已经是非常困难的。在癌症的检测和治疗应用中，较高亲和力的试剂通常是所希望的。对于改进的结合到P2X7受体上的试剂，特别是能够在活细胞上的ATP与非ATP结合受体之间进行辨别的新的抗体以及其片段，存在着一种需要。对于表现出优先结合到P2X7受体上的抗体及其片段也存在着一种需要，因为一旦靶细胞已经死亡，该抗体以降低的结合到P2X7受体上的能力表达在活细胞上。发明概述在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式I定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；其中CDR3具有一个氨基酸序列(带电荷的/极性的/芳香族的)(带电荷的/芳香族的)XXXY(芳香族的/脂肪族的)(带电荷的/中性的)(中性的/脂肪族的)。X贯穿本说明书代表任何氨基酸。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体Ρ2Χ7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式I定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中CDR3 具有一个氨基酸序列N(Y/F) XXXY (Y/F) EX。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式^定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；其中CDR3具有一个氨基酸序列N(Y/F)(中性的)(带电荷的)(中性的)Y(Y/F)E(中性的)。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式4定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中CDR3具有一个氨基酸序列NFLESYFEA。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式3定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区； 其中CDR3具有一个氨基酸序列N(Y/F)(带电荷的)(中性的)(带电荷的)Y(Y/F)E(中性的)。
在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式泛定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中CDR3具有一个氨基酸序列NYRGDYYET。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式I定义 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中⑶R3具有一个氨基酸序列H(芳香族的)XXXYYNI。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式§定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中⑶R3具有一个氨基酸序列H(Y/F)(中性的)(带电荷的(带电荷的)YYNI。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式￡定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中CDR3具有一个氨基酸序列H(Y/F)(中性的)(带电荷的(中性的)YYNI。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式过定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中
CDR3具有一个氨基酸序列HYSKEYYNI。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式U定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中CDR3具有一个氨基酸序列HFQRGYYNI。 在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式U定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中⑶R3具有一个氨基酸序列(Y/N)(芳香族的)XXXYY (带电荷的)(中性的)。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式垃定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶R1、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中CDR3具有一个氨基酸序列(Y/N)(芳香族的)(中性的)(中性的)(中性的)YYDV0在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式Ii定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶R1、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中CDR3具有一个氨基酸序列(Y/N)(芳香族的)(中性的)(中性的)(中性的)YYEV0在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式边定义FR1-CCDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶R1、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中CDR3具有一个氨基酸序列YFPLVYYDV。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式边定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中 FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；CDRl、CDR2和CDR3各自是互补决定区；其中CDR3具有一个氨基酸序列NYL PMYYEV 在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式H定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中 CDR3具有一个氨基酸序列Y (带电荷的)XXXY (中性的)(中性的)(中性的)。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式M定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；CDRl、CDR2和CDR3各自是互补决定区；其中CDR3具有一个氨基酸序列YHVIQYLGP。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式坦定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中^ 1 1、？1 2、？1 3和？1 4各自是框架区；⑶R1、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中⑶R3具有一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成HYSSRFFDV、NFKLMYYNV、NYRGDYYET、HFSRGYYDV、NFLESYFEA、NYL PMYYEV, HYIKVYYEA, HYSSRFFEV、NFRVMFFKA、HFQRGYYNI、HYSSRFFEV、YHVIQYLGP, HYSKEYYNI、YFPLVYYDV、DFTVPFYNA、NYDKKYFDV、YFPLVYYDVo在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式迪定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶R1、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中CDRl具有一个氨基酸序列KASQNVGTNVA。⑶R3具有任何描述⑶R3序列的以上实施方案的氨基酸序列。 在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式红定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；CDRl、CDR2和CDR3各自是互补决定区；其中⑶Rl具有一个氨基酸序列SYYMS。⑶R3具有任何描述⑶R3序列的以上实施方案的氨基酸序列。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式益定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中CDR2具有一个氨基酸序列SASFRYS。⑶R3具有任何描述⑶R3序列的以上实施方案的氨基酸序列。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式益定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中CDR2 具有一个氨基酸序列 AINSNGGSTYYPDTVKG。⑶R3具有任何描述⑶R3序列的以上实施方案的氨基酸序列。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式M定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶R1、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中CDRl具有一个氨基酸序列KASQNVGT NVACDR2具有一个氨基酸序列SASFRYS⑶R3具有任何描述⑶R3序列的以上实施方案的氨基酸序列。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式组定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区；其中⑶Rl具有一个氨基酸序列SYYMS。CDR2 具有一个氨基酸序列 AINSNGGSTYYPDTVKG⑶R3具有任何描述⑶R3序列的以上实施方案的氨基酸序列。在一个实施方案中，在此提供了一种根据以上描述的任何实施方案的抗原结合位点，其中 FRl 是 MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC 或 DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFS。在一个实施方案中，在此提供了一种根据以上描述的任何实施方案的抗原结合位点，其中 FR2 是 WYQQKPGQSPKALIY 或 WVRQTPEKRLELVA。在一个实施方案中，在此提供了一种根据以上描述的任何实施方案的抗原结合位点，其中 FR3 是 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFC 或 RFTISRDNAKNTIYLQMSSLKSEDTAFYYCTR。在一个实施方案中，在此提供了一种根据以上描述的任何实施方案的抗原结合位点，其中 FR4 是 FGSGTRLEIK 或 WGAGTTVTVSS。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式迷定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-连接物-FRla-CDRla-FR2a-CDR2a-FR3a-CDR3a_FR4a其中FRl、FR2、FR3、FR4、FRla, FR2a、FR3a 和 FR4a 各自是框架区；CDR1、CDR2、CDR3、CDRla、CDR2a、CDR3a各自是互补决定区；其中CDRl具有一个氨基酸序列KASQNVGTNVACDR2具有一个氨基酸序列SASFRYS⑶R3具有任何描述⑶R3序列的以上实施方案的氨基酸序列或QQYNSYPFT。⑶Rla具有一个氨基酸序列SYYMS。CDR2a 具有一个氨基酸序列 AINSNGGSTYYPDTVKG当⑶R3是任何描述⑶R3序列的以上实施方案的氨基酸序列时，⑶R3a具有任何描述CDR3序列的以上实施方案的氨基酸序列或QQYNSYPFT (SEQ ID NO :33)。FRl 具有氨基酸序列 MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC (SEQ ID NO :25)FR2 具有氨基酸序列 WYQQKPGQSPKALIY (SEQ ID NO 26)FR3 具有氨基酸序列 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFC(SEQ ID NO :27)FR4 具有氨基酸序列 FGSGTRLEIK (SEQ ID NO :28)FRla 具有氨基酸序列 DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFS (SEQ ID NO :29)FR2a 具有氨基酸序列 WVRQTPEKRLELVA (SEQ ID NO :30)FR3a 具有氨基酸序列 RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAFYYCTR(SEQ ID NO :31)FR4a 具有氨基酸序列 WGAGTTVTVSS (SEQ ID NO 32)。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式ZL定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；CDRl、CDR2和CDR3各自是互补决定区；其中CDR3具有一个氨基酸序列(带电荷的/极性的/芳香族的)(芳香族的)(带电荷的/中性的)(带电荷的)(带电荷的/中性的)Y(芳香族的)(带电荷的)(中性的)。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式M定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；CDRl、CDR2和CDR3各自是互补决定区；其中CDR3具有一个氨基酸序列(带电荷的/极性的/芳香族的)(F/Y)(带电荷的/中性的)(R/Κ)(带电荷的/中性的)Y(Y/F) (E/D)V。在一个实施方案中，在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式M定义FR1-CCDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；CDRl、CDR2和CDR3各自是互补决定区；其中CDR3 具有一个氨基酸序列(H/N) (F/Y) (S/D) (R/K) (G/K) Y (Y/F) DV。在一个实施方案中，通式26的连接物是一个具有15个氨基酸残基的氨基酸序列。典型地，该连接物主要包含甘氨酸和丝氨酸残基。优选地，该连接物是GGGGSGGGGSGGGGS。在一个实施方案中，本发明的抗原结合位点具有包含HFSRGYYDV或NYDKKYFDV的⑶R3氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合位点具有由HFSRGYYDV或NYDKKYFDV组成的⑶R3氨基酸序列。在其他实施方案中，在此提供了一种具有如以上描述的序列，或包括如在此描述的CDR和/或FR序列并且包括一个或多个用于增加所述位点结合到P2X7受体上的亲和力的突变的抗原结合位点。在另一个实施方案中，在此提供了一种如在此描述的抗原结合位点，其中形成FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4中的一个或多个的氨基酸序列是人类序列。在另一个实施方案中，在此提供了一种如在此描述的抗原结合位点，其中形成FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4中的一个或多个的氨基酸序列是犬或猫序列。该抗原结合位点可以被工程化为具有来自特定动物的序列，例如它可以是嵌合体的(即，含有一些但并非所有的在接收该抗体的个体中发现的序列)。可替代地，它可以由异基因序列或同基因序列组成。后者的一个例子是用于狗的治疗中的狗抗体。
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该抗体从中衍生的动物可以包括家养动物、伴侣动物或农场动物,包括狗、猫、奶牛、猪、马以及羊。在另一个实施方案中，在此提供了一种抗？2&受体免疫球蛋白可变域，抗体、Fab、dab、scFv，包括具有在此描述的序列的抗原结合位点，或包括如在此描述的⑶R和/或FR序列。在另一个实施方案中，在此提供了一种双链抗体或三链抗体，包括具有在此描述的序列的抗原结合位点，或包括如在此描述的CDR和/或FR序列。在另一个实施方案中，在此提供了一种融合蛋白，包括如在此描述的抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体或三链抗体，。在另一个实施方案中，在此提供了一种偶联物，该偶联物处于如在此描述的结合到一种标记或细胞毒剂上的形式的抗原结合位点，免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体或三链抗体的形式。 在另一个实施方案中，在此提供了如在此描述的一种用于结合到免疫球蛋白可变域的抗原结合位点上的抗体、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白或偶联物。在另一个实施方案中，在此提供了一种核酸，该核酸编码抗原结合位点，或如在此描述的⑶R和/或FR序列；或如在此描述的一种免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFV、双链抗体、三链抗体、融合蛋白或偶联物。在另一个实施方案中，在此提供了一种包含在此描述的核酸的载体。在另一个实施方案中，在此提供了一种包含在此描述的载体或核酸的细胞。在另一个实施方案中，在此提供了一种由此衍生的包括在此描述的细胞的动物或组织。在另一个实施方案中，在此提供了一种药物组合物，该药物组合物包括抗原结合位点，或包括如在此描述的CDR和/或FR序列；或如在此描述的一种免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白或偶联物，以及一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在另一个实施方案中，在此提供了一种诊断组合物，该药物组合物包括抗原结合位点，或包括如在此描述的CDR和/或FR序列；或如在此描述的一种免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白或偶联物，一种稀释剂以及任选地一种标记。在另Iv实施方案中，在此提供了一种试剂盒或制造物品，该试剂盒或制造物品包括抗原结合位点，或如在此描述的CDR和/或FR序列；或如在此描述的一种免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白或偶联物。在另一个实施方案中，在此提供了一种根据如在此描述的⑶R1、⑶R2、FRl、FR2、FR3和FR4的一个或多个的序列用于生产一种结合到P2X7受体上的抗原结合位点的用途。在另一个实施方案中，在此提供了一种抗原结合位点，或如在此描述的CDR和/或FR序列用于生产具有增加的P2X7受体亲和力的抗P2X7受体抗原结合位点的用途。
在另一个实施方案中，在此提供了一种从抗原结合位点或如在此描述的CDR和/或FR序列突变产生的核酸分子的文库，其中所述文库中的至少一种核酸分子编码了用于结合到P2X7受体上的一种抗原结合位点。在另一个实施方案中，在此提供了一种用于生产如在此描述的抗？2乂7抗原结合位点的方法，包括在如在此描述的一个细胞或动物中表达如在此描述的一种核酸。在另一个实施方案中，在此提供了一种用于治疗个体中的癌症或与非功能性P2X7受体表达有关的病症或疾病的方法，包括以下步骤对一位需要癌症或所述病症或疾病治疗的个体提供在此描述的一种抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、偶联物或药物组合物。在另一个实施方案中，在此提供了如在此描述的抗原结合位点，免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、偶联物或药物组合物用于制造一种治疗癌症或与非功能性P2X7受体表达有关的病症或疾病的药物的用途。在另一个实施方案中，在此提供了用于治疗癌症或与非功能性P2X7受体表达有关的病症或疾病的如在此描述的抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、偶联物或药物组合物。在另一个实施方案中，在此提供了一种用于诊断癌症或与非功能性P2X7受体表达有关的病症或疾病的方法，包括以下步骤将有待确定癌症的存在或缺乏的组织或细胞与一种试剂接触，该试剂处于如在此描述的一种抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、偶联物或诊断组合物的形式,然后检测该试剂与组织或细胞的结合。该方法可以在体内或体外操作。典型地，根据本发明的抗原结合位点结合到非功能性P2X7受体上，尤其是其中P2X7的Pro210是顺式构象的受体。在某些实施方案中，根据本发明的抗原结合位点不结合到非功能性P2X7受体上，尤其是其中P2X7的Pro210是反式构象的受体。典型地，根据本发明的抗原结合位点结合到活细胞上的非功能性P2X7受体上。在一些实施方案中，这些抗原结合位点不结合或以非常低的或不可检测的亲和力结合到在死亡的或漸死细胞上的非功能受体上。无论本发明的抗原结合位点结合或不结合到P2X7受体上，可以使用本领域已知的标准方法确定。在一个实施方案中，根据本发明的抗原结合位点以在大约IpM至大约IuM范围内的亲和力(Kd)结合到在活细胞上的？2&受体上。典型地，当该抗原结合位点是IgM的一部分时，对于活细胞上的？2乂7受体的亲和力是在大约IpM至大约InM之间，优选大约IpM至大约50pM。典型地，当该抗原结合位点是IgG的一部分时，对于活细胞上的P2X7受体的亲和力是在大约IpM至大约InM之间,优选大约IpM至大IOOpM之间。典型地，当该抗原结合位点是Fab的一部分时，对于活细胞上的P2X7受体的亲和力是在大约IOOpM至大约IOOnM之间，优选大约InM至大约ΙΟΟηΜ。典型地，当该抗原结合位点是scFV的一部分时,对于活细胞上的P2X7受体的亲和力是在大约IOnM至大约I μ M之间，优选大约IOnM至大约ΙΟΟηΜ。典型地，当该抗原结合位点是dab的一部分时，对于活细胞上的P2X7受体的亲和力是在大约IOnM至大约10 μ M之间，优选大约IOOnM至大约I μ Μ。在某些实施方案中，本发明的抗原结合位点以及包含它们的分子能够诱导凋亡。在某些实施方案中，本发明的抗原结合位点以及包含它们的分子能够诱半胱天冬氨酸酶激活。附图简要说明
图I.全长人 Ρ2Χ7 受体(SEQ ID NO :1)。图2. Ρ2Χ7 受体的胞外域序列。Ρ2Χ7 受体(47-306) (SEQ ID NO 2) (ECD2)是 SEQID NO : I的氨基酸47至306。这些氨基酸删去(struck-through) 了指定的从全长？2乂7受体序列中缺失的氨基酸。图3. P2X7 受体的胞外域序列。P2X7 受体(47-332) (SEQ ID NO 3) (ECDl)是 SEQID NO 1的氨基酸47至332。这些氨基酸删去了指定的从全长P2X7受体序列中缺失的氨基酸。图4.对于2F6VH的表达载体结构。图5.对于2F6Vl的表达载体结构。图6. (a) 2F6scFv序列，具有用于检测的添加的His标签(SEQ ID NO 4)。所显示的2F6scFV序列具有以下组织结构(以从N端到C-端的顺序)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-连接物-FRla-CDRla-FR2a-CDR2a-FR3a-CDR3a-FR4a-AAA- Flag 表位标签(DYKDDDDK) -AAA-His标签。(b)通过尺寸排阻HPLC的重组2F6 IgG2a的纯化。通过HPLC分离重组IgG2a并且显示了一个实例HPLC色谱图。图 7. 2F6mIgG2a 纯化的 HP-SEC。图8.显示最终抗体产物纯度的SDS PAGE。图9. (a)体外细胞抑制测定。使用细胞活力检测(Cell Titer Blue Assay),发现针对在癌细胞上表达的非功能P2X7受体的三聚物形式的初始抗体的IgM形式抑制了细胞生长。显示了一个实例，其中看到对照IgM抗体浓度从2. 5增加到40μ g/mL对于细胞生长(左栏)没有作用而2F6在相同剂量范围内在3天的生长测定中抑制了细胞生长(右栏)。(b)、(c)、(d)同样地通过与IgM形式的抗体孵育来抑制其他细胞类型。经过5天比经过3天的生长被抑制到一个更大的程度。相对于使用对照IgM抗体所获得的控制生长曲线，对生长数据作图。C0L0205生长经过3天显著被抑制并且这些细胞甚至在2. 5 μ g/mL的低剂量下经过5天而被消除。这表明表达轻微不同水平的受体的不同细胞系或多或少对于抗体结合是敏感的。(e)相反，重组IgG2a形式的抗体显示出更弱的细胞抑制，如在过3天获得的以下图中所示。细胞生长抑制测定(细胞活力测试，Cell Titer Blue)显示，与使用IgM形式抗体引出的抑制作用相比，IgG2a形式的抗体具有降低的肿瘤细胞生长抑制，与实际上含有两个而不是十个结构域的IgG的结合亲和力降低一致。
图10.细胞杀伤测定中的阻断反应。细胞活力生长抑制测定用于以MCF-7乳癌细胞系经过三天的细胞生长。注意，在右栏中的活的对照细胞不具有抗体或肽。左手栏是使用含500 μ g/mL肽表位(E200-300表位在图中描述为200/300)的10 μ g/mL 2F6IgM抗体孵育的细胞得到的信号，通过在三个中间栏中的数据证明足以阻断细胞生长抑制作用，显示了生长抑制不受对应的50 μ g/mL,5 μ g/mL或0 μ g/mL肽的存在的影响。在2F6中暴露5天之后发生细胞生长的完全抑制。图11.由2F6诱导的具有与凋亡的复活有关的半胱天冬氨酸酶3/7活化的细胞死亡机制。在这个实验中,左侧显示吉西他滨对照药物的作用，已知其通过诱导C0L0205癌细胞中的凋亡而激活半胱天冬氨酸酶。相反，药物或抗体的缺乏没有作用(仅有细胞的栏)。经过3天时间过程的实验中，高达40 μ g/mL剂量的对照IgM的存在同样对半胱天冬氨酸酶的激活没有作用，同时增加2F6抗体的量显示出与通过抗体诱导的凋亡相关的半胱天冬氨酸酶3/7激活的稳定增加。 图12.通过2F6IgM的直接细胞杀伤。在对照IgM抗体(a)和2F6IgM(b)存在24小时下的MCF-7细胞的共焦显微图象。图13. (a)结合到活4T1肿瘤细胞上的2_2_lhFc,显示了一些膜结合(x40obj)。(b)结合到濒死细胞上的2-2-lhFc连同来自已经被杀死的细胞的膜碎片。(c)结合到活LL肿瘤细胞上的2-2-lhFc，显示了清楚的膜结合。(d)结合到已经被杀死的细胞的膜碎片上的 2-2-lhFcο图14. (a)结合到活4T1肿瘤细胞上的2F6hIgGl，显示了清楚的膜结合(x40obj)。(b)仅结合到濒死细胞上的2F6hIgGl。(c)结合到活LL肿瘤细胞上的2F6hIgGl，显示了清楚的膜结合。(d)结合到濒死细胞上的2F6hIgGl，没有结合到相邻的表达功能能力(function-capable)的P2X7受体的红细胞上。图15.通过2F6hIgGl在4T1同基因异种移植模型中到第14天时肺转移数目的抑制。肿瘤体积的总减小为89%，其中在治疗组中大多数转移的体积比未治疗组中的转移的体积小得多。图16.在路易斯肺(LL)同基因异种移植模型中到第11天时肺转移数目的抑制。五个组是未治疗对照(组l)、10mg/kg的羊多克隆E200-300(组2)、lmg/kg(组3)以及10mg/kg (组4)的2F6hIgGl以及5mL/kg每天的索拉非尼(组5)。绵羊多克隆和2F6hIgGl两者都与具有96%抑制的索拉非尼等效。图17.来自2F6的⑶R3序列的亲和力成熟。亲和力成熟的scFv/Fab衍生物的氨基酸序列作为突变体克隆而列出，其中野生型(WT)2F6CDR3序列在清单的顶部。图18. IgM、IgG2a和Fab铅的ELISA。铅亲和力成熟的2F6衍生的ELISA (对于IgM和IgG2a，水平为O. 01-12. 5 μ g/mL ;对于Fab为O. 1-100 μ g/mL)。对于初始IgM和重组IgG2a的EC5tl值分别测量为O. 14和I. 6 μ g/mL。WT Fab显示了非常低的EC5tl，而选自ScFv筛选(#10、#21、#42和#66)的铅亲和力成熟的Fab种类结合紧密得多，具有在2-4 μ g/mL范围内的EC5tl,或者比WT强125倍，从而匹配该完全形成的IgG2a抗体的亲和力。图19. (a)针对重组Fab结合到活的结肠直肠C0L0205肿瘤细胞上的流式细胞术结果。使用σ抗FLAG 二级抗体(#F4049)来检测初级抗体的结合。WT 2F6Fab在相同的浓度范围内结合微弱。对于四个铅Fab的EC50与从ELISA测量获得的值非常相似。(b)对于前列腺PC3细胞获得了非常相似的改进的结合结果。图20.对不同的重组2F6IgG2a制剂进行比较，以确定与亲和力成熟的Fab相比的WT格式的抗体对PC3细胞的相对结合强度。使用Rockland IgG2a#010-001_332用于对照以确定背景(菱形)。全格式化的WT抗体的结合与通过铅Fab引出的结合相当。图21.通过流式细胞术确定了对于通过铅Fab结合到人淋巴细胞上的功能性P2X7受体上的缺乏的验证。σ抗FLAG抗体#F4049用作二级抗体。Abeam HLA抗体用作对照。没有检测到在背景以上的结合，如通过在左手栏的仅仅二次信号所确定的。沿着X轴从左到右的初级抗体的顺序与图例从上到下的顺序相同。图22.对于高亲和力的纯化羊多克隆抗体结合到PC3细胞上的流式细胞术结果，显示了比WT 2F6 hIgG2a显著更强的结合并且表明当转化成二价IgG结合物时从广泛的亲和力成熟的Fab的预期改进。
发明详细说明现在将更详细地提及本发明的某些实施方案。虽然本发明将结合这些实施方案进行说明，将理解的是并不旨在将本发明限于这些实施方案。相反，本发明旨在将涵盖如在由权利要求书所定义的包含在本发明的范围之内的多种替代方案、修改、以及等效物。本领域的技术人员将会认识到类似于或等同于在此描述的那些的许多方法和材料，它们可以用于本发明的实践中。本发明绝非限于所描述的这些方法和材料。将理解的是在本说明书中披露并且定义的本发明扩展到所提及的或根据正文或附图中明显的两个或更多个单独的特征的所有替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的不同替代方面。如在此使用的，除了上下文另外要求以外，术语“包括”comprise")，以及该词语的变体，例如“包括”("comprising ")以及“包括comprises")和“包括comprised")不旨在排除其他的添加物、组分、整数或步骤。本发明提供了能够结合到由活细胞表达的非功能性P2X7受体上的抗原结合位点。这些受体处于更高水平的低聚物形式。这种低聚物形式是相关联的两种或更多种P2X7受体单体。典型地，该低聚物形式是三个P2X7受体单体的三聚物。本发明的结合更高水平的低聚P2X7形式的抗原结合位点的一个优点是，与仅仅结合单体的P2X7受体的抗体相比，将会降低从溶解的或凋亡的细胞释放的P2X7受体的单体形式的隐蔽(sequestration)。为了解释本说明书的目的，以下定义将应用并且在适当时所使用的单数术语还包括复数并且反之亦然。在所列出的任何定义与通过引用结合在此的任何文献冲突的情况下，以下列出的定义将优先。“嘌呤受体”通常是指使用嘌呤(如ATP)作为配体的一种受体。“P2X7受体”通常是指由三个蛋白质亚基或单体形成的嘌呤受体，其中至少一个单体具有基本上如在SEQ ID NO 1中示出的氨基酸序列(参见图I)。“？2&受体”可以是如下描述的功能或非功能性受体。“P2X7受体”包括天然发生的P2X7受体变体，例如其中P2X7单体是剪接变体、等位基因变体以及包含天然发生的形成P2X7受体的截短的或分泌形式的单体的同种型(例如由细胞外结构域序列组成的形式或其截短的形式)、天然发生的变体形式(例如，可替代地剪接形式)以及天然发生的等位基因变体。在本发明的某些实施方案中，在此披露的天然序列P2X7单体多肽是成熟的或全长的天然序列多肽，包含在SEQ IDN01中示出的全长氨基酸序列。在某些实施方案中，？2&受体可以具有修饰的氨基酸序列，例如显示在SEQ ID NO :1中的序列中的不同氨基酸可以被置换、缺失，或可以插入一个残基。“功能性P2X7受体”通常是指具有用于结合到ATP上的结合位点或裂缝的P2X7受体的一种形式。当结合到ATP上时，该受体形成了一种孔状结构，该结构使得钙离子能够进入胞质溶胶中，其一个结果可能是程序性细胞死亡。在正常稳态中，功能性P2X7受体的表达通常限制于经历程序性死亡的细胞，如胸腺细胞、树突状细胞、淋巴细胞、巨噬细胞以及单核细胞。还可以在红细胞上存在一些功能性P2X7受体表达。“非功能性P2X7受体”通常是指其中一个或多个单体具有在Pro210顺式异构化的P2X7受体的形式(根据SEQ ID N0:1)。这种异构化可能是从导致该单体错折叠的任何分子事件产生的，包括例如单体基本序列的突变或异常的翻译后加工。异构化的一个结果是该受体不能结合到ATP上。在这些情况下，该受体不能形成孔并且这限制了钙离子可以进入到胞质溶胶中的程度。非功能性P2X7受体表达在广泛的上皮癌和造血癌上。在此使用的“胞外域”(ECD)是P2X7受体(47-306) (SEQ ID NO :2，参见图 2) (ECD2) 以及卩2父7受体(47-332) (SEQ ID NO 3) (ECDl)。P2X7 受体(47-306) (SEQ ID NO 2)是 SEQID NO 1 的氨基酸 47 至 306。P2X7 受体(47-332) (SEQ ID NO :3，参见图 3)是 SEQ ID NO I的氨基酸47至332。I.“抗体”或“免疫球蛋白”或“Ig”是在血液、或其他体液或脊椎动物中发现的Y球蛋白蛋白，它们在免疫系统中起作用以结合到抗原上，由此识别并且中和外来物。抗体通常是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。每个L链通过一个共价的二硫键连接到一个H链上。这两个H链通过一个或多个二硫键(取决于该H链的同种型)彼此连接。每个H和L链还具有规则地间隔开的链内二硫桥。H和L链定义了特异性Ig结构域。更具体地说，每个H链在N端具有关于可变域(Vh)，之后是三个恒定域(Ch)(对于每个α和Y链)以及四个Ch结构域(对于μ和ε同种型)。每个L链在N端具有一个可变域((')，之后在其另一端是一个恒定域(Q)。\与Vh对齐并且Q与重链的第一恒定域(ChI)对齐。抗体可以指定到不同的类别或同种型。存在五种类别的免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，具有分别指定为α、δ、ε、γ、和μ的重链。Y和α类别基于在Ch序列和功能方面的较小差异而进一步分成多个亚类，例如人类表达以下亚类IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAldP IgA2。来自任何脊椎动物种类的L链基于其恒定域的氨基酸序列可以被指定为两个明显不同的类型之一，称为K和入。该恒定域包括Fe部分，该部分包括通过二硫化合物结合的两个H链的羟基端部分。通过在Fe区中的序列确定抗体Uf^BADCC)的效应子功能，该区也是通过在某种类型的细胞上发现的Fe受体(FcR)识别的部分。V1^P \的配对一起形成了一个“可变区”或“可变域”，包括抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变域可以被称为“VH”。轻链的可变域可以被称为“VL”。V结构域包括抗原结合位点，该抗原结合位点影响了抗原的结合并且限定了一种特定抗体对于其特定抗原的特异性。V区跨过了大约110个氨基酸残基并且由15-30个氨基酸的被称为框架区(FR)(通常大约4)的相对不变伸展段(relatively invariant stretch)组成,该相对不变伸展段被极度易变的称为“高变区”(通常大约3)的各自具有9-12个氨基酸长的更短的区域分开。这些FR大部分采取β片构型并且高变区形成了连接β片结构的环，并且在一些情况下形成了 β片结构的一部分。“高变区”，“HVR”或“HV”是指抗体可变域的区域，这些区域在序列方面是高变的和/或形成在结构上定义的环。通常，抗体包括六个高变区；三个在VH(H1、Η2、Η3)中，并且三个在VL(L1、L2、L3)中。在此使用并且包含了许多高变区的描绘。Kabat互补决定区(O)R)是基于序列可变性并且是最常使用的(Kabat等人Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed.(免疫学兴趣的蛋白质序列，第 5 版)Public HealthService, National Institutes of Health(美国国立卫生研究院，公共卫生署)，贝塞斯达，马里兰州(1991))。 “框架”或“FR”残基是除了在此定义的高变区残基以外的那些可变域残基。“用于形成抗原结合位点的肽”通常是指可以形成针对抗原赋予抗原特异性的肽。例子包括全抗体或全抗体相关的结构，包含一个可变域的全抗体片段、其可变域和片段，包括轻和重链，或包括一些但并非所有的高变区或恒定区的轻以及重链的片段。“完整的”或“全”抗体是包括抗原结合位点，连同Q以及至少重链恒定域ChI、Ch2和(^3。恒定域可以是天然序列的恒定域(例如，人类天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。“全抗体相关的结构”包括多聚化形式的全抗体。“包含一个可变域的全抗体片段”包括Fab、Fab'、F(ab' )2、和Fv片段；双链抗体、线性抗体、单链抗体分子；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。Fab片段由整个L链与H链的可变区结构域(Vh)以及一个重链的第一恒定域(ChI)组成。每个Fab片段相对于抗原结合是单价的，即，它具有单个抗原结合位点。Fab'片段与Fab片段的区别在于在ChI结构域的羧基端具有另外的很少的残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab' -SH在此是对于Fab'命名的，其中该恒定域的一个或多个半胱氨酸残基带有一个游离的巯基。F(ah' )2片段大致地对应于两个具有二价抗原结合活性的二硫化物连接的Fab的片段并且仍然是能够交联抗原。“Fv”是包括一个完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由以紧密的非共价缔合的一个重链的以及一个轻链的可变区结构域的二聚物组成。在一个单链Fv(ScFv)种类中，一个重链以及一个轻链可变域可以通过一个柔性肽连接物共价连接，使得该轻链和重链能够在一个类似于两链Fv种类的“二聚”结构中缔合。从这两个结构域的折叠发散出六个高变环(3个环各自来自H和L链)，这些环有助于氨基酸残基用于抗原结合并且赋予抗原对抗体的结合特异性。“单链Fv”还缩写为“sFv”或“scFv”是包含连接形成一个单一的多肽链的Vh和\抗体结构域的抗体片段。优选地，该scFv多肽进一步包括在该Vh和\结构域之间的一个多肽连接物，使得该scFv形成了所希望的用于抗原结合的结构。
“单一可变域”是Fv的一半(仅包含三个对于抗原特异的OTR)，该Fv具有识别并且结合抗原的能力，尽管比整个结合位点的亲和力更低。“双链抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，这些片段包括连接到在同一多肽链(VH-VL)中的一个轻链可变域(VL)上的重链可变域(VH)。小的抗体片段通过在该Vh与\结构域之间构建具有短连接物(大约5-10个残基)的sFv片段(参见以上段落)而制备，使得实现了 V结构域的链间配对但不是链内配对，从而导致了一个二价片段，即，具有两个抗原结合位点的片段。
双链抗体可以是二价的或双特异性的。双特异性的双链抗体是两个“交换型” sFv片段的异源二聚体，其中这两个抗体的Vh与\结构域在不同的多肽链上存在。三链抗体和四链抗体通常也是本领域已知的。“分离的抗体”是已经从其预先存在的环境中的组分鉴定并且分离和/或回收的抗体。污染组分是将会干扰对于抗体的治疗用途的材料并且可以包括酶、激素以及其他蛋白质性溶质或非蛋白质性溶质。“人抗体”是指具有相应于由人产生的一种抗体的氨基酸序列和/或已经使用用于制造如在此披露的人抗体的任何技术所制造的抗体。人抗体的定义确切地排除了包含非人的抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可以使用本领域已知的不同技术生产，包括噬菌体展示文库。人抗体可以通过将该抗原给予一种转基因动物而制备，该转基因动物已经进行了改良以响应于抗原激发而产生这样的抗体，但是其内源性位点已经丧失能力。非人(例如啮齿动物)的抗体的“人源化的”形式是包含衍生自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自该受体的高变区的残基被具有所希望的抗体特异性、亲和力和能力的来自非人种类(供体受体)(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫或非人灵长类的高变区的残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可以包括在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。通常，这种人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、典型地两个可变域，其中相应于非人免疫球蛋白以及所有的或基本上所有的FR的所有的或基本上所有的高变环是人免疫球蛋白序列的那些。该人源化抗体任选地还包括至少一个免疫球蛋白恒定区(Fe),典型地人免疫球蛋白的至少一部分。“单克隆抗体”是指从基本上均质性抗体的群体获得的一种抗体，S卩，包含该群体的单独的抗体是相同的，除了可能以较小的量存在的可能的天然发生的突变以外。单克隆抗体是高度特异性的，其直接针对在抗原上的单一抗原位点或决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体有利的是它们可以通过其他抗体未受污染地合成。单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备，或者使用重体DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制造。这些“单克隆抗体”还可以从噬菌体抗体文库中分离出。在此的单克隆抗体包括“嵌合的”抗体，其中重和/或轻链的一部分与对应的衍生自一个特定种类的抗体或属于一个特定抗体种类或亚类的序列相同或同源，而该一个或多个链的其余部分是与衍生自另一个种类的抗体的或属于另一个抗体种类或亚类的抗体连同此种抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要他们表现出所希望的生物活性即可。在此感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化的(primatized) ”的抗体,这些抗体包含衍生自非人灵长类(例如旧世界猴、猩猩等)的可变域抗原结合序列以及人类恒定区序列。术语“抗-P2X7受体抗体”或“结合到P2X7受体上的抗体”是指能够以足够的亲和力结合到P2X7受体上使得该抗体作为一种诊断和/或治疗剂在靶向P2X7受体(典型地非功能性P2X7受体)中是有用的抗体。优选地，将一种P2X7受体抗体结合到不相关的受体蛋白上的程度小于如所测量(例如通过放射免疫测定(RIA))的该抗体结合到？2\受体上的约10%。在某些实施方案中，结合到？2&受体上的抗体具有的解离常数(Kd)是< ΙμΜ、< ΙΟΟηΜ, < 10ηΜ、< 1恤、或< O. InM。抗非功能性P2X7受体抗体通常是具有一些或所有这些血清学特征并且结合到非功能性P2X7受体上而不是功能性P2X7受体上的抗体。一种“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个HVR中具有一个或多个改变的抗体，这种改变与不具有一个或多个那种改变的母源抗体相比导致了抗体对于抗原的亲和力的 改进。优选的亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔的对于靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体是通过本领域已知的程序生产的。“抑制性”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低了该抗体结合的抗原的生物活性的抗体。优选的抑制性抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制了该抗原的生物活性。如在此使用的“激动剂抗体”是一种模拟感兴趣的多肽的功能性活性中的至少一种的抗体。“结合亲和力”通常是指在一个分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的总的非共价相互作用的强度。通常“结合亲和力”是指反应结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的I : I相互作用的固有结合亲和力。分子X对于其配偶体Y的亲和力通常可以通过解离常数(Kd)表示。可以通过本领域已知的方法测量亲和力，包括在此描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合到抗原上并且倾向于很容易地解离，而高亲和力抗体通常更快地结合到抗原上并且倾向于保持结合比较久。许多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任何方法可以用于本发明的目的。如在此使用的，在以下表中定义了氨基酸的特性
权利要求
1.一种用于结合到？2&受体上的抗原结合位点，该抗原结合位点由以下通式I定义FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中 FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区； ⑶R1、⑶R2和⑶R3各自是互补决定区； 其中 CDR3具有一个氨基酸序列(带电荷的/极性的/芳香族的)(带电荷的/芳香族的)XXXY(芳香族的/脂肪族的)(带电荷的/中性的)(中性的/脂肪族的)。
并且其中X代表任何氨基酸。
2.如权利要求I所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列N(Y/F)XXXY(Y/F)EX。
3.如权利要求2所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列N(Y/F)(中性的)(带电荷的)(中性的)Y(Y/F)E(中性的)。
4.如权利要求3所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列NFLESYFEA。
5.如权利要求2所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列N(Y/F)(带电荷的)(中性的)(带电荷的)Y(Y/F)E(中性的)。
6.如权利要求5所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列NYRGDYYET。
7.如权利要求I所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列H(芳香族的)XXXYYNI。
8.如权利要求7所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列H(Y/F))(中性的)(带电荷的(带电荷的)YYNI。
9.如权利要求7所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列H(Y/F)(中性的)(带电荷的(中性的)YYNI。
10.如权利要求8所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列HYSKEYYNI。
11.如权利要求9所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列HFQRGYYNI。
12.如权利要求I所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列(Y/N)(芳香族的)XXXYY(带电荷的(中性的)。
13.如权利要求12所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列(Y/N)(芳香族的)(中性的)(中性的)(中性的)YYDV。
14.如权利要求12所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列(Y/N)(芳香族的)(中性的)(中性的)(中性的)YYEV。
15.如权利要求13所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列YFPLVYYDV。
16.如权利要求14所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列NYLPMYYEV。
17.如权利要求I所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列Y(带电荷的)XXXY(中性的)(中性的)(中性的)。
18.如权利要求I所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列YHVIQYLGP。
19.如权利要求I所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列以下序列中的任一项HYSSRFFDV、NFKLMYYNV、NYRGDYYET、HFSRGYYDV、NFLESYFEA、NYL PMYYEV,HYIKVYYEA, HYSSRFFEV、NFRVMFFKA、HFQRGYYNI、HYSSRFFEV、YHVIQYLGP, HYSKEYYNI、YFPLVYYDV、DFTVPFYNA、NYDKKYFDV、YFPLVYYDV。
20.如权利要求I所述的抗原结合位点，其中CDR3具有以下氨基酸序列HFSRGYYDV或NYDKKYFDVο
21.根据以上权利要求的任一项所述的抗原结合位点用于制造一种治疗癌症或与非功能性P2X7受体表达有关的病症或疾病的药物的用途。
22.根据以上权利要求的任一项所述的抗原结合位点，用于治疗癌症或与非功能性P2X7受体表达有关的病症或疾病。
23.一种用于诊断癌症或与非功能性P2X7受体表达有关的病症或疾病的方法，包括以 下步骤将有待确定癌症的存在或缺乏的组织或细胞与一种试剂接触，该试剂处于根据以 上权利要求的任一项所述的一种抗原结合位点的形式；然后检测该试剂与组织或细胞的结合。
全文摘要
本发明涉及嘌呤受体、其抗体以及相关的用于结合到所述受体上的片段，涉及所述抗体以及片段的生产，并且涉及所述抗体和片段用于癌症检测和治疗的用途。具体地，所描述的抗体特异性地结合到由活细胞表达的非功能性P2X7受体上。
文档编号C07K16/28GK102762595SQ201080063868
公开日2012年10月31日 申请日期2010年12月23日 优先权日2009年12月24日
发明者安格斯·基得利-拜尔德, 朱利安·亚历山大·巴登 申请人:生物权威国际有限公司