针对人类巨细胞病毒的结合成员的制作方法

专利名称：针对人类巨细胞病毒的结合成员的制作方法
技术领域：
本发明涉及结合成员，特别是抗体分子，其中和人类巨细胞病毒(hCMV)的生物学效应。结合成员对于hCMV感染的治疗和预防是有用的。
背景技术：
人类巨细胞病毒(hCMV)是一种广泛分布的病原体，取决于地理和社会经济的起源，其通常对40-80%的人口建立无症状的和终生持续性。然而，在免疫受损(免疫减弱)的病人中，如移植接受者和受艾滋病病毒(HIV)感染的个体，和在新生儿中，hCMV感染是发病率和死亡率的主要原因，并且对卫生保健系统造成重大的经济负担。hCMV是影响实体器官移植(solid organ transplantation) (SOT)和造血干细胞移植(SCT) (Razonable和Paya，2003)的结果的最显著的感染。在移植之后，在约60-70% 的hCMV-血清反应阳性的病人或接受来自血清反应阳性供体的器官移植的病人中产生活性hCMV感染(Razonable和Paya，同前)。如果没有采取预防措施，患进展性hCMV疾病的风险是20-30%。考虑到以下事实，即2008年在世界范围内进行了大约26，000例异体SCT(www. cibmtr. org),这种疗法的成功和移棺后的发病率和死亡率的降低具有可观的财政意义。hCMV相关的并发症可以导致每个病人25，000至50，000欧元的额外费用。此外，移植病人中的HCMV感染与移植相关的动脉硬化和加速的移植失败有关(Streblow 等，2007)。如上所述，hCMV作为围产期病原体是相关的。每年，大约1%的易患病妇女在妊娠期血清转化。这些人中大约40%将hCMV遗传给她们的孩子，导致在美国每年有40，000受感染的新生儿(Kenneson和Cannon，2007)。10-20%受感染的儿童在出生时患有急性症状。其中高达20%死亡，并且剩余的儿童典型地患有中度至重度的并发症，包括CNS相关病症，如失明、失聪和智力障碍。除了对受感染的病人和他们的家庭的毁灭性后果之外，那些病人的医疗保健成本也是显著的，尤其是，如果围产期感染导致严重和永久性的伤残。目前，五种抗病毒药剂被批准用于hCMV感染更昔洛韦(Ganciclovir) /缴更昔洛韦(Valganciclovir)、西多福韦(Cidofovir)、勝甲酸(Foscarnet)和福米韦生(Fomivirsen)0所有化合物都涉及剂量依赖性副作用和耐病毒株的进展(Schreiber等，2009)。没有一种药物获得用于儿童或孕妇的许可。此外，静脉内注射免疫球蛋白制剂(IVIG),例如CytoGam (CSL Behring)和Cytotecf (BiOtest)用于有 hCMV 感染风险
的病人的预防和治疗。然而，在移植情况下关于这种治疗的好处的不确定性是明显的(Sokos等，2002 ；Raanani等，2009)。hCMV-特异性细胞毒素T细胞的过继转移(adoptivetransfer)已经成功用于造血干细胞移植病人(Moss和Rickinson, 2005),但是这种治疗是极其昂贵的，并将局限于有必要的专业技术的少数移植中心。此外，这种类型的治疗只限于对于hCMV呈血清反应阳性的移植接受者。相比之下，已经报道了 IVIG对先天性CMV感染的治疗和预防是有效的(Nigro等，2005)。然而，针对hCMV治疗的IVIG是从hCMV血清反应阳性的供体分离和纯化的，导致效价变化并从而导致在这些制剂中hCMV特异性抗体的批次与批次(batch-to-batch)之间的变化。此外，源于人血液的药物产品总是带有人类病原体传播的风险。结果，期望重组抗体产品，其用于由hCMV感染所引起的疾病的预防和治疗，使得hCMV能够有效中和。hCMV感染的抗体疗法的靶标是在hCMV病毒粒的表面表达的蛋白质。hCMV病毒粒包膜的组成非常复杂，虽然已经鉴定了构成包膜的许多结构蛋白，但是仍然不能充分确定。在开发用于治疗hCMV的抗体期间，已经鉴定了在表面糖蛋白复合物gp58/l 16( gB或gC_l )、gp 47-52 (gC-II ;gM 和 gN) (Shimamura 等，2006)、gp 86 (gH 或 gC-III) (Urban 等，1996)中的抗原决定簇(antigenic determinants)。迄今为止大多数经鉴定的中和抗体结合到gB蛋白上，已经显示gB蛋白包括大多数中和表位(Britt等，1990)。gB复合物被合成为130kD的前体，其断裂成两个共价连接的分子，名为gp58和gpll6。N端片段(gpll6)包括一个直链中和表位，称为20个氨基酸(氨基酸67-86)的抗原区-2 (AD-2)，其不需要针对抗体调节的生物活性的补体(Meyer等，1990)。gB的gp58部分(moiety)带有中和区AD-1,其包括74个氨基酸(氨基酸557-630)并且很可能代表构象表位(Ohlin等，1993 ；ffagner等，1992)。 单克隆抗体的出现最初引起多种抗hCMV的中和小鼠单克隆抗体的鉴定。然而，小鼠单克隆抗体不适合用于人类治疗，由于人免疫系统将这些蛋白质识别为外来物，结果在非常短的时间段后清除，导致低的或无临床效果。已经开发了抗hCMV蛋白的嵌合抗体，并且EP664834B (Harris等)描述了称为gH的嵌合抗体，其靶向hCMV的86kD的糖蛋白；然而，这样的抗体在临床使用情况(clinical setting)下没有成功。将异源骨髓瘤(heteromyelomas)用于产生杂交瘤的技术，已经用于产生识别各种在病毒包膜中发现的hCMV糖蛋白的各种人单克隆抗体。US5，043，281 (Masuho等)描述了中和人单克隆抗体，其识别分子量在130，000至55，000之间的CMV抗原蛋白。US5, 750, 106(Ostberg)描述了识别gH糖蛋白的被称为SDZ MSL 109的抗CMV的人单克隆抗体、以及用于生产这种抗体的杂交瘤细胞系。已经在第I/II阶段临床试验中评价了中和病毒的人单克隆抗体之一，SDZ MSL-109对于在免疫受损的病人中由hCMV诱发的视网膜炎，但是由于缺乏效能，没有继续进行临床试验(Borucki等,2004 !Hamilton等，1997 ;Boeckh等，2001 )。这些试验失败的一个可能解释是hCMV的抗原变异性，hCMV在人类疱疹病毒中是独特的，因为其抗原可变，并且大多数与包膜抗原反应的人单克隆抗体显示区域特异性的中和能力。对于gH_特异性人单克隆抗体类来说，尤其如此，如SDZ MSL-109。这种障碍仅能通过使用定向抗hCMV上的表位的单克隆抗体来克服,该表位存在于不同的分离株之间。过去，由于以下事实，即不能获得用于中和能力的抗体的高通量筛选，因而分离hCMV中和单克隆抗体的进程缓慢。此外,非洲淋巴细胞瘤病毒(Epstein Barr VirusXEBV)永生化(immortalisation)的方法已经多年来频繁地用于产生永生化的(immortalised)B细胞，其生产关注的抗体。利用抗原特异性选择(Casali等，1986)来自病人的淋巴结、脾或外周血(Yamaguchi 等，1987 ；Posner 等，1991 ；Raf 等，1988 ；Steenbakkers 等，1993 和1994)，这种技术已经成功用于由不同来源的人类B细胞(如健康对象的外周血)产生分泌抗体的细胞。这项技术用于从CMV血清反应阳性的血液供体中分离的外周血单核细胞的永生化和随后三种抗体的分离ITC52、ITC63b 和 ITC88 (W0 93/021952A1 )。ITC52 和 ITC63b与由CMV gp58的氨基酸序列557-630构成的CMV的构象AD-I表位是反应性的，并且ITC88对于包括CMV gpl 16的氨基酸序列67-86 (AD-2)的AD-2是反应性的(W0 93/021952A1 )。
Lanzavecchia (WO 04/076677A2)和 Funaro 等(TO 07/068758A I)已经公开了 EBV转化方法的改进，并且这些方法已经用于产生针对hCMV的抗体。WO 08/084410A2(Lanzavecchia和Macagno)描述了由EBV细胞系1F11、2F4、5A2以及9A11生产的抗体，其中和内皮细胞、上皮细胞、视网膜细胞和树突细胞的hCMV感染，并定向针对由gpUL130和gpUL131A形成的构象表位。然而，如果成纤维细胞用作感染的靶细胞，来自这些EBV细胞系的抗体不具有任何可检测的hCMV中和能力。W008/084410A2还提到了 EBV细胞系10C6、5FU6B4和7H3，产生中和成纤维细胞和内皮细胞的hCMV感染的抗体，这些细胞的半最大抑制浓度(IC5tl)范围在O. 3和2. Oy g/ml之间。描述了由这些EBV系产生的抗体结合到gB的功能表位上。然而，虽然已经从一些上述的EBV细胞系推断出抗体的重链和轻链序列，但是对于由公开的序列编码的重组表达和纯化的抗体，这些数据还没有被确认。来自Lanzavecchia和Macagno的更新的专利申请(WO 10/007463A1)描述了抗体6G4,其结合到由UL128、UL130和UL131A蛋白的组合确定的表位上，并且其中和内皮、视网膜和树突细胞的hCMV感染。此外,WO 10/007533A1 (Lanzavecchia和Macagno)描述了结合到以下表位上的hCMV中和抗体hCMV UL128蛋白中的表位，由gH、gL、UL128和UL130蛋白形成的表 位，由UL128、UL130和UL131A蛋白形成的表位或由UL130和UL131A蛋白形成的表位。WO 08/071806A1 (Funaro等)描述了抗体26A1，其结合并中和hCMV，但是当用ELISA测试时对于抗原gB或gH都不显示显著结合。据报道针对初始(初代)成纤维细胞和内皮细胞两者的抗体26A1的半最大抑制浓度(IC5tl)在lyg/ml范围内，并且因此在现有技术中描述的抗体已到达的范围内。Funaro和同事的进一步的专利申请描述了抗体1F7,其识别gH (WO 09/003975A1)。类似于抗体26A1，正如在WO 08/071806A1中所描述的，据报道初始成纤维细胞和内皮细胞的抗体1F7的半最大抑制浓度(IC5tl)在I μ g/ml的范围内，因此在现有技术中描述的抗体已到达的范围内。Funaro和同事的另一个专利申请(WO09/024445A1)描述了抗体 8C10、37B7、8A11 和 10B7，其识别 gB (克隆 8C10、8A11、10B7)的AD-2区域，或与gB或gH不相关的蛋白质(克隆37B7)。如在Funaro和同事的专利申请(WO08/071806A1和WO 09/003975A1)中那样，W009/024445A1中描述的针对初始成纤维细胞以及内皮细胞两者的抗体(1( 7、8411、3787)的半最大抑制浓度(1(5(|)也显示在约1118/1111的范围内或在约10 μ g/ml或更高的范围内(8C10)，因此在先前公开的中和hCMV抗体的范围内。另外的最新专利申请描述了具有类似特点的中和hCMV抗体。例如，WO09/114560A2(01sen)描述了抗体克隆 2F10、2M16、2N9、3C21、3G7、4P12、5P9、9C16，其全部结合至gB的AD-2表位，并且成纤维细胞的hCMV感染的半最大抑制浓度(IC5tl)显示在I μ g/ml的范围内。US20090004198 (Nakajima等)披露了对于gB AD-I区域高亲合抗体，如果使用I μ g/ml和更高(10 μ g/ml和100 μ g/ml)的浓度，则其具有明显的pM结合亲和力，和成纤维细胞上80%的hCMV中和活性。来自Evec Inc.的最新申请WO 10/114105A1和WO10/114106A1，两者分别描述了结合至AD-2和AD-I中的不连续表位的抗体。正如在本发明中披露的，我们已经开发了中和hCMV的人类抗体，其对结合到hCMV的gB蛋白具有高亲和力。此外，这些抗体在使用广泛的易受hCMV感染的细胞型(成纤维细胞、内皮、上皮和树突细胞)的hCMV中和中显示类似的高效能(IC50在O. 5 μ g/ml以下)，并且不仅在实验室菌株AD-169中而且在所有迄今为止已测试的临床分离株中显示高效能。此外，本文中披露的抗体识别和确定gB蛋白的新的中和表位，其没有在之前描述过。由于它们高的亲和力和效能、和通过如在本文描述的功能性研究中所确定的其新表位结合的特性，本发明的结合成员尤其适合用于人类病人的hCMV感染的医学治疗、预防和/或诊断中。正如在本文中其他部分详细描述的，结合成员可用于治疗各种与CMV感染相关的紊乱。

发明内容
在本文中描述了几种高效力的gB特异性的中和hCMV的人类抗体，其还识别完全新的hCMV中和表位，并从而与所有其他公知的对于hCMV特异性的抗体相比，通过不同的治疗原理起作用。在下文中进一步披露了他们的发现和功能特性。正如在实施例中更详细描述的，已鉴定了 50种完全人源性hCMV中和抗体。从EBV转化的源于B细胞(其来自于感染hCMV的供体)的人类外周血中分离它们。如在表19和20中，详细描述了抗体I至50的⑶R序列。如在表7中，详细描述了一组抗体I至46的Vh区和\区的组合。在表7和19中涉及的所有的序列也显示在随附的序列表中，其形成本公开的一部分。
正如在下文中更详细描述的，在治疗的相应浓度(即IC5tl在1μ g/ml以下)下，根据本发明的结合成员已显示中和靶细胞的hCMV感染。最有活性的结合成员甚至IC5tl在O. 5 μ g/ml以下,也能中和hCMV。用代表不同gB遗传型的不同临床分离株(例如Towne和Altu ;表16)也检测到了中和能力。本发明的结合成员可以中和hCMV的一种或多种活性。例如，抑制的生物活性可以是预防成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、视网膜细胞和/或树突细胞的感染。在体外中和试验中，利用hCMV的重组菌株AD169 (其表达报告基因萤光素酶)已经证明预防成纤维细胞的感染。一旦感染这种基因修饰的hCMV株，靶细胞对萤光素酶的表达转为阳性，其能通过在标准发光计中适当的底物转化来检测。当首先与重组的荧光素酶阳性病毒株一起孵育，然后接种到初始的人类包皮成纤维细胞(HFF)的单层上时，本发明中描述的结合成员显示中和hCMV株AD169的感染。随后进一步孵育，使用发光计检测到了发光并且测定了相对光单位(RLU)。然后计算中和百分比，其中中和滴定度表示为结合成员的浓度(μ g/ml )，其使得靶细胞的hCMV感染减少50%或100%。结合成员在O. I至
5.O μ g/ml,优选O. I至2. O μ g/ml,更优选从O. 3至I. 3 μ g/ml或更优选从O. I至O. 6 μ g/ml 的浓度下可以使 hCMV 感染减少 50%。在 O. 1、0·5、1·0、1· I、I. 2、I. 3、I. 5 或 2. O μ g/ml的治疗相应浓度下，结合成员已经显示使得hCMV感染减少50%。可以使用其他方法测定hCMV感染性的中和，包括ELISA、FACS、蛋白质印迹法、免疫沉淀反应、和基于蚀斑形成和计数的肉眼观察。在本文中描述的结合成员显示不仅在成纤维细胞中中和人类hCMV，而且在内皮、上皮和树突细胞中也具有相似效能(如在使用初始的包皮成纤维细胞的试验中、实施例4和在使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的试验中、人ARPE-19视黄醛色素(视网膜色素，retinal pigment)上皮细胞和一次树突细胞的实验中所示的,如实施例7所示)。本发明披露了针对hCMV的高亲和力结合成员和特异性针对hCMVgB蛋白的高亲和力结合成员。本发明的结合成员可以结合具有不超过50nm的Kd,例如不超过25nm、15nm、10nm、5nm、3nm、I. 5nm、lnm、0. 5nm、0. lnm、75pm 或 57pm 的 Kd 的 hCMV gB 蛋白。优选地，结合成员的KD为Inm以下,优选小于O. 5nm,优选小于O. Inm,并且更优选小于75pm。Kd可以由表面细胞质基因组共振测定，例如JBiaeore'*^在本文的实施例5中描述了未和力的Biaeore"8测定。正如在本文中其他部分描述的，表面细胞质基因组共振涉及在流体相中使分析物流过附着在固体载体上的配体,并测定分析物与配体之间的结合速率(ka)和解离速率(kd)。例如可以进行表面细胞质基因组共振，从而使结合成员以流体相流过附着在载体上的gB蛋白。表面细胞质基因组共振数据可以拟合成单价分析物数据模型(monovalentanalyte data model)。亲和力可以表示为离解常数(KD)，其由解离速率常数和结合速率常数之比kd/ka计算出，正如使用单价分析物数据模型通过表面细胞质基因组共振测定的。在本文中描述的结合成员显示结合至hCMV gB蛋白的特异性区域。hCMV gB蛋白的已知表位位于gB菌株AD169 (SEQ ID No:239)的抗原区I (AD-1 ;在氨基酸552-635之间)内和/或抗原区2 (AD-2;在氨基酸67-86之间)内。在本发明中，我们描述了结合到hCMV gB蛋白的两种新抗原区上的结合成员，即抗原区4 (AD-4 ;在gB株AD169的氨基酸.121-132和344-438之间的不连续区域；SEQ ID No :239)抗原区5CAD-5 ;在gB株AD169的氨基酸133至343之间；SEQ ID No:239)。在初始实验中，研究了在本文中描述了以下六种结合成员结合至hCMV gB蛋白的特异性区域的能力单克隆重组抗体Ab-04、Ab-ll、Ab-14、Ab-19、Ab-28和Ab-42。尤其是，首先在山;.1(01^竞争实验(选择在本领域已知的结合到gB蛋白的AD-I或AD-2表位上的抗hCMV抗体)中研究了这六种结合成员的表位结合特异性。由于本发明的结合成员以高亲和力特异性地结合到gB蛋白上，但是不能与AD-I和AD-2特异性抗体竞争与gB的结合，显然，本发明的结合成员识别gB蛋白的中和表位。通过表达包含氨基酸残基100至447的gB蛋白的截短型(truncated version) (gB株AD169 ;SEQ IDN0:239)，其一旦在COS细胞中表达就会被本发明的结合成员识别，获得了对这个研究结果的进一步支持。在HCMV gB的分子模型产生之后(菌株AD169 ;SEQ ID No: 239)，识别了表面暴露的蛋白质区域，并且预测氨基酸残基121-132和344-438之间的不连续氨基酸序列为能够结合本发明的结合成员的可能表位。当该预测的表位表达为氨基酸116至132和344至440(gB株AD169 ;SEQ ID NO: 239)时，其与合成的氨基酸连接子(接头)偶联，人们发现，这种重组蛋白由本发明的结合成员Ab-ll、Ab-14或Ab-28特异性识别。这个新表位称为AD-4。因此，本发明的结合成员并不结合到hCMV gB蛋白的AD-I区。此外，本发明的结合成员并不结合到hCMV gB蛋白的AD-2区。相比之下，本发明的结合成员Ab-Ol至Ab_46结合到称为AD-4 (也称为区域II (Dom II))的新构象表位，其在氨基酸残基100至447之间，优选在氨基酸残基121至438之间。更优选，本发明的结合成员结合至gB株AD169的不连续氨基酸伸长序列(stretches) 116-132 和 344-440 (SEQ ID NO:239)，最优选 gB 株 AD169 中的伸长序列121-132和344-438 (SEQ ID N0:239)。在这点上，依照本发明应当理解由gB株AD169的氨基酸伸长序列121-132和344-438 (SEQ ID NO:239)生成的不连续表位构成了与gB株AD169的氨基酸伸长序列116-132和344-440 (SEQ ID N0:239)相同的表位。由于抗体Ab-Ol至Ab-46都具有结构上相关的⑶R (尤其是相同长度和相关序列的HCDR3)，并且来自于单一供体，这些抗体分子是原始gB反应性克隆最可能的体细胞突变型，并因此预期结合hCMV gB蛋白上相同或非常相似的重叠表位。因此，用重组抗体Ab-11、Ab-14或Ab-28获得的表位的表征结果，也预期为本文中披露的所有抗体Ab-Ol至Ab_46的代表。因此本发明涉及结合成员，优选抗体，其结合到由抗体Ab-I I ,Ab-14或Ab-28识别的gB蛋白的构象表位上，并且还涉及与任何抗体Ab-ll、Ab-14或Ab-28竞争结合到由这些抗体识别的gB蛋白的构象表位上的结合成员。因此在第一个实施方式中，本发明的结合成员可以在包含氨基酸116至132或氨基酸121至132的区域结合hCMV gB蛋白，正如由结构模型(实施例9)预测的。本发明的结合成员也可以在包含氨基酸344至440或氨基酸344至438的区域结合hCMV gB蛋白，正如由结构模型(实施例9)预测的。可选地，除了结合氨基酸116至132和/或氨基酸344至440之外，结合成员可以结合hCMV gB氨基酸序列中的侧接残基(flanking residue)或结构上临近的残基。按照惯例，残基编号对应于hCMV gB株AD169 (SEQ ID N0:239)。在进一步的实验中，还研究了在本文中描述的以下四种结合成员结合到hCMV gB蛋白的特定区域的能力单克隆的重组抗体Ab-47、Ab-48、Ab-49、Ab-50。尤其是，首先在ELISA竞争实验(实施例8. 3)中然后利用捕获法ELISA (capture ELISA)(实施例10. 2)研究了这四种结合成员的表位结合特异性。显然，这四种结合成员识别gB蛋白的进一步的新 中和表位。 在HCMV gB的分子模型(菌株AD169 ;SEQ ID No: 239)产生之后，鉴定了表面暴露的蛋白区域(蛋白结构域)，并且预测氨基酸残基133至343之间的氨基酸序列为能够结合本发明的结合成员的可能表位。将这个预测的表位细分并表达为两个子区域(subdomain):子区域I (氨基酸133-144和251-343)和子区域2 (氨基酸140至255) (gB株AD169 ；SEQID No: 239)。当在捕获法ELISA中测试时，本发明的结合成员Ab-47、Ab-49或Ab-50识别子区域I。氨基酸134至344的新表位区域(gB株AD169 ;SEQ ID No:239)已被命名为AD-5。因此，本发明的结合成员Ab-47、Ab-48、Ab-49或Ab-50不结合hCMV gB蛋白的AD-I区域。此外，本发明的结合成员不结合hCMV gB蛋白质的AD-2区域。相比之下，本发明的结合成员Ab-47至Ab-50结合至被称为AD-5 (也称为区域I (Dom I))的新构象表位，其在gB株AD169的氨基酸残基133至343之间(SEQ ID NO: 239)。因此本发明涉及结合成员，优选抗体，其结合至由抗体Ab-47、Ab-48 > Ab-49或Ab-50识别的gB蛋白的构象表位，并且还涉及与这四种抗体任一种竞争结合到由这些抗体识别的gB蛋白的构象表位上的结合成员。因此在第二个实施方式中，本发明的结合成员可以在包含氨基酸133至343的区域结合hCMV gB蛋白，正如从结构模型(实施例9)预测的。可选地,除了结合氨基酸133至343之外，结合成员可以结合hCMV gB氨基酸序列中的侧接残基或结构上临近的残基。按照惯例，残基编号对应于hCMV gB株AD169 (SEQ ID NO: 239)。本发明的结合成员可以包括抗体分子，例如具有完全人源的氨基酸序列的抗体分子。结合成员通常包括抗体％和/或八区。作为本发明的一部分，还披露了结合成员的Vh和'区。每一个'区包括互补决定区域(⑶R)和框架区(FR)。抗体的VHg包括三个HCDR区，指定为HCDR1、HCDR2和HCDR3。抗体的\区包括三个LCDR区，指定为LCDR1、LCDR2和LCDR3。Vh或\区的框架包括四个框架区，FWR1、FWR2、FWR3和FWR4，与CDR以下列结构散布FWRl-CDRl-FWR2-CDR2-FWR3-CDR3-FWR4。根据本发明的抗体Vh和\区以及CDR的实施例，列在形成本公开一部分的随附的序列表中。在下文中和表19中披露了进一步的CDR。在本文中披露的所有的V1^P'序列、⑶R序列XDR组和HCDR组和IXDR组代表本发明的多个方面和实施方式。正如在本文描述的一组CDR (CDR组)”包括CDR1、CDR2和CDR3。因此，一组重链CDR指的是HCDR1、HCDR2和HCDR3，一组轻链⑶R指的是IXDR1、IXDR2和IXDR3。除非另有说明，“一组⑶R(⑶R组)”包括HCDR和LCDR。典型地，本发明的结合成员是单克隆抗体。本发明的结合成员可以包括非抗体分子中的抗原结合位点，通常由一种或多种⑶R提供，例如在非抗体蛋白质支架(骨架，scaffold)中的一组⑶R，正如在下文中进一步讨论的。最初从感染hCMV的供体中分离，并从EBV永生化的B细胞系(称为SM1、SM3、SM4、SM5、SM6、SM7、SM9、SMlO或SM11)中分离根据本发明的结合成员Ab-Ol至Ab_46。从这九种细胞系能够鉴定人类抗体的37种不同Vh和62种不同\的编码序列(表6)。来自每一种细胞系的所有经鉴定的Vh和\编码序列的组合作为IgH和IgL链理论上能够产生295种不同的抗体。其中，已鉴定了 46种不同的重组抗体，其在使用萤光素酶表达、hCMV实验室菌株AD-169和初始(初代)人类包皮成纤维细胞的一线生物筛选试验中(first-line biological screening assay)中和hCMV。发现这些重组抗体中的六种以高效能(IC5tl在
Iμ g/ml以下)中和hCMV，并以15nm以下的Kd (下表13和15)以高的亲和力结合gB蛋白。结合成员的可变区的结构和位置可以参考Kabat等和其更新资料来确定。在本文中描述的是一组结合成员，每一种都包括在表19和20中所列举的⑶R组，其中HCDRl具有 Kabat 残基 31-35 ；HCDR2 具有 Kabat 残基 50-65 ；HCDR3 具有 Kabat 残基 95-102。LCDRl具有 Kabat 残基 24-34 ;LCDR2 具有 Kabat 残基 50-56，并且 LCDR3 具有 Kabat 残基 89-97。Kabat 编号利用网站 http://www. bioinf. orR. uk/abs/abnum/ 来石角定。本发明的第一实施方式的结合成员可以包括如在本文中描述的一种或多种CDR，例如⑶R3，也与可选的⑶Rl和⑶R2以形成一组⑶R。⑶R或⑶R组可以是如本文中描述的抗体Ab-Ol至Ab-46中的任何一种的⑶R或⑶R组，或者也可以是其变异体。结合成员可以包括抗体Ab-Ol至Ab-46任意一种的一组H和/或IXDR，这些抗体在公开的H和/或L CDR组中具有一个或多个氨基酸突变。氨基酸突变是一个氨基酸的替换、缺失(删除)或插入。基于提供的实施例和披露的序列，可以有，例如多达22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 I 个突变，例如在 H 和 / 或 L CDR 组内的替换。此外，在HCDR3中可以有多达9、8、7、6、5、4、3、2或I个突变，和/或在HCDR2中可以有多达6、5、4、3、2或I个突变，和/或在HCDRl中可以多达3、2或I个突变，和/或在IXDR3中可以有多达6、5、4、3、2或I个突变，和/或在IXDR2和/或LCRDl中可以有I个突变。突变可以是替换，或者与所披露的H和/或L⑶R组相比，H和/或L⑶R可以可选地包括一个氨基酸的插入或缺失。可以在⑶R的任一点进行替换(替代)、插入或缺失。例如，在HCDRl中，替换可以是Kabat残基31-35任何一个，例如Kabat残基31、32、34和/或35的任何一个，在HCDR2中替换可以是Kabat残基50-65的任何一个，例如Kabat残基50、53、54、58、60、和/或64的任何一个，并且在HCDR3中替换可以是Kabat残基99-102的任何一个，例如Kabat残基99-100C、100E、100F和/或100K-102的任何一个。例如，在LCDRl中，替换可以是Kabat残基24-34的任何一个，例如Kabat残基26或27，在LCDR2中替换可以是Kabat残基50-56的任何一个，例如Kabat残基56，并且在IXDR3中替换可以是Kabat残基89至97的任何一个，例如任何Kabat残基89并且在位置95B可以有插入。在分别关于HCDR和IXDR的表20a和20b中可以发现，特定氨基酸突变与抗体Ab-28的序列的详细信息的对比，例如氨基酸替换或插入。例如，本发明提供针对hCMV的经分离的结合成员，其包括一组⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和IXDR3，其中来自以下一组⑶R的⑶R组具有22个以下的氨基酸改
变，其中HCDRl具有氨基酸序列SEQ ID NO:3 ；HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:4 ；HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:5 ；LCDRl 具有氨基酸序列 SEQ ID NO:93 ； LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:94 ;以及LCDR3 具有氨基酸序列 SEQ ID NO:95。例如，根据本发明的结合成员或Vh区，可以包括具有一个或多个下列突变的抗体Ab-28 的 HCDRl 由Gly 替换 Kabat 残基的 Asp 31 ；由Phe 或 Tyr 替换 Kabat 残基的 His 32 ；由Ile或Leu替换Kabat残基的Met 34 ；以及由Asn 替换 Kabat 残基的 Val 350根据本发明的结合成员或VHg，可以包括具有一个或多个下列突变的抗体Ab-28的 HCDR2 由Ser 或 Cys 替换 Kabat 残基的 Trp 50 ；由Asn 或 His 替换 Kabat 残基的 Gln 53 ；由Thr 替换 Kabat 残基的 Ser 54 ；由Lys、Asn 或 His 替换 Kabat 残基的 Gly 58 ；由Ala替换Kabat残基的Gly 60 ；以及由Arg 替换 Kabat 残基的 Gln 64。根据本发明的结合成员或VHg，可以包括具有一个或多个下列突变的抗体Ab-28的 HCDR3 由Ala 替换 Kabat 残基的 Thr 99 ；由Met 替换 Kabat 残基的 Val 100 ；由Thr 替换 Kabat 残基的 Ser 100A ；由Thr 替换 Kabat 残基的 Asn 100B ；由Phe 替换 Kabat 残基的 Ser 100C ；由Met 或 Ala 替换 Kabat 残基的 Leu 100E ；由Gly 替换 Kabat 残基的 Ser 100F ；由Tyr 替换 Kabat 残基的 His 100K ；由Ser 或 Asp 替换 Kabat 残基的 Asn 100L ；由Val 或 Ile 替换 Kabat 残基的 Arg 100M ；由Met 替换 Kabat 残基的 Leu 100N ；
由Gly替换Kabat残基的Asp 101 ;以及由Val 或 Ile 替换 Kabat 残基的 Ala 102。 根据本发明的结合成员或\区可以包括抗体Ab-28的LCDRl，其中，Asn替换Kabat残基的Ser 26，或者Arg替换Kabat残基的Ser 27。根据本发明的结合成员或Vl区，可以包括其中由Pro替换Kabat残基的Ser 56的抗体 Ab-28 的 LCDR2。根据本发明的结合成员或'区，可以包括具有一个或多个下列突变的抗体Ab-28的 LCDR3 由Ala 替换 Kabat 残基的 Gly 89 ；由Trp 替换 Kabat 残基的 Pro 91 ； 由Ser 替换 Kabat 残基的 Arg 93 ；由Asp 替换 Kabat 残基的 Ser 94 ；由Gly 或 Ala 替换 Kabat 残基的 Ser 95a ；由Ala 插入 Kabat 残基 95b ；由Tyr替换Kabat残基的Val 96 ；以及由Val 替换 Kabat 残基的 Ile 97。因此，本发明的结合成员可以包括IXDR3，其中Kabat残基95b是Ala或其中Kabat残基95b缺失。本发明提供包括任何一个抗体Ab-Ol至Ab-46的HCDRl、HCDR2和/或HCDR3的结合成员，和/或任何一个抗体I至46的IXDRl、IXDR2和/或IXDR3，例如在表19或20中显示的任何抗体Ab-Ol至Ab-46的一组Q)R。例如，本发明的结合成员可以包括一组⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中:HCDR1 是 SEQ ID NO:8 ;HCDR2 是 SEQ ID NO:9 ;HCDR3 是 SEQ ID NO: 10 ；LCDRl是SEQ ID N0:98 ;LCDR2是SEQ ID N0:99 ;LCDR3是SEQ ID NO: 100，代表抗体Ab_02 的CDR。例如，本发明的结合成员可以包括一组⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中HCDR1 是SEQ ID NO: 13 ;HCDR2是SEQ ID NO: 14 ;HCDR3是SEQ ID NO: 15 ；LCDRl是 SEQ ID N0:103 ;LCDR2 是 SEQ ID NO: 104 ;LCDR3 是 SEQ ID NO: 105，代表抗体 Ab_04 的CDR。例如，本发明的结合成员可以包括一组⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中HCDR1 是SEQ ID NO: 18 ;HCDR2是SEQ ID NO: 19 ;HCDR3是SEQ ID NO:20 ；LCDRl是 SEQ ID N0:108 ;LCDR2 是 SEQ ID NO: 109 ;LCDR3 是 SEQ ID NO: 110，代表抗体 Ab-Il 的CDR。例如，本发明的结合成员可以包括一组⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中HCDR1 是SEQ ID NO:23 ;HCDR2是SEQ ID N0:24 ;HCDR3是SEQ ID NO:25 ；LCDRl是 SEQ ID N0:113 ;LCDR2 是 SEQ ID NO: 114 ;LCDR3 是 SEQ ID NO: 115，代表抗体 Ab_14 的CDR。例如，本发明的结合成员可以包括一组⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中=HCDRl 是 SEQ ID NO:3 ；HCDR2 是 SEQ ID NO:4 ；HCDR3 是 SEQ ID NO:5 ；LCDRl是 SEQ ID NO: 93 ;LCDR2 是 SEQ ID NO: 94 ;LCDR3 是 SEQ ID 勵:95，代表抗体六13-28的0)1 。
例如，本发明的结合成员可以包括一组CDR HCDR1, HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和 LCDR3，其中=HCDRl 是 SEQ ID NO:28 ；HCDR2 是 SEQ ID NO:29 ；HCDR3 是 SEQ ID NO:30 ；LCDRl 是SEQ IDN0:108 ;LCDR2 是SEQ ID NO: 109 ;LCDR3 是SEQ ID NO: 110，代表抗体Ab_42的 CDR。结合成员可以包括这些抗体之一的一组Vh⑶R。可选地，也可以包括这些抗体之一的一组Vf DR，并且'CDR可以来自与Vh⑶Rs相同的或不同的抗体。本发明也提供了包括任何一种抗体Ab-OI至Ab-46的一组HCDR的Vh区域，和/或包括任何一种抗体Ab-Ol至Ab-46的一组HCDR的 '区。代表性地，虽然下文中进一步讨论了 Vh或\区可以单独用于结合抗原，但是Vh区与\区配对以提供抗体的抗原结合位点。抗体Ab-28的Vh区可以与抗体Ab-28的\区配对，以便形成包含抗体Ab-28VH和\区两者的抗体抗原结合位点。提供了在本文中披露的其他Vh和\区的类似实施方式。在其他实施方式中，抗体Ab-28VH与除抗体\之外的\ 区配对。本领域充分建立了轻链混杂(promiscuity) (Kang等，1991 )。此外,本发明提供了在本文中披露的其他Vh和\区的类似实施方式。因此，包括任何一种抗体I至46的Vh的IgH链可以与包括任何一种抗体Ab-Ol至Ab-46的\的IgL链配对，以便生成gB特异性结合成员。结合成员可以包括具有一个或多个⑶R的抗体分子，例如在抗体框架内的一组CDR0框架区可以是人胚系基因节段序列。人胚系基因节段序列对于本领域技术人员是已知，并且能够从例如VBase编译或IMGT在线数据库(http: //imgt. cines. fr)中获得。本发明的结合成员可以是经分离的人抗体分子，其具有包括人胚系框架中的一组HCDR的Vh区，例如IGHV1-2。因此，Vh区框架区FWR1、FWR2和/或FWR3可以包括人胚系基因节段IGHV1-2的框架区。FWR4可以包括选自例如SEQ ID No: 188至191的人胚系J节段的框架区。Vh FffRl的氨基酸序列可以是SEQ ID No: 181。Vh FWR2的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 182。Vh FWR3 的氨基酸序列可以是 SEQ ID NO: 183 或 184。本发明的抗体分子或Vh区可以包括以下组的重链框架区FWRl SEQ ID No: 181 ；FWR2SEQ ID No: 182 ；FWR3SEQ ID No: 183 或 184 ;或可以包括具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸改变(如替换、插入或缺失)的所述重链框架区。而且，本发明的抗体可以包括由至少80%同一于IGHV1-2胚系基因序列的核酸序列编码的Vh区，优选核酸序列至少90%、95%、96%、97%同一于IGHV1-2胚系基因序列，并且更优选至少98%、99%同一于IGHV1-2胚系基因序列。本发明的抗体的Vh区可以是至少80%同一于由IGHV1-2胚系基因序列编码的Vh区的氨基酸序列。优选Vh区的氨基酸序列至少90%、95%、96%、97%同一于由IGHV1-2胚系基因序列编码的氨基酸序列，并且更优选，至少98%,99%同一于由IGHV1-2胚系基因序列编码的氨基酸序列。通常，结合成员还具有'区，其包括一组IXDR，例如在人胚系框架中，例如IGLV1-51。因此，Vl区框架区可以包括人胚系基因节段IGLV1-51的框架区FWR1、FWR2和/或FWR3。FWR4可以包括人胚系J节段IGLJ2的框架区(SEQ ID NO: 193)。'FWRl的氨基酸序列可以是SEQ ID No: 185。Vl FWR2的氨基酸序列可以是SEQ ID No: 186。'FWR3的氨基酸序列可以是SEQ ID No: 187。
本发明的抗体分子或八区可以包括以下组的轻链框架区FWR1 SEQ ID No:185 ；FWR2SEQ ID No:186 ；FWR3SEQ ID No: 187 ;或可以包括具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸改变(如替换、插入或缺失)的所述组的轻链框架区。此外，本发明的抗体可以包括' 区,其由至少80%同一于IGLV1-51胚系基因序列的核酸序列编码。优选核酸序列至少90%、95%、96%、97%同一于IGLV1-51胚系基因序列，并且更优选至少98%、99%同一于IGLV1-51胚系基因序列。本发明的抗体\区域可以至少80%同一于由IGLV1-51胚系基因序列编码的\区的氨基酸序列。优选\区的氨基酸序列至少90%、95%、96%、97%同一于由IGLV1-51胚系基因序列编码的氨基酸序列，并且更优选，至少98%、99%同一于IGLV1-51胚系基因序列编码的氨基酸序列。例如，本发明的抗体分子可以包括一组重链和轻链框架区，其中重链FWRl是SEQID No:181 ;重链 FWR2 是 SEQ ID No: 182 ;重链 FWR3 是 SEQ ID No: 183 ;轻链 FWRl 是 SEQID No:185 ;轻链 FWR2 是 SEQ ID No: 186 ;轻链 FWR3 是 SEQ ID No: 187 ;或可以包括具有 10 个以下(例如5个以下的氨基酸改变，例如替换)的所述组的重链和轻链框架区。根据本发明，最初从三位感染hCMV的供体中分离并从EBV永生化的B细胞系(称为SM10、SM12、2C2或1G2)中分离结合成员Ab_47至Ab_50。从这四种细胞系中，可以鉴定人类抗体的四种不同的Vh和五种不同的'编码序列(表12)。来自每种细胞系的所有经鉴定的Vh和\编码序列的组合作为IgH和IgL链理论上能够产生20种不同的抗体。其中，已鉴定了四种不同的重组抗体，其在使用萤光素酶表达、hCMV实验室菌株AD-169和初始人类包皮成纤维细胞的一线生物筛选试验中中和hCMV。发现所有这些重组抗体以高效能中和hCMV (IC5tl 在 O. 6 μ g/ml 以下，下表 14)。结合成员可变区的结构和位置可以参考Kabat等(1991)和其更新资料确定。在本文中描述的是结合成员Ab-46、Ab-47、Ab-48和Ab_50，其每一种包括在表19中列举的CDR组，其中的⑶R通过Kabat编号系统(Kabat和Wu, 1991)识别并且使用网站http://www.bioinf. orR. uk/abs/abnum/ 确定。本发明的第二实施方式的结合成员可以包括如在本文中描述的一种或多种CDR，例如⑶R3，以及也可选的⑶Rl和⑶R2以形成一组⑶R。⑶R或⑶R组可以是任何一种抗体Ab-47至Ab-50的⑶R或⑶R组，或者可以是在本文中描述的其变异体。结合成员可以包括在公开的H和/或L CDR组中具有一个或多个氨基酸突变的任何一种抗体Ab-47至Ab-50的一组H和/或L⑶R。氨基酸突变是一个氨基酸的替换、缺失或插入。基于提供的实施例和公开的序列，在H和/或L⑶R组内可以有例如多达10、9、8、7、6、5、4、3、2或I个突变。突变可以是替换，或者与公开的H和/或L⑶R组相比，H和/或L⑶R可以可选地包括一个氨基酸的插入或缺失。可以在⑶R中的任一点进行替换、插入或缺失。本发明提供包括任何一种抗体Ab-47至Ab-50的HCDRl、HCDR2和/或HCDR3的结合成员，和/或任何一种抗体Ab-47至Ab-50的IXDRl、IXDR2和/或IXDR3，例如在表19中显示的任何抗体Ab-47至Ab-50的一组CDR。例如，本发明的结合成员可以包括一组⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中=HCDRl 是 SEQ ID No:243 ;HCDR2 是 SEQ ID No:244 ;HCDR3 是 SEQ ID No:245 ；LCDRl 是 SEQ ID No:263 ;LCDR2 是 SEQ ID No: 264 ;LCDR3 是 SEQ ID No: 265，代表抗体Ab_47的 CDR。例如，本发明的结合成员可以包括一组⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中=HCDRl 是 SEQ ID No:248 ;HCDR2 是 SEQ ID No:249 ;HCDR3 是 SEQ ID No:250 ；LCDRl 是 SEQ ID No:268 ;LCDR2 是 SEQ ID No: 269 ;LCDR3 是 SEQ ID No: 270，代表抗体Ab_48的 CDR。例如，本发明的结合成员可以包括一组⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中=HCDRl 是 SEQ ID NO: 253 ;HCDR2 是 SEQ ID NO: 254 ;HCDR3 是 SEQ ID NO: 255 ；LCDRl 是SEQ ID N0:273 ;LCDR2 是SEQ ID NO: 274 ;LCDR3 是SEQ ID NO: 275，代表抗体Ab_49的 CDR。例如，本发明的结合成员可以包括一组⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中=HCDRl 是 SEQ ID NO: 258 ;HCDR2 是 SEQ ID NO: 259 ;HCDR3 是 SEQ ID NO: 260 ；LCDRl 是SEQ ID N0:278 ;LCDR2 是SEQ ID NO: 279 ;LCDR3 是SEQ ID NO: 280，代表抗体Ab_50的 CDR。 本发明的结合成员可以是经分离的人抗体分子，其具有包括人胚系框架中的一组HCDR的Vh区，例如IGHV4-39或IGHV4-59。因此，VH区框架区FWR1、FWR2和/或FWR3可以包括人胚系基因节段IGHV4-39或IGHV4-59的框架区。FWR4可以包括选自任意六种重链J节段的人胚系J节段的框架区(见Ravetch等，1981 )。Ab-47或Ab-50的Vh区的氨基酸序列，可以包括以下组中的IGHV4-39的重链框架g =FffRlSEQ ID No:281,FWR2SEQ ID No: 282, FWR3SEQ ID No: 283，或可以包括具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸改变(如替换、插入或缺失)的所述组的重链框架区。Ab-48或Ab-48VHg的氨基酸序列，可以包括以下组中的IGHV4-59的重链框架区FffRlSEQ ID No:284,FWR2SEQ ID No: 285，FWR3SEQID No: 286，或可以包括具有 1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸改变(如替换、插入或缺失)的所述组的重链框架区。而且，本发明的抗体可以包括由至少75%同一于IGHV4-39或IGHV4-59胚系基因序列的核酸序列编码的Vh区，优选核酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%同一于IGHV4-39或IGHV4-59胚系基因序列，并且更优选至少98%、99%同一于IGHV4-39或IGHV4-59胚系基因序列。本发明的抗体Vh区可以至少75%同一于由IGHV4-39或IGHV4-59胚系基因序列编码的Vh区的氨基酸序列。优选，Vh区的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%,97%同一于由IGHV4-39或IGHV4-59胚系基因序列编码的氨基酸序列，并且更优选至少98%,99%同一于IGHV1-2胚系基因序列编码的氨基酸序列。本发明的结合成员也可以包括Vl区，其包括人胚系框架中K轻链⑶R (kappa轻链CDR)，例如IGKV2D-28或IGKV1D-33。因此，\区框架区FWR1、FWR2和/或FWR3可以包括人胚系基因节段IGKV2D-28或IGKV1D-33的框架区。FWR4可以包括选自任何五种Kjf段(kappa J节段)中的人胚系J节段的框架区(参见Hieter等，1982)。Ab-47或Ab_48VL区的氨基酸序列可以包括以下组中的IGKV2D-28的κ轻链框架区=FffRlSEQ ID No: 287，FWR2SEQ ID No: 288，FWR3SEQ ID No: 289，或可以包括具有 I 或 2个氨基酸改变(如替换、插入或缺失)的所述组的轻链框架区。Ab-49\g的氨基酸序列，可以包括以下组中的IGKV1D-33的轻链框架区FWR1SEQID No :290, FWR2SEQ ID No :291, FWR3SEQ ID No: 292，或可以包括具有 1、2、3、4、5、6、7、或8个氨基酸改变(如替换、插入或缺失)的所述组的轻链框架区。本发明的结合成员也可以包括'区，其包括人胚系框架中的一组λ轻链(lambdalight chain)CDR，例如IGLV1-47。因此，Vl区框架区FWR1、FWR2和/或FWR3可以包括人胚系基因片段IGLV1-47的框架区。FWR4可以包括选自任意四种λ J节段(lambda J segment)的人胚系J节段的框架区(参见Udey和Blomberg 1987 ；Vasicek和Leder, 1990)。Ab_50VL区的氨基酸序列可以包括以下组中的IGLV1-47的λ轻链框架区FffRlSEQ ID N0:293，FWR2SEQ ID NO: 294,FWR3SEQ ID NO: 295，或可以包括具有 I 或 2 个氨基酸改变(如替换、插入或缺失)的所述组的轻链框架区。
而且，本发明的抗体可以包括由至少90%同一于IGKV2D-28、IGKV1D-33或IGLV1-47胚系基因序列的核酸序列编码的\区。优选核酸序列至少95%、96%、97%同一于IGKV2D-28、IGKV1D-33或IGLV1-47胚系基因序列，并且更优选至少98%、99%同一于IGKV2D-28、IGKV1D-33或IGLV1-47胚系基因序列。本发明的抗体Vl区，可以至少90%同一于由IGKV2D-28、IGKV1D-33或IGLV1-47胚系基因序列编码的\区的氨基酸序列。优选Vl区的氨基酸序列至少95%、96%、97%同一于由IGKV2D-28、IGKV1D-33或IGLV1-47胚系基因序列编码的氨基酸序列，并且更优选至少98%、99%同一于由IGKV2D-28、IGKV1D-33或IGLV1-47胚系基因序列编码的氨基酸序列。本发明的结合成员可以是一种与以下任何一种结合成员竞争结合hCMV(的结合成员)，其(i)结合hCMV并且(ii)包括结合成员、V1^P/或'区、⑶R，例如在本文中披露的HCDR3 和 / 或 CDR 组。可以在体外测定结合成员之间的竞争，例如，利用结合实验，如ELISA、表面细胞质基因组共振、和/或通过在一种结合成员上标记特定的报告分子，其能够在一种或多种其他未标记的结合成员存在下被检测到，以使之能够识别结合相同表位或重叠表位的结合成员。本领域技术人员容易获知这样的方法，并且在本文中更详细地描述了这样的方法(参见实施例)。因此，本发明进一步的方面提供了结合成员，其包括与抗体分子竞争的抗体抗原结合位点，例如包括Vh和/或 '区、⑶R，例如任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50的HCDR3或⑶R组的抗体分子，用于结合至hCMV。在进一步的方面中，本发明提供包括编码结合成员的序列的经分离的核酸，这些结合成员包括根据本发明的Vh区和/或 '区，以及制备包括本发明的Vh区和/或\区的结合成员的方法，及回收它的方法，这些Vh区和/或\区是由所述核酸在致使包括Vh区和/或\区的结合成员产生的条件下编码的。本发明另外的方面提供编码任何在本文中披露的Vh CDR或'CDR序列的经分离的核酸。进一步的方面提供一种宿主细胞，其包括本发明的核酸或用本发明的核酸转染。本发明进一步的方面描述了包括本发明的结合成员的组合物，和在结合、抑制和/或中和hCMV感染的方法中的应用，包括通过疗法治疗人或动物体的方法。根据本发明的结合成员可以用于治疗或诊断的方法中，如治疗(其可以包括预防性治疗)人或动物体(例如人类病人)的疾病或紊乱的方法中，其包括给予所述人或动物体有效量的本发明的结合成员或本发明的几种结合成员的组合。根据本发明的可治疗的病症包括其中hCMV起作用的任何一种，正如在本文中的其他部分详细描述的。
在下文中进一步详细描述了本发明的这些和其他方面。术语为方便在此处指出，在本文中使用的“和/或”视为两个特定特性或组分(部分)中的每一个与或不与另一个而具体公开。例如，“A和/或B”视为(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开，就像本文中单独地给出了每一种(情况)。hCMV人类巨细胞病毒(hCMV)的全长氨基酸序列具有GenBank Acc No. X17403 (人类巨细胞病毒菌株AD169的全部基因组)，并且包括229354个碱基对序列(Chee等，1990 ；Bankier 等，1991 )。gB gB复合物是CMV病毒粒包膜的一种表面糖蛋白复合物。有大量不同的gB蛋白株gB 株 AD169-SwissProt Acc. No. P06473 (SEQ ID NO:239)。gB 株 Towne-SwissProt Acc. No. P13201 (SEQ ID NO:240)。已知的gB中和区域包括抗原区域-I (AD-1 ;SEQ ID No:239[AD169]的氨基酸552-635)和抗原区域-2 (AD-2 ；SEQ ID No. 239[AD169]的氨基酸67-86)。还存在进一步的抗原区域AD-3 (SEQ ID No. 239 [AD169]的氨基酸783-906)。这个区域位于病毒内部并且不是中和抗体的靶标。结合成员这描述了结合彼此的分子对的一个成员。结合对的成员可以是自然得到的或完全或部分合成制备的。结合对的一个成员可以是，多肽、核酸、碳水化合物、脂类、小分子量化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA干扰(素)(RNAi ;参见Milhavet等，2003)、反义(分子)(参见Opal inska和Mihavet, 2003 )、重组蛋白、抗体或其片段或结合物(轭合物，缀合物)或其融合蛋白。本发明使用的反义(分子)抑制剂或RNAi抑制剂可以包括能够调控基因表达(例如，能够向下调节(下调)编码hCMV gB蛋白的序列的表达)的核酸分子。这样的核酸分子可以包括，但是不局限于反义分子(antisense molecules)、短干扰核酸(siNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA (小RNA，micro RNA)、短发夹RNA (shRNA)、核酸传感器分子、异型酶、酶促核酸分子和三联寡核苷酸以及任何其它核酸分子，其可以用于介导RNA干扰“RNAi”或以序列特异性方式的基因沉默。分子对的一个成员可以在表面上具有区域或空洞，其结合并因此与特定空间或极性排列的分子对的其他成员互补。结合对类型的实例是抗原-抗体、受体-配体和酶-底物。结合成员通常包含具有结合位点的分子。例如，结合成员可以是抗体分子或包括结合位点的非抗体蛋白质。结合位点可以通过以下手段提供在抗体框架区和/或非抗体蛋白质支架(骨架，scaffolds)(如纤连蛋白或细胞色素B等)上配置⑶R (Haan和Maggos2004 ；Koide等，1998 ；Nygren等，1997),或在蛋白质支架内随机化或变异环(loop)上的氨基酸残基，以便赋予对于期望靶标的结合特异性。Nygren等已详细综述了用于在蛋白质中工程化设计新结合位点的支架。WO 00/034784A1 (Lipovsek)披露了用于抗体模拟物的蛋白质支架，其中描述了蛋白质(抗体模拟物)包括具有至少一个随机化的环的纤连蛋白III型区域(结构域)。可以由免疫球蛋白基因总科的任何区域(结构域)成员提供将适宜的支架接枝到一种或多种CDR，例如一组HCDR中。支架可以是人类蛋白质或非人类蛋白质。非抗体蛋白质支架的优势是，它可以在支架分子中提供抗原结合位点，这些支架分子比至少一些抗体分子小和/或更易于生产。可以赋予小尺寸的结合成员有用的生理特性，如进入细胞，深入组织或在其他结构内到达靶标，或在目标(祀标)抗原的蛋白质空洞内结合的能力。Wess (2004)综述了使用非抗体蛋白质支架中的抗原结合位点。典型是具有稳定主链和一个或多个可变环的蛋白质，其中特定地或随机地变异一个环或多个环的氨基酸序列以创建结合祀标的抗原结合位点。这样的蛋白质包括来自金黄色酿脓葡萄球菌(S aureus)、转铁蛋白、四连接素、纤连蛋白、脂质运载蛋白(Iipocalin)以及结晶的和其他Affilin 支架(Scil蛋白质)的蛋白A的IgG结合区域。其他方案的实例包括合成的“微体”，其基于具有分子内二硫键的环肽-小蛋白、微蛋白(Versabodies , Amunix)和锚蛋白重复蛋白质(DARPins,分子伴侣)。除抗体序列和/或抗原结合位点之外，根据本发明的结合成员可以包括其他氨基 酸，例如形成肽或多肽(如折叠区)，或赋予分子除结合抗原的能力之外的另外的功能特性。本发明的结合成员可以携带可检测的标记物，或者可以结合(缀合，共轭)于毒素或靶向部分或酶(例如经由肽键或连接子(接头))。例如，结合成员可以包括催化部位(例如在酶区域)以及抗原结合位点，其中抗原结合位点结合到抗原上并因此靶向对抗原的催化部位。催化部位可以抑制抗原的生物功能，例如通过裂解。正如所指出的，虽然可以通过非抗体支架携带⑶R，但是用于携带本发明的⑶R或一组CDR的结构通常会是抗体的重链或轻链序列或其实质性部分，其中CDR或CDR组位于对应于自然发生由重排的免疫球蛋白基因编码的Vh和\抗体可变区的CDR或CDR组的位置。免疫球蛋白可变区的结构和位置可以参考Kabat和Wu (1991)和其更新资料确定。大量学术和商业在线资源可用来查询这个数据库。例如，参见Martin (1996)和相关的在线资源，目前在 http: //www. bioinf. orR. uk/abs/simkab. html 的网址上。通过⑶R区域或⑶R，用来表示由Kabat等(同上)定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高可变区。抗体典型地包括3个重链⑶R，称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及3个轻链⑶R,称为IXDR1、IXDR2和IXDR3。在此处使用术语⑶R或多个⑶R是为了表示这些区域中的一个或几个、乃至全部，这些区域包括负责通过抗体针对抗原或其识别的表位的亲和力结合的大多数氨基酸残基。在六个⑶R序列中，重链的第三个⑶R (HCDR3)具有最大的变异性，即更大的多样性，本质上由于本领域公知的机制，如胚系免疫球蛋白重链基因座的V、D和J基因节段的V(D)J重排。HCDR3可以短至两个氨基酸或长至26个氨基酸，或可以具有这两个极端值之间的任意长度。⑶R长度也可以随由特定的基础框架(underlying framework)能够容纳的长度而变化。功能上，HCDR3能够在抗体特异性的测定中发挥重要作用(Segal等，1974 ；Amit等，1986 ；Chothia 等，1987,1989 ；Caton 等，1990 ；Sharon, 1990a ；Sharon, 1990b ；Kabat 等，1991)。在本发明的结合成员Ab-Ol至Ab-46中，正如在表20a和20b中表明的，HCDRl可以是5个氨基酸长，包括Kabat残基31-35。HCDR2可以是17个氨基酸长，包括Kabat残基50-65。HCDR3可以是22个氨基酸长，包括Kabat残基95-102。LCDRl可以是13个氨基酸长,包括Kabat残基24-34。LCDR2可以是7个氨基酸长，包括Kabat残基50-56。LCDR3可以是10个氨基酸长，包括Kabat残基89-97。在本发明的结合成员Ab-47至Ab-50中，HCDRl可以是7或5个氨基酸长，分别包括Kabat残基31-37或31-35。HCDR2可以是16个氨基酸长，而HCDR3可以是10、15、17或22个氨基酸长。IXDRl可以是11个氨基酸长，包括Kabat残基24-34 ;或13个氨基酸长，包括Kabat残基23-35 ;或16个氨基酸长，包括Kabat残基24_39。LCDR2可以是7个氨基酸长，而LCDR3可以是9个氨基酸长。抗体分子这描述了不论是自然地还是部分地或完全合成制备的免疫球蛋白。该术语也覆盖了包括抗体抗原结合位点的任意多肽或蛋白质。在此必须理解，本发明不涉及天然形态的抗体，也就是说，它们不在其自然环境中，但是它们已能通过从自然资源中的纯化而分 离或获得，否则通过遗传重组获得，或通过化学合成获得，然后它们能够包括非天然的氨基酸。包括抗体抗原结合位点的抗体片段包括，但是不局限于，诸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab ' -SH、scFv、Fv、dAb和Fd的分子。已工程化设计出了包括一个或多个抗体抗原结合位点的各种其他抗体分子，包括例如Fab2、Fab3、二聚抗体(双抗体，diabodies)、三聚抗体(triabodies)、四聚抗体(tetrabodies)和微型抗体(minibodies),以及双特异性(bispecific)抗体和三特异性(trispecific)抗体。在 Hollilnger 和 Hudson (2005)中描述了抗体分子和用于构建它们的方法以及它们的应用。采用单克隆抗体和其他抗体以及使用重组DNA技术以产生结合目标抗原的其他抗体或嵌合分子是可能的。这样的技术可能涉及向不同的免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区引入编码免疫球蛋白可变区或抗体的⑶R的DNA。例如，参见EP0184187A(Kudo等)或EP0239400A(Winter)。生产抗体的杂交瘤或其他细胞可以经受基因突变或其他改变，其可以改变或可以不改变产生的抗体的结合特异性。由于抗体能够以大量方法修饰，术语“抗体分子”应当解释为覆盖任意结合成员或带有抗体抗原结合位点(对抗原具有期望的特异性和/或结合)的物质。因此，该术语覆盖双特异性或三特异性抗体以及抗体片段和衍生物，包括任何多肽，其包含抗体抗原结合位点，无论是天然的还是完全或部分合成的。因此包括融合到另外的多肽(例如来源于另外的物种或属于另外的抗体类或子类)上的包含抗体抗原结合位点或等价物的嵌合分子。例如EP0120694A (Boss等)和EP0125023A (Cabilly等)描述了嵌合抗体的克隆和表达。在抗体工程化领域中可用的进一步的技术使分离人类和人化抗体成为可能。例如，正如Kontermann和Dubel (2001)描述的，能够制备人类杂交瘤。在许多出版物，如Kontermann和Dubel (同上)和WO 92/01047A1 (McCafferty等)中已经详细描述了用于产生结合成员的另一种已创建的技术，噬菌体显示。可以使用以下转基因小鼠分离人类抗体(其中使转基因小鼠的小鼠抗体基因失活，并且用人类抗体基因功能性取代，同时保持小鼠免疫系统的其他组分完整XMendez等，
1997)。可替代地，由Grawunder和Melchers (W0 03/068819A1)所描述的方法可以用于产生基因修饰的脊椎动物前体淋巴细胞以产生异源抗体或结合蛋白质。使用本领域公知的技术可以产生人化抗体，如在例如WO 91/09967A1 (Adair等)中披露的那些。而且，WO04/006955A1 (Foote)描述了用于人化抗体的方法，基于通过以下(操作)从人抗体基因中选择可变区框架序列，即这些人抗体基因通过将针对非人类抗体的可变区的CDR序列的规范(canonical)CDR结构类型,例如胚系抗体基因节段与来自人抗体序列文库的相应CDR的规范CDR结构类型进行比较。具有与非人类CDR相似的规范CDR结构类型的人抗体可变区形成从其中选择人类框架序列的人抗体序列成员的子组(subset)。子组成员可以通过人和非人类⑶R序列之间的氨基酸相似性进一步排列。在WO 04/006955A1 (同上)的方法中，选择排名最前的人类序列以提供框架序列，用于构建嵌合抗体，其使用选定的人类框架子组成员，用非人类CDR对应物功能性替代CDR序列，从而在不需要比较非人类和人类抗体的框架序列的情况下，提供高亲和力和低免疫性的人化抗体。还披露了根据该方法制备的嵌合抗体。已显示全抗体的片段能够进行结合抗原的功能。结合片段的实例是(i)包括'、VH、Cl和ChI区的Fab片段；(ii )包括Vh和ChI区的Fd片段；(iii )包括单个抗体的Vl和Vh 区的 Fv 片段；(iv) dAb 片段(Ward 等 1989 ；McCafferty 等，1990 ；Holt 等，2003),其包括Vh或 ' 区；(V)经分离的⑶R区域；(vi)F(ab' )2片段，包括二个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv),其中Vh区和\区通过肽连接子(连接肽，linker)连 接，该肽连接子允许两个区域缔合以形成抗原结合位点(Bird等，1998 ；Huston等，1988)；(viii)双特异性单链Fv 二聚体(W093/011161A1 (Whitlow等))和(ix) “二聚抗体(双抗体，双体)”，由基因融合构建的多价或多特异性片段(Holliger等1993和WO 94/13804A1)。可以通过二硫桥的合并连接Vh和\区稳定Fv、scFv或二聚抗体(双抗体)分子(Reiter等，1996)。也可以制备包括scFv与Ch3区连接的微型抗体(Hu等，1996)。结合片段的其他实例是Fab’，其通过在重链ChI区(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)的羧基末端添加几个残基而不同于Fab片段，以及Fab’ _SH，其为一种Fab’片段，其中恒定区的半胱氨酸残基(多个半胱氨酸残基)含有游离巯基。也已描述了抗体分子，其包括仅二个由框架区连接的⑶R (Qui等，2007)。利用通过选定的⑶Rl或⑶R2的C末端经由框架区与⑶R3的N末端连接的键接将来自Vh或 '区的⑶R3连接到其他区域的⑶Rl或⑶R2环上。区域抗体(结构域抗体，domain antibody) (dAb)是抗体的一种小型单体抗原结合片段，即抗体重链可变区或轻链可变区(Holt等，2003)。Vh dAb自然发生(出现)在骆驼科动物(camelid)(例如骆驼、美洲驼羊(llama))中，并且可以通过用目标抗原使骆驼科动物免疫、分离抗原特异性B细胞并直接从个别B细胞中克隆dAb基因而产生；然而，也能够在细胞培养物中产生dAb。本发明的结合成员可以是dAb，其包括基本上如在本文中给出的Vh或V区或包括基本上如本文中给出的一组⑶R的Vh或 '区。以任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50起始,通过如酶消化(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原裂解二硫桥的方法能够获得本发明的抗体片段。在另外的方式中，通过本领域技术人员公知的基因重组技术或者通过肽合成或通过核酸合成和表达能够获得包括在本发明中的抗体片段。根据本发明的功能抗体片段包括其半衰期通过化学修饰，尤其是PEG化，或例如通过在脂质体中合并，而增加的任意功能片段。双特异性或双功能的抗体形成两种不同的可变区合并在同一种分子(Hoi Iiger和Bohlen，1999)中的第二代单克隆抗体。因此，双特异性抗体可以具有由可变区编码的两种不同的结合特异性，从而结合到单一或多种目标抗原的两个不同表位上。从它们对于募集(recruit)新效应器的功能或对于靶向肿瘤细胞表面上的几种分子的能力已证明其在诊断领域和在治疗领域的应用。例如，可以用另外的细胞毒机制装配(arm)抗体，如放射性同位素、细菌毒素、炎症细胞因子、化疗药(chemotherapuetics)或前药。在使用双特异性抗体的情况下，这些可以是常规的双特异性抗体，其可以用各种方法(Holliger和Winter，1993)制备。双特异性抗体的实例包括:BiTF/技术(Micromet, Inc)中的那些，其中可以使用具有不同特异性的两种抗体的结合区域，并直接经由短的柔性肽键连接。这在短的单个多肽链上组合两个抗体。在没有Fe区域而仅使用可变区的情况下能够构建二聚抗体(双抗体)和scFv，潜在地降低抗个体遗传型反应的效应。能够使双特异性抗体构建成为整个IgG、成为细胞杂交瘤(quadroma)(双重特异性抗原结合片段(Fab)加Fe Y )、成为双特异性F(ab’)2、成为Fab’ PEG、成为异源二聚Fab、成为二聚抗体(双抗体)或成为双特异性或异源二聚体scFv (在Kufer等的综述中，2004)。而且，可以使用本领域公知的常规方法连接两种双特异性抗体以形成四价抗体。与双特异性全抗体相反，双特异性二聚抗体也可以是特别有用的，因为能够在大肠杆菌中容易地构建和表达它们。 最新关于多特异性抗体的研究已经指向开发混合抗体，其中由单一克隆细胞产生三到五种重组人单克隆抗体。组分抗体共享同一个免疫球蛋白轻链可变区，以便确保与混合物中的抗体种类有关的所有结合位点是功能性的(Oligoclonics ；MerusBiopharmaceuticals BV ；W0 04/106375A I)。组分抗体可以包括不同的形式，如全IgG或Fab片段或抗体的全长免疫球蛋白和片段的混合物。选择针对超级生物活性(如在病毒中和中提高的潜能、对细胞因子和趋化因子的改进的中和和去除、增强的杀死肿瘤细胞和预防逃逸以及改进的防护病毒的呼吸)的组分抗体。可利用本领域的各种方法以获得抗hCMV的抗体。抗体可以是单克隆抗体，尤其是人源的，其能根据本领域技术人员公知的标准方法获得。通常，对于单克隆抗体或它们的功能片段的制备，特别是源于小鼠的，可能涉及在手册“Antibodies” (Harlow和Lane, 1988)中特别描述的技术或涉及由Kohler和Milstein (1975)描述的由杂交瘤的制备技术。可以从以下来源获得单克隆抗体，例如，动物或人类免疫的抗hCMV的B细胞中或一种例如包括由所述单克隆抗体识别的表位的gB的片段。在本文中描述了适宜的片段和肽或包括它们的多肽，并且它们可以用于使动物免疫以产生抗hCMV的抗体。根据通常的操作方法可以产生hCMV抗体或它的一种片段，这些方法通过以包含在cDNA序列中用于编码hCMV或其片段的核酸序列为起始的基因重组、和/或以包含在hCMV的肽序列和/或其片段中的氨基酸序列为起始的肽合成来产生。例如，可以在亲和柱上纯化单克隆抗体，在该亲和柱上已经预先固定了 hCMV蛋白或包含由所述单克隆抗体识别的表位的其组分蛋白中的一种。更特别的是，可以通过以下方法纯化单克隆抗体，即蛋白A和/或蛋白G的色谱法，接着进行或不进行旨在消除自身的残余蛋白污染物以及DNA和LPS的离子交换色谱法，接着进行或不进行琼脂糖凝胶上的排阻色谱法以便消除由于二聚体或其他多聚体存在的潜在聚集。可以同时或顺次地使用任何的这些技术。抗原结合位点这描述了结合到并且互补于目标抗原的全部或部分的分子的一部分。在抗体分子中，其称为抗体抗原结合位点，并且包括结合到并且互补于目标抗原的全部或部分的抗体的一部分。当抗原较大的情况下，抗体可以仅结合到抗原的特定部分，该部分称为表位。抗体抗原结合位点可以由一种或多种抗体的可变区提供。抗体抗原结合位点可以包括抗体轻链可变区(\)和抗体重链可变区(VH)。抗原结合位点可以在从CDR的自然部位分离的抗体分子的区域被工程化，例如在Vh或\区的框架区，或者例如，在抗体恒定区中，但不局限于ChI和/或Ch3。在结构区被工程化的抗原结合位点可以增加或代替由V1^P'区的CDR组形成的抗原结合位点。当在抗体分子中存在多个抗原结合位点的情况下，它们可以结合hCMV上的相同抗原区域，例如，从而提高结合成员的化合价进而提高其亲和力。可替换地，多个抗原结合位点可以结合hCMV上不同的抗原和/或一个或多个其他抗原，这可以用于增加效应器功能，延长半衰期或改善抗体分子的体内递送。分离这是指一种状态，在该状态下本发明的结合成员或编码这些结合成员的核酸通常 会符合本发明。因此，结合成员、V1^P /或' 区和编码核酸分子，以及根据本发明的载体(vector)可以通过分离和/或纯化提供，例如从它们的自然环境中，以基本纯的或均质形式，或在核酸的情况下，游离的或基本上游离的核酸或源基因，而不是编码具有所需功能的多肽的序列。分离的成员和分离的核酸对于它们自然相关的物质将是游离的或基本游离的，如其他多肽或核酸对于发现它们的自然环境，或当在体外或在体内通过重组DNA技术进行这种制备时，对于制备它们的环境。可以与稀释剂或佐剂一起配制成员和核酸，并且还为了实际的分离目的，例如成员会通常与明胶或其他载体一起混合，如果用于在免疫测定中涂覆微滴定板，或者在用于诊断或治疗时与药用载体或稀释剂一起混合。结合成员可以自然地或通过异源真核细胞的系统(例如CHO或NSO细胞)糖基化，或它们可以是非糖基化的，例如，如果它们在原核细胞中通过表达而产生。包括抗hCMV抗体分子的异种制剂(异源制剂)也成为本发明的一部分。例如，这样的制剂可以是具有全长重链和缺少C末端赖氨酸的重链的抗体的混合物，这些抗体带有不同程度的糖基化和/或带有衍生的氨基酸，如N末端谷氨酸的环化以形成焦谷氨酸残基。如在本文使用的，短语“基本上如给出的”指的是在本文中描述的结合成员的Vh或Vl区的相关CDR的特性将与在本文中给出的序列的特定区域相同或高度类似。正如在本文中描述的，短语“高度类似”于一种或多种可变区的特定区域，预期在CDR和/或VH或VL区可以发生从I至约5个，例如从I至4个，包括I至3个，或1、2、3或4个氨基酸替换。


图I.该图显示gB蛋白的示意图(菌株AD169 ;SEQ ID No:239)，表明已知的抗原区域AD-l、AD-2和AD-3的位置(Ohlin等1993 ;Wagner等，1992)。在氨基酸460处有断裂位点，和将这两部分连接在一起的二硫键，如用括号所示的。Signal (信号)信号序列(氨基酸1-22)，TM :跨膜区(氨基酸751-771)。图2.该图显示通过制备性荧光激活细胞分选(FACS)富集的gB特异性的记忆B细胞。为了分离gB特异性、IgG阳性的记忆B细胞，抗⑶20MACS富集的(MACS=磁激活细胞分选)B细胞由下列抗体染色a、抗人类⑶19 (B细胞标记物)；b、抗人类⑶27 (记忆B细胞标记物)；c、抗人类IgG。另外，与用荧光色素标记的重组糖蛋白B—起孵育B细胞。将⑶19+/⑶27+/IgG+/gB+反应性B细胞分选到经照射的饲养细胞上，并且如在实施例I中描述的建立产生抗体的细胞系。图3. HCMV gB的区域构造(domain architecture)。代表各单独区域的各个区域以不同的颜色深浅显示，并且给出了起始残基的编号。括号表明二硫键。Signal (信号)信号序列，TM:跨膜区域。·图4.抗hCMV抗体和Ab-50之间的ELISA竞争。图4a显示与抗体Ab_47、Ab_48、Ab-49和C23 (gB特异性对照抗体)竞争的Ab-50。检测到了针对Ab_50相对于Ab_47和Ab-49结合到gB蛋白上的竞争，但对于Ab-48 (或C23对照抗体)没有(检测到)。图4b显示了 Ab-50与抗体ITC52、ITC88、89-104和89-109的竞争。在Ab_50和任何的这些测试的抗体之间没有检测到结合竞争。横跨在图4a和4b上部的虚线表示Ab-50的浓度为O. 5ng/孔。图5.人血清中抗gB和gB片段的抗体效价。从HCMV血清反应阳性的个体中随机选取八十种血清，用ELISA分析抗重组gB和抗原区域I (AD-1)、2 (AD-2),4 (AD-4/DomII)和5 (AD-5/Dom I)的反应性。水平线代表切断个体抗原。图6.该图显示抗不同的抗原区域的抗体效价(由ELISA测定)和50%中和效价之间的关系° r :Spearman 等级相关系数(Spearman rank correlation coefficient)。图7.亲和纯化的抗AD-4多克隆抗体的特异性和中和能力。a)分别用gB、AD-U AD-2和AD_4涂覆ELISA板，并用各种抗体测试。E3 :亲和纯化的G免疫球蛋白片段；Pre (纯化前)亲和纯化之前的血清池；Post (纯化后)亲和纯化之后的血清池；C23 :人类AD-2特异性单克隆抗体；89-104 :人类抗AD-I特异性单克隆抗体；抗GST :针对GST特异性的小鼠单克隆抗体。b)使用血清池、人单克隆抗体C23和亲和纯化的AD-4特异性IgG片段(E3)的中和试验。图8.该图显示AD-4和突变蛋白的氨基酸序列。在最上面的横排(lane)显示了用于哺乳动物细胞表达的AD-4的氨基酸序列。横排A-Q中表示交换丙氨酸的残基。虚线表示与野生型序列相同。图9.由人单克隆抗体(Ab-28、Ab-IU Ab-14)识别的AD-4和AD-4突变蛋白和来自hCMV血清反应阳性的供体的亲和纯化IgG。ELISA板涂覆以表明的AD-4融合蛋白，并用于分析人单克隆抗体的结合(Ab-28、Ab-11、Ab-14 ;图9a)或亲和纯化的IgG片段(E3 ;图%)。抗GST抗体用于控制抗原的涂覆效率。图10.人血清对AD-4突变体的识别。在ELISA中测试血清板(80个样品)抗GST 融合蛋白，分别包括 AD-4 或突变型肽 AD-4G (K378K379)、AD-4H (Q380E381)、AD-4E(E359D362)、AD-41 (N383S385)和 AD-4L (N405T406)。对于每一种血清，计算最高和最低的OD值之间的比率并绘制成倍数差。虚线代表所有血清样品的平均差。图11.该图显示gB蛋白抗原区域和子区域识别抗体的捕获法ELISA测定结果。与对照组(pcUL132SigHA)、AD-4+AD-5、AD-5 的子区域 I (AD-5-S1)或 AD-5 的子区域 2(AD-5-S2)—起转染293T细胞。抗体Ab_47至Ab_50用于检测。通过间接免疫荧光检测结果O
图12.使用中和抗体Ab-28和不同的人血清的竞争中和试验。图左侧的数据代表三份应用恒定浓度为约其50%的中和活性的不同hCMV阳性血清和hCMV阴性血清(在X轴上)。图右侧的曲线代表用hCMV阳性或hMCV阴性血清滴定的Ab-28的组合，该血清加入的恒定浓度与由图左侧的数据代表的浓度相同。所有曲线反映了仅Ab-28的IgG浓度，而不加血清的恒定IgG浓度。以一式三份分析所有样品。图例· hCMV阴性血清的恒定浓度；▲ hCMV阳性血清的恒定浓度^hitrateek (标准人免疫球蛋白)的恒定浓度；〇用恒定浓度的hCMV阴性血清滴定Ab-28 ;▽用恒定浓度的hCMV阳性血清滴定Ab_28 ; □用恒定浓度的Intratect (标准人免疫球蛋白)滴定Ab_28 ; 单独滴定Ab_28。图13.使用Ab-02、Ab-04和Ab_28的吸附后试验。允许hCMV病毒在4°C下吸附但不穿入人包皮成纤维细胞内，持续I小时，然后加入抗体Ab-02、Ab-04或Ab-28并使其在4°C下孵育30、80或120分钟的期间。一式三份对每种抗体配制1:2的系列稀释液，从150至5 μ g/ml。C23 (AD-2特异性抗体)用作抑制病毒穿入细胞的对照抗体。x轴显示IgG浓度(μ g/ml)而y轴显示％中和。图例· 30分钟的孵育期；■ 80分钟的孵育期；▲ 120分 钟的孵育期。图14. AD-I和AD-2特异性抗体与Ab_28之间的代表性竞争中和试验。如图12a和12b所示，分别在Ab-28不存在(·)或存在(■)下滴定ITC52 (AD-1特异性抗体)或ITC88(AD-2特异性抗体)。向恒定浓度为O. 5 μ g/ml (▲)的滴定抗体中加入Ab_28。图12c显示，在ITC88不存在(·)或存在(■)下滴定ITC52，向恒定浓度为3 μ g/ml (▲)的滴定抗体中加入ITC88。所有结果代表三次分析。图15. AD-4特异性抗体与AD-5特异性抗体之间的竞争中和试验。对于此试验，使用一种代表性AD-4- (Dom II)特异性抗体(Ab_28)和两种代表性AD-5- (Dom I)特异性抗体(Ab-49和Ab-50)。x轴显示IgG浓度(μ g/ml)而y轴显示％_中和。图例·单独的AD-5抗体(Ab-49或Ab-50) ;▲单独的AD-4抗体；■ AD-5和AD-4的混合抗体。当在第一孔中施加的每一种抗体为I. 5 μ g/ml时,混合物的起始浓度为3 μ g/ml。
具体实施例方式正如上文所提到的，根据本发明的结合成员调控并且可以中和hCMV的生物活性。高效能结合成员可以从初始筛选，例如生物hCMV中和试验中直接获得。本文中的其他部分更详细地描述了试验和效能。非洲淋巴细胞瘤病毒(eb病毒，Epstein-Barr virus) (EBV)转化是永生化哺乳动物细胞的一种可靠方法，并且已经开发了多种EBV转化方案(Rosen等，1997 ；Steinitz等，1997 ；Steinitz 等，1980 ；Kozbor 和 Roder, 1981 ；Lundgren 等，1983 ；Rosen 等，1983 ；Steinitz 等，1984 ；Lanzavecchia, 1985 ；Bernasconi 等，2001 ; Jung 等，2002 ；Traggiai 等，2004)。该技术最常用于从充当DNA和蛋白质分离的永久性来源的人类淋巴细胞中获得细胞系，并且已经发现在临床试验中作为产生用于遗传型的病人DNA的永久来源的主要方法而广泛应用。EBV是一种疱疹病毒，并且其基因组由已经完全测序的172kb的线性双链DNA构成。广泛研究了 EBV分子生物学和发病机理，并且已知了许多关键EBV和宿主细胞基因在致病机理中的作用。EBV仅感染特定的哺乳动物上皮细胞和B淋巴细胞。通过激活大量细胞周期调节基因以及包括免疫球蛋白基因的B细胞特异性基因，在体外EBV永生化B细胞。然后能够选择生长的克隆分泌特异性抗体用于分析。然后，关注的抗体能够通过传统方法克隆和测定它们的序列。可以以分离的形式提供带有所述选定的结合成员的氨基酸序列的抗体Vh可变区，也可以(提供)包括这样的Vh区的结合成员。可以进一步测试结合hCMV的能力，以及与例如本发明任何一种抗体分子Ab-Ol至Ab-50竞争结合hCMV的能力(例如以scFv形式和/或IgG形式，例如IgG1X可以测试中和hCMV的能力，正如在本文中其他部分进一步讨论的。能在适当的条件下比较不同的结合成员的结合亲和力和中和效能。本发明的Vh和\区以及⑶R的变异体，包括那些在本文中给出的和在本发明的结合成员中能够采用的氨基酸序列，可以通过序列改变或突变和筛选具有期望特性的抗原结合成员的方法获得。期望特性的实施例包括但不限于·相对于针对抗原是特异性的已知抗体对抗原提高的结合亲和力·如果活性已知，则相对于针对抗原是特异性的已知抗体提高的中和抗原的活性·以特定摩尔比，具有已知抗体或配体对抗原的特定竞争活性·
·对于免疫沉淀复合物的能力·结合到特定表位(如链状表位，例如使用筛选的链状肽和/或由不连续的残基形成的限定构象(constrained conformation)或构象表位的肽)的能力·介导hCMV的新生物活性或下游分子的能力。在本文中也提供了这样的方法。由Vh区和'区组成的抗体抗原结合位点典型地由六个多肽环形成三个来自轻链可变区(')，三个来自重链可变区(VH)。对已知原子结构的抗体分析已经阐明了序列和抗体组合位点的三维结构之间的关系。这些关系意味着，除了在Vh区的第三区域(环)之外，结合位点环具有少量的主链构象或规范结构(极限结构，canonical structure)之一。已经证明在特定的环中形成的规范结构是由其大小和在环和框架区两者的关键位点处的某些残基的存在决定的(Chothia等，1992 ;Al_Lazikani等，1997)。序列-结构关系的这种研究可以用于已知序列的抗体中那些残基的预测，但不是未知的三维结构，其在保持其CDR环的三维结构并因此保持结合特异性中是重要的。在结构方法中，可以使用任意可自由得到的或商业程序包(如WAM) (Whitelegg和Rees, 2000)创建抗体分子的模型(Chothia等，1986)。蛋白质可视化和分析软件包，如Insight II(Accelrys, Inc.),或 Deep View (Guex 和 Peitsch, 1997)可以然后用于在 CDR 的每个位置评估可能的替代。该信息可以然后用于使可能对活性有最小的或有益的影响的替代发生。在CDR的氨基酸序列、抗体Vh或\区和结合成员中发生替代的所需技术通常在本领域是可得到的。可以利用替换产生变异序列，这些替换能够预测或不能够预测对活性具有最小或有益的影响，或测试结合和/或中和hCMV的能力和/或任何其他期望的性质。正如讨论的，根据本发明可以采用任何Vh和\区(其序列在本文中明确披露)的可变区氨基酸序列变异体。本发明进一步的方面是一种抗体分子，其包括与在随附的序列表中显示的任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50的Vh区具有至少60、70、80、85、90、95、98或99%氨基酸序列同一性的Vh区，和/或包括与在随附的序列表中显示的任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50的\区具有至少60、70、80、85、90、95、98或99%氨基酸序列同一性的\区。可以用于计算两种氨基酸序列的 ％ 同一性的算法包括，例如 BLAST (Altschul 等，1990),FASTA (Pearson 和 Lipman,
1998),或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman, 1981),例如采用默认参数。特定变异体可以包括一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加(增加)、缺失(删除)、替换和/或插入)。改变可以发生在一个或多个框架区和/或一种或多种CDR中。改变通常不导致功能的丧失，因此包括如此改变的氨基酸序列的结合成员可以保持结合和/或中和hCMV的能力。它可以保持与没有发生改变的结合成员(例如在本文中描述的试验中测定的)等量的结合和/或中和能力。包括如此改变的氨基酸序列的结合成员可以具有改善的结合和/或中和hCMV感染性的能力。改变可以包括用非自然产生的或非标准氨基酸替换一个或多个氨基酸残基，将一个或多个氨基酸残基修饰成非自然产生的或非标准形式，或将一个或多个非自然产生的或非标准氨基酸插入序列里。在本文中的其他部分描述了本发明的序列中改变的编号和位置的实施例。自然产生的氨基酸包括20种“标准” L-氨基酸，由它们的标准单个字母代码标 识为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非标准氨基酸包括任何其它残基，该残基可以合并到多肽主链上或由现有的氨基酸残基修饰产生。非标准氨基酸可以是自然产生的或非自然产生的。几种自然产生的非标准氨基酸在本领域是公知的，如4-羟脯氨酸、5-轻赖氨酸、3-甲基组氨酸、N-乙酰丝氨酸)(Voet和Voet, 2004)。在它们的N-α位衍生的氨基酸残基将仅位于氨基酸序列的N末端。通常在本发明中，氨基酸是L-氨基酸，但它可以是D-氨基酸。因而改变可以包括将L-氨基酸改变成D-氨基酸，或用D-氨基酸替换。还已知氨基酸的甲基化、乙酰化和/或磷酸化形式，本发明的氨基酸可以经受这样修饰。在本发明的抗体区域和结合成员的氨基酸序列中，可以包括上述非自然的或非标准氨基酸。在合成期间非标准氨基酸(例如D-氨基酸)可以合并到氨基酸序列中，或在合成氨基酸序列之后修饰或替换“原始的”标准氨基酸。非标准的和/或非自然产生的氨基酸的应用增加了结构和功能的多样性，并且因而能增加潜能以使本发明的结合成员达到期望的结合和中和hCMV的性质。另外，由于在给予动物(例如人)之后含有L-氨基酸的多肽的体内降解，与标准L-氨基酸相比，D-氨基酸和类似物已经显示具有不同的药代动力学曲线，意味着D-氨基酸有利于一些体内应用。本发明的新型携带CDR衍生序列的Vh或\区可以利用一种或多种选定的Vh和/或'基因的随机诱变生成，以便在整个可变区内产生突变。Gram等(1992)描述了这样的技术，其使用易错PCR (错配PCR，error-prone PCR) 在一些实施方式中，在整个可变区或CDR组内发生一或两个氨基酸替换。另一种可以使用的方法是引发Vh或'基因的CDR区域诱变(Barbas 等，1994 ；Schier 等，1996)。所有上述的技术是本领域已知的那些，并且技术人员将能够利用本领域的常规方法使用这些技术以提供本发明的结合成员。本发明进一步的方面提供一种用于获得针对hCMV的抗体抗原结合位点的方法，该方法包括在Vh区(在本文中给出的Vh区的氨基酸序列是该Vh区的变异体的氨基酸序列)的氨基酸序列中通过添加、缺失、替换或插入一个或多个氨基酸，可选地结合如此提供的Vh区与一个或多个\区，并测试Vh区或VH/VL 一个组合或多个组合以确定结合成员或针对hCMV的抗体抗原结合位点，以及可选地具有一种或多种期望的性质，例如中和hCMV活性的能力。所述'区可以具有基本上如在本文中给出的氨基酸序列。可以采用模拟方法，其中在本文中披露的一种或多种\区的序列变异体与一种或多种Vh区相结合。正如上面所指出的，如在人类抗体可变区或其实质性部分中的CDR，可以携带有如本文中给出的CDR氨基酸序列。基本上如在本文中给出的HCDR3序列代表本发明的实施方式，如在人重链可变区或其实质性部分中的HCDR3，可以携带有这些中的每一种。在本发明中采用的可变区可以获自或来源于任何胚系或重排人类可变区，或者可以是基于已知人类可变区的共有序列或实际序列的合成可变区。可变区可以源于非人抗体。可以使用重组DNA技术将本发明的⑶R序列(例如⑶R3)引入一系列(a repertoireof)缺少⑶R (例如⑶R3)的可变区内(引入缺少⑶R (例如⑶R3)的可变区谱内)。例如，Marks等(1992)描述了产生一系列抗体可变区(产生抗体可变区谱)的方法，在这些可变区中，与指向人类Vh基因的第三框架区的共有引物一起使用靶向或靠近可变区的5’端的共有引物，以提供一系列缺少⑶R3的Vh可变区(以提供缺少⑶R3的Vh可变区谱)。Marks等进 一步描述了这种系列可以如何与特定抗体的CDR3相结合。使用类似的技术，本发明的源于⑶R3的序列可以与缺少⑶R3的Vh或\区系列(谱)混杂(shuffled)，并且可以与和同源的Vl或Vh区合并的全Vh或\区混杂以提供本发明的结合成员。该系列可以然后展示在适宜的宿主系统中，如噬菌体展示系统、酵母展示系统、细菌展示系统、T7展示系统、病毒展示系统、细胞展示系统、核糖体展示系统或共价展示系统。同样，一个或多个或所有的三个⑶R可以接枝到一系列Vh或八区(Vh或八区谱)，然后筛选这些Vh或 '区以得到针对hCMV的一种结合成员或多种结合成员。例如，可以采用一个或多个抗体Ab-Ol至Ab-50的HCDR1、HCDR2和HCDR3或HCDR组，和/或可以采用一个或多个抗体Ab-Ol至Ab-50的IXDRl、IXDR2和IXDR3或IXDR组。同样，可以采用在本文中披露的其他Vh和\区、CDR组以及HCDR组和/或LCDR组。免疫球蛋白可变区的实质性部分与它们其间的框架区一起，可以至少包括三个⑶R区。该部分也可以包括至少约50%的第一和第四框架区的任意一者或两者，该50%为第一框架区的C末端的50%和第四框架区的N末端的50%。在可变区的实质性部分的N末端或C末端处的另外的残基可以是通常不与自然产生的可变区相关的那些。例如，由重组DNA技术制备的本发明的结合成员的构建，可以导致由引入的连接子编码的N-或C-末端残基的引入，从而促进克隆或其他操作步骤。其他操作步骤包括结合本发明的可变区的连接子引入至包括抗体恒定区、其他可变区或可检测的/功能性标记物的进一步蛋白质序列中，如在本文中的其他部分更详细讨论的。虽然在本发明的一些方面中，结合成员包括一对Vh和 '区，基于Vh或\区序列的单个结合区域形成本发明进一步的方面。众所周知，单个免疫球蛋白区域，特别是％区以特定方式结合目标抗原。在任何的单个结合区域的情况下，这些区域可以用于筛选能够形成能结合hVMV的双区域结合成员的互补区域。这可以使用在W092/01047 (McCafferty等)和在Marks等(同上)中披露的所谓分级双组合方法(hierarchical dual combinatorialapproach)通过曬菌体展示筛选来实现。本发明的结合成员可以进一步包括抗体恒定区或其部分，例如人类抗体恒定区或其部分。例如，'区可以在其C末端附着包括人类CK或CA链的抗体轻链恒定区。同样，基于Vh区的结合成员，可以在C末端附着源于任何抗体同种型的免疫球蛋白重链的所有或部分(例如ChI区)，该抗体同种型例如IgG、IgA、IgE和IgM，和任何子类同种型，特别IgGi和IgG4是有利的，由于其效应器功能和易于制备。具有这些性质并稳定可变区的任何合成的或其他恒定区变异体在本发明中也是有用的。 本发明的结合成员也可以包括多于一对Vh和\区(如双特异性或多特异性抗体)，这形成本发明进一步的方面。在双特异性抗体的情况下，其有两对Vh和\区，一对Vh和\区可以来自于如在本发明中所描述的任何一种抗体Ab-Ol至Ab-5。V1^P \区中的第二对可以与第一对相同或不同。例如，Vh和Vlj区域对可以是选自任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50或选自不同的抗体。在优选实施方式中，第一 ％和'区域对选自任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50,并且第二 Vh和\区域对也选自任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50，但是与第一区域对不同，以便双特异性抗体结合到hMCV。此外，第一 Vh和\区域对选自任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50,并且第二 Vh和\区域对选自不同的抗体。该双特异性抗体可以因此结合到hCMV和不同的抗原或hCMV上不同的表位上。优选地，双特异性抗体包括结合到hCMV的AD-4或 AD-5上的第一 Vl区域对(例如来自于任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50的第一 \区域对)，和选自以下描述的hCMV结合抗体中的第二 Vl区域对US5，043, 281(Mashuho等)、US5, 750，106 (Ostberg),W093/021952A1 (Borrebaeck 等)、W008/084410A2、W010/007463A1和 W010/007533A2 (Lanzavecchia 和 Macagno)、W008/071806A1、W009/003975A1 和W009/024445A1 (Funaro 等)、W009/114560A2 (Olsen)、W010/114105A1 和 W010/114106A1(Takada 等)。可以产生抗体的混合物，如作为Oligoclonics 被本领域公知的重组人单克隆抗体的混合物(Merus Biopharmaceutical BV ；W0 04/106375),以供中和 hMCV 使用。这些混合物可以包括源于任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50的结合成员。该抗体混合物也可以包括来自于任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50的结合成员，其与识别gB蛋白上的不同抗原区域(如AD-I或AD-2)或识别gH或识别hCMV蛋白gpUL130、gpUL131A、gpl28等的抗hCMV结合成员组合。例如该抗体混合物可以包括来自于任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50的\区，和选自任何以下描述的 hCMV 结合抗体的 Vh 区US5, 043, 281 (Mashuho 等)、US5, 750, 106(0stberg)、W093/021952A1 (Borrebaeck 等)、W008/084410A2、W010/007463A1 和 W010/007533A2(Lanzavecchia 和 Macagno)、W008/071806AU W009/003975A1 和 W009/024445A1 (Funaro等)、W009/114560A2 (Olsen)、W010/114105A1 和 W010/114106A1 (Takada 等)。可替换地，与选自任何前述列表中描述的任何hCMV结合抗体的Vh区和/或选自任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50的Vh区一起，抗体混合物可以包括选自任何以下描述的hCMV结合抗体的Vl 区US5, 043，281 (Mashuho 等)、US5, 750，106 (Ostberg), W093/021952A1 (Borrebaeck等)、W008/084410A2、W010/007463A1 和 W010/007533A2 (Lanzavecchia 和 Macagno)、W008/071806AUW009/003975A1 和 W009/024445A1 (Funaro 等)、W009/114560A2 (Olsen)、W010/114105A1和 W010/114106A1 (Takada 等)。本发明的结合成员也可以包括抗体或片段，其包括修饰的Fe区，其中该修饰的Fe区相对于野生型Fe区包括至少一个氨基酸修饰。可以设计变异体Fe区，相对于包括野生型Fe区的类似分子，以便以更大的或较小的亲和力结合Fe受体。Fe区指的是天然产生或合成的多肽，其同源于依靠IgG的木瓜蛋白酶消化产生的IgG C末端区域。IgG Fe具有大约50kD的分子量。对于本发明的抗体和/或片段，能够使用整个Fe区，或仅使用半衰期增加的部分。如果需要，能够变异Fe区，以抑制其修复补体和以高亲和力结合Fe受体的能力。本发明中，在修饰自然产生的Fe区以提高在生物环境中的抗体或片段的半衰期(例如，血清半衰期或由体外试验测量的半衰期)的情况下，可以提供带有修饰的Fe区的抗体或片段。改变IgG的Fe区的原始形式的方法也在US6, 998, 253中描述(Presta和Snedecor)。可以通过对Fe区进行修饰、通过改变糖基化方式、或通过对Fe区的氨基酸序列进行修饰而改变的效应器功能(例如增强)，包括但仅不限于提高的Fe介导细胞的细胞毒性，包括提高的抗体依赖细胞的细胞毒性和提高的补体介导的溶解(例如受hCMV感染的细胞)，提高的抗体对Fe受体、天然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞、单核细胞、和/或多形核细胞的结合，提高的树突细胞成熟和提高的T细胞的启动。潜在的修饰包括一个或多个氨基酸残基的插入、缺失或替换，包括用丙氨酸替换、保守替换、非保守替换或用相应的氨基酸残基对来自不同的IgG子类的相同位置的取代(例如在那个位置用相应的IgG2残基取代IgG1残基)。
在其他实施方式中，本发明的Fe多肽变异体可以包括一种或多种工程化的糖型(糖形，glycoforms),即一种共价附着在包括Fe区的分子上的碳水化合物组合物。IgG型抗体的Fe区在CH2区的残基Asn297包含保守的N-连接的糖基化位点。已显示，与这个残基连接的低聚糖(寡糖)的糖基化形式的修饰可以提高由Fe区与Fe受体相互作用介导的效应器功能。经工程化的糖型可用于各种目的，包括但不限于增强或降低效应器功能。经工程化的糖型可以由本领域技术人员已知的任何方法产生，例如，通过使用工程化的或变异体表达菌株，通过用一种或多种酶，例如β (1，4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III共表达，通过在来自于各种生物体的各种有机体或细胞系中表达包括Fe区的分子，或通过在已经表达了包括Fe区的分子之后修饰碳水化合物。用于产生工程化糖型的方法是本领域已知的，并且该方法包括但仅不限于，在下列中描述的那些US6，602，684 (I丨mana 等)、US20030157108 (Presta 等)、Umafla 等(1999)、Davies 等(2001 )、Shields 等(2002)、Shinkawa 等(2003)、和与 Potelligent 技术相关的专利和申请(Biowa，Inc. ,Princeton,NJ,U. S.)、和GlycoMAb 糖基化工程化技术(GLYCART Biotechnology AG, Schlieren, CH) 因此，在进一步的方面中，本发明包括如在本文的其他部分描述的hCMV结合成员，其中所述结合成员包括至少包括Fe区或等效区(该等效区包括至少一个IgG CH2区，其已被修饰从而提高一种或多种效应器功能)。在一个实施方式中，修饰结合成员以改变在Asn 297的N-连接低聚糖的糖基化形式，以便提高一种或多种效应器功能的活性。在另外的实施方式中，结合成员被修饰以改变Fe区的氨基酸序列，以便提高一种或多种效应器功能的活性。测定效应器功能活性和确定它们是否提高的方法是本领域公知的。本发明的结合成员可以用可检测的或功能性标记物标记。因此，结合成员或抗体分子可以以免疫轭合物(免疫结合物，immunoconjugate)的形式存在，以便获得可检测的和/或可计量的信号。免疫轭合物可以包括本发明的抗体分子，例如任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50与可检测的或功能性标记物轭合(结合)。标记物可以是产生或能够诱导以产生信号的任意分子，包含但不限于突光色素、放射性标记物、酶、化学发光剂(chemiIuminescers)或光敏剂。因此，可以通过检测荧光或发光、放射性、酶活性或吸光度检测和/或测定结合。适宜的标记物，以示例而不是限制的方式，包括酶，如碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6TOH”)、a-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶和过氧化物酶，例如辣根过氧化物酶；染料；荧光标记物或荧光色素(如荧光素及其衍生物、罗丹明复合物和衍生物、绿色/黄色荧光蛋白(G/YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、丹酰、伞形酮(umbelliferone)、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝素、邻苯二甲醛(o-phthaldehyde)和荧光胺；镧系元素穴状化合物和螯合物的突光团，例如铕等(Perkin Elmer和Cis Biointernational);化学发光标记物或化学发光齐U，如异鲁米诺(异氨基苯二酰肼，isoluminol)、鲁米诺和二氧杂环丁烧(dioxetane);生物发光标记物，如萤光素酶和萤光素；敏化剂；辅酶；酶底物；放射性标记物包含但不限于溴 77、碳 14、钴 57、氟 8、镓 67、镓 68、氢 3 (氚)、铟 111、铟 113m、碘 123m、碘 125、碘 126、碘131、碘 133、汞 107、汞 203、磷 32、铼 99m、铼 101、铼 105、钌 95、钌 97、钌 103、钌 105、钪 47、硒 75、硫 35、锝 99、锝 99m、締 121m (telIuriuml2Im)>5$ 122m (telluriuml22m)>5$ 125m、铥165、铥167、铥168、钇199以及其它在本文中提到的放射性标记物；粒子，如胶乳或碳粒子；金属溶胶；微晶(crystallite);脂质体；细胞等，其可以用染料、催化剂或其它可检 测基团进一步标记；分子，例如生物素、地高辛(digoxygenin)或5-溴脱氧尿苷；毒素部分(moieties)，如例如选自由以下构成的组中的毒素部分假单胞菌外毒素(PE或细胞毒片段或其突变型)，白喉毒素或细胞毒片段或其突变型，肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E或F，蓖麻毒素或其细胞毒片段，例如蓖麻毒素A，相思豆毒素(abrin)或其细胞毒片段，肥皂草素或其细胞毒片段，商陆抗病毒毒素(pokeweed antiviral toxin)或其细胞毒片段，和异株腹泻毒蛋白I (bryodin I)或其细胞毒片段。适宜的酶和辅酶在US4, 275，149 (Litman 等)和 US4, 318，98 (Boguslaski 等)中披露，并且适宜的荧光剂和化学发光剂在US4，275，149中披露，其通过引用整体合并入本文中。标记物进一步包括化学部分，如通过结合在特异性同源可检测部分可以检测的生物素，例如标记的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，或通常经工程化的抗生蛋白链菌素，如streptactin (IBA GmbH,G ttingen,DE)。使用本领域已知的常规化学,可检测标记物可以附着于本发明的抗体上。可以通过本领域技术人员已知的方法制备免疫轭合物或它们的功能片段。它们可以直接与酶或突光标记物偶联或通过间隔基团或连接基团的中间体(intermediary),如聚醛(polyaldehyde)，像戊二醛，乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DPTA)，或在偶联剂(如以上提及的用于治疗性轭合物的那些)存在下。包括荧光素型的标记物的轭合物可以通过与异硫氰酸盐/酯反应制备。本领域技术人员已知的用于将治疗性放射性同位素直接或通过螯合剂(如上面提及的EDTA、DTPA)偶联到抗体上的方法可以用于能够用于诊断的放射元素。同样可以通过氯胺T方法(Hunter和Greenwood, 1962)用钠125进行标记，或通过在US4, 424, 200(Crockford和Rhodes)中描述的技术或如在US4, 479, 930 (Hnatowich)中描述的经由DTPA附着用锝99m标记，这两者都通过引用整体合并入本文中。标记物可以通过多种方法产生用外部手段可检测的信号，这些外部手段例如，通过肉眼观测、电磁辐射、热和化学试剂。标记物也可以结合到与本发明的结合成员或载体相结合的另一种结合成员上。标记物可以直接产生信号，从而不需要另外的组分产生信号。多种有机分子，例如荧光剂，能吸收紫外线和可见光，其中光吸收将能量转移到这些分子中并且使它们抬升至激发能态。然后这种吸收的能量通过第二波长的光线发射而消散。这种第二波长发射也可以将能量转移到标记的受体分子中，而得到的能量通过光发射(例如荧光共振能量转移(FRET))从受体分子中消散。直接产生信号的其它标记物包括放射性同位素和染料。可替换地，标记物可以需要其他组分以产生信号，然后信号产生系统会包括需要产生可测定信号的所有组分，其可以包括底物、辅酶、增强子、另外的 酶、与酶促产物反应的物质、催化剂、激活剂(活化剂)、辅因子、抑制剂、净化剂(清除剂，scavengers)、金属离子和需要结合信号产生物质的特定结合物质。在US5，185，243 (Ullman等)中可以找到适宜的信号产生系统的详细讨论。本发明提供了引发或允许如本文中提供的特异性抗hCMV结合成员的结合的方法。正如所指出的，这样的结合可以发生在体内，例如在给予结合成员、或编码结合成员的核酸之后，或者它可以发生在体外，例如，在ELISA、蛋白质印迹法、亲和色谱法、免疫细胞化学、免疫沉淀反应、中和和生物化学的或基于细胞的试验中。本发明还提供用于直接测定抗原水平的方法，通过采用根据本发明的结合成员，例如在生物传感器系统中。例如,本发明包括检测和/或测定结合至hCMV的方法，包括，
(i)将所述结合成员暴露于hCMV，以及(ii)检测所述结合成员对hCMV的结合，其中使用在本文中描述的任何方法或可检测的标记物检测。这和在本文中描述的任何其它结合检测方法，可以直接由进行该方法的人员诠释，例如，通过在视觉上观察可检测的标记物。可替换地，这种方法或在本文中描述的任何其它结合检测方法，可以以放射自显影照片(autoradiograph )、照片、计算机打印输出、流式细胞术报告、图、图表、包含结果的试管或容器或孔、或任何其他该方法的结果的可视的或物理表征的形式产生报告。可以确定结合成员结合到hCMV上的量。定量可以涉及试样中抗原的数量，其可以是诊断所关注的。对于hCMV结合的筛选和/或其定量可以是有用的，例如，在本文中涉及的筛选疾病或紊乱和/或任何其它疾病或紊乱的病人中，涉及异常的hCMV表达和/或活性。本发明的诊断方法可以包括(i )从对象(被试者)中获得组织或流体样品，(i i )将所述组织或流体样品暴露于本发明的一种或多种结合成员；以及(iii)与对照样品相比，检测结合的hCMV，其中与对照相比hCMV结合量的增加可以表明hCMV表达和/或活性。要测试的组织或流体样品包括血液、血清、唾液、尿液、痰、活检材料或疑似包括h CMV的任何组织。对hCMV检测呈阳性的对象(被试者)也可以得益于在本文中稍后披露的治疗方法。根据在本文中披露的方法，本领域技术人员能够根据他们优先的和一般知识，选择测定结合成员与抗原的结合的适宜模式。可以通过任何适当的手段测定样品中结合成员的反应性。竞争性结合试验可以与放射性抗原(例如同位素标记物，如"Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)或使用连接到报告分子上的抗原或类似物的非放射性抗原一起使用。报告分子可以是具有光谱分离吸收(spectrally isolated absorption)或发射特性的突光色素、磷光体或激光染料。适宜的荧光色素包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白和德州红和镧系元素螯合物或穴状化合物。适宜的生色染料包括二氨基联苯胺。其他报告分子(reporters)包括大分子胶体颗粒或微粒材料(如彩色的磁性或顺磁性胶乳珠)和生物或化学活性剂，其可以直接或间接地导致可检测的信号可以视觉观测、电子检测或记录。这些分子可以是催化反应进行的酶，例如，或变色或引起电性质的改变。它们可以是分子易激发的，以便能态之间的电子跃迁引起特征谱的吸收或发射。它们可以包括用于与生物传感器连接的化学实体。可以采用生物素/抗生物素蛋白或生物素/抗生蛋白链菌素和碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶检测系统。由单独的结合成员-报告分子结合物(轭合物)产生的信号可以用于导出样品(正常和测试)中相关结合成员结合的可计量的绝对或相对数据。还提供了包括根据本发明的任何方面或实施方式的结合成员的试剂盒。在该试剂盒中，可以标记结合成员以使其在样品中的反应性能够检测，例如正如在下文中进一步描述的。进一步的结合成员可以附着或可以不附着在固体载体上。试剂盒的组分通常是灭菌的并且密封在小瓶或其他容器中。诊断分析或其他对于结合成员有用的方法中可以采用试剂盒。试剂盒可以包括在方法，例如根据本发明的方法中对于各组分使用的说明书。辅助或使这样的方法进行的辅助材料可以包含在本发明的试剂盒中。辅助材料包括第二种不同的结合成员，其结合到第一结合成员上，并与可检测的标记物(例如荧光标记物、放射性同 位素或酶)结合。基于抗体的试剂盒也可以包括用于进行免疫沉淀反应的珠粒。试剂盒的每一种组分通常是在其自身适宜的容器中。因此，这些试剂盒通常包括适合于每一种结合成员的不同容器。而且，试剂盒可以包括用于进行试验和方法的说明书，用于诠释和分析由试验进行而产生的数据。本发明还提供了如上的结合成员用于测定竞争试验中的抗原水平中的应用，也就是说通过在竞争试验中采用如本发明提供的结合成员测定样品中的抗原水平的方法中的应用。这可以是在从不需要的未结合的抗原中物理分离结合的抗原的情况下。将报告分子连接到结合成员上，以便在结合时发生物理或光学改变是一种可能性。报告分子可以直接或间接产生可检测的信号，其可以是可计量的。报告分子的连接(键接)可以是直接或间接地、共价地(例如经由肽键)或非共价地。经由肽键的连接(键接)可以作为编码抗体和报告分子的基因融合的重组表达的结果。在各个方面和实施方式中，本发明扩展到与在本文中定义的任何结合成员(例如任意一种抗体Ab-Ol至Ab-50)竞争结合到hCMV上的结合成员，例如以IgG形式。结合成员之间的竞争可以在体外试验，例如通过将特异性报告分子标记到一种结合成员上，可以在其他未标记的(未示踪的，untagged)结合成员存在下检测该结合成员，以使结合相同表位或重叠表位的结合成员能够识别。可以测定竞争，例如，使用ELISA或通过表面细胞质基因组共振，其中hCMV固定在固相中，并且与一种或多种未示踪的或未标记的结合成员一起，向该固相中加入第一种示踪的或标记的结合成员。与示踪的结合成员竞争的未示踪的结合成员的存在通过由示踪的结合成员发射的信号的降低检测。例如，本发明包括识别hCMV结合化合物的方法，包括(i )将gB蛋白固定到载体上，
(ii)以同时地或分步的方式，使所述固定的gB与至少一种示踪的或标记的根据本发明的结合成员与一种或多种未示踪的或未标记的测试结合化合物相接触，以及(iii)通过检测示踪的结合成员中结合的标记量的降低鉴定(识别)新的hCMV结合化合物。利用多孔或阵列形式(array format)以高通量的方式进行这样的方法。这样的试验也可以在溶液中进行。参见，例如，US5, 814，468 (Sliman等)，其通过引用整体合并入本文中。如上所述，结合的检测可以由进行该方法的人员直接说明，例如，通过视觉观察可检测的标记物，或其存在的减少。可替换地，本发明的结合方法可以以放射自显影、照片、计算机打印输出、流式细胞术报告或该方法的结果的任何其它可视的或物理的表征产生报告。竞争试验也可以用于表位的表征。在一种情形下，表位的表征可以用于识别由hCMV结合成员结合的表位，该表位可选地已经可以优化中和和/或调节特性。这样的表位可以是链状的或构象的。构象表位可以包括至少两种不同的hCMV区域(结构域)，其中当hCMV蛋白折叠成它的三级或四级结构以形成构象表位时，所述区域(结构域)的位置相互临近，这些构象表位由hCMV的抑制剂识别，如在本说明书中提供的hCMV结合成员。在竞争测试中，可以采用抗原的肽片段，特别是包括或由关注的表位构成的肽。可以使用在任意末端加有一个或多个氨基酸的表位序列。根据本发明的结合成员可以是它们针对抗原的结合被带有或包括给定序列的肽抑制的那些。本发明进一步提供了编码本发明的结合成员的经分离的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。在一个(实施例)中，本发明提供用于编码CDR或CDR组或Vh区或\区或抗体 抗原结合位点或抗体分子的核酸，例如本发明在上文中定义的scFv或IgG115本发明也以质粒、载体(vectors)、转录或表达盒(cassettes)的形式提供包括如上的至少一种多核苷酸的构建体。本发明还提供重组宿主细胞，其包括一种或多种如上的构建体。编码任何⑶R或CDR组或Vh区或\区或抗体抗原结合成员或抗体分子的核酸，例如提供的scFv或IgGl，本身形成本发明的一个方面，如同编码产物的生产方法，该方法包括由编码的核酸表达。通过在适当的条件下培养包含该核酸的重组宿主细胞可以方便地实现表达。在通过表达产生包括在本文中披露的Vh*'区的结合成员之后，可以使用在本领域已知的和视为适当的任何适宜的技术分离和/或纯化结合成员。根据本发明的核酸可以包括DNA或RNA，并且可以是完全或部分合成的。除非上下文中另外需要，参照在本文中给出的核苷酸序列涵盖具有特定序列的DNA分子，并且涵盖具有特定序列的RNA分子，其中U代替了 T。还进一步的方面提供了生产包括本发明的V1^P/或'可变区的结合成员的方法，该方法包括由编码核酸引发表达。这样的方法可以包括在产生所述抗体Vh和/或\可变区的条件下培养重组宿主细胞。生产方法可以包括产物的分离和/或纯化步骤。生产方法可以包括将该产物配制成包括至少一种另外的组分(如药物活性赋形剂)的组合物。已知在各种不同的宿主细胞中多肽的克隆和表达系统。适宜的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母和昆虫细胞以及转基因植物和动物。本领域充分建立了在原核细胞中抗体和抗体片段的表达。对于综述，请参见例如Pluckthun( 1991)。普通的细菌宿主是大肠杆菌。作为用于产生结合成员的选择方案，培养基中的真核细胞的表达对于本领域技术人员也是可得到的，(Chadd 和 Chamow, 2001 ；Andersen 和 Krummen, 2002 ；Larrick 和Thomas, 2001)ο本领域可用的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞(人子宫颈癌传代细胞)、幼仓鼠肾(BHK)细胞、NSO小鼠黑色素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚胎肾细胞(HEK)、人胚胎视网膜细胞和许多其它的细胞系。
可以选择或构建适宜的载体，包括适当的调控序列，包括在适当的情况下的启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他序列。载体可以是质粒、曬菌体或病毒载体,例如在适当的情况下的逆转录病毒载体(Sambrook和Russell,2001)。Ausubel等(1991)详细描述了用于操作核酸的许多已知的技术和方案，例如核酸构建体的制备、诱变、测序、向细胞中引入DNA和基因表达、以及蛋白质分析。本发明进一步的方面提供了包括在本文中披露的核酸的宿主细胞。这样的宿主细胞可以在体外培养(供养)并且可以在组织培养基中繁殖。这样的宿主细胞也可以在体内培养(供养)，例如以便在腹水中产生结合成员。宿主细胞存在于体内可以允许本发明的结合成员细胞内表达为“胞内抗体(intrabodies)”或细胞内抗体(intra-cellularantibodies)。胞内抗体可以用于基因治疗。进一步的方面还提供了包括将本发明的核酸引入到宿主细胞中的方法。可以采用任何可用的技术引入。对于真核细胞，适宜的技术可以包括使用反转录病毒或其他病毒(例如牛痘，或对于昆虫细胞、杆状病毒、或其任意组合)的磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、 脂质体介导的转染和转导。向宿主细胞中引入核酸，尤其是真核细胞酸可以使用病毒的或基于质粒的系统。可以附加型地(印isomally)培养(供养)质粒系统，或者可以合并到宿主细胞基因组或人工染色体内。合并可以通过一个或多个副本在单一或多个基因座(位点)的随机或靶向整合。对于细菌细胞，适宜的技术可以包括使用噬菌体的氯化钙转化、电穿孔和转染。引入之后可以紧接着引发或允许核酸表达，例如通过在表达结合成员的条件下培养宿主细胞。通过本领域技术人员已知的方法可以实现表达的产物的纯化。本发明的核酸可以整合入宿主细胞的基因组(例如染色体)中。根据标准技术，可以通过促进基因组重组的序列包体(inclusion)促进整合。本发明还提供了包括在表达系统中使用如上所述的构建体的方法，以便表达上述的结合成员或多肽。正如在本文中其他部分所讨论的，有证据表明在各种紊乱中涉及hCMV感染。本发明的结合成员可以因此用于与hCMV感染有关的紊乱的诊断或治疗方法中。这样的紊乱可以影响免疫受损的病人，如同种异体移植接受者和艾滋病病毒感染的个体，并且可以包括例如发烧、肝炎、视网膜炎、肺炎、骨髓抑制(myelosuppression)、脑病、多发性神经根病、免疫抑制、排斥/移植物抗宿主病或动脉硬化。本发明的结合成员也可以用于治疗新生儿中的子宫内感染。经常地，新生儿出生时没有以上列举的紊乱的征兆或症状，但是不加治疗可以发展CNS机能障碍和损伤的进程中的症状，例如，但不局限于失聪，失明，和/或智力低下(mental retardation)。因此，本发明提供了治疗hCMV感染相关的紊乱的方法，包括对需要其的病人单独的或在与另一种本领域公知的或本文中描述的适当的药物的组合治疗方案中给予有效量的本发明的一种或多种结合成员。在本文的其他部分总结了特定紊乱中涉及hCMV感染的证据。此外，在本文中呈现的数据进一步表明，本发明的结合成员可以用于治疗这样的紊乱，包括紊乱的预防性治疗和严重性的降低。因此，本发明提供了在本文中提到的任一种紊乱的治疗或降低至少一种症状的严重性的方法，包括对需要其的病人单独的或在与另一种本领域公知的或本文中描述的适当的药物的组合治疗方案中给予有效量的本发明的一种或多种结合成员，以便降低任何上述紊乱的至少一种症状的严重性。因此，在涉及hCMV感染和/或活性的，特别是由病人体内高病毒载量所导致的疾病或紊乱的治疗中，本发明的结合成员作为治疗剂是有用的。治疗方法可以包括给予需要其的病人有效量的本发明的结合成员，其中降低了异常感染和/或hCMV的活性。治疗方法可以包括(i)确定证实的病人感染hCMV的水平或活性，例如使用上文描述的诊断方法，并且(ii)给予病人有效量的本发明的结合成员，其中降低了 hCMV的表达和/或活性。根据本发明的有效量是降低hCMV的表达和/或活性的量，以便降低或减轻hCMV感染或待治疗的特定疾病或紊乱的至少一种症状的严重性，但是不必要治愈疾病或紊乱。本发明也提供对抗(拮抗)hCMV感染的至少一种效应的方法，包括接触或给予有效量的本发明的一种或多种结合成员以便对抗(拮抗)所述hCMV感染的至少一种效应。因此，本发明进一步的方面提供了包括如提供的结合成员、包括这样的结合成员的药物组合物的给药的治疗方法，和这样的结合成员在生产用于给药的药剂中的应用，例如，在制备包括将该结合成员与药物活性赋形剂一起配制的药剂或药物组合物的方法中。药物活性赋形剂可 以是一种化合物或者化合物的组合，其引入药物组合物而不引起二次反应，并且其允许，例如，促进一种活性化合物或多种活性化合物的给药，增加其在体内的寿命和/或效能，增加在溶液中的溶解度或改善其保存。本领域技术人员已知并且将适当应用这些药用载体，作为选定的一种活性化合物(或多种活性化合物)的给药的性质和模式的功能(函数)。本发明的结合成员通常将以药物组合物的形式给药，除结合成员之外其可以包括至少一种组分。因此，除活性组分之外，根据本发明的药物组合物和根据本发明的应用可以包括药物活性赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或对本领域技术人员已知的其他材料。这样的材料应当无毒，并且不应当干扰活性成分的效能。载体或其他材料的确切性质将取决于给药途径，其可以是口服的、吸入的、气管内的、局部的、囊内的(泡内的，intra-vesicular)或通过注射，正如在下文讨论的。用于口服给药的药物组合物可以以片剂、胶囊、粉剂、液体或半固态形式的。片剂可以包括固体载体，如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。生理盐水溶液可以包括葡萄糖或其他糖类溶液或二醇类，如乙二
醇、丙二醇或聚乙二醇。对于静脉内注射，或在痛苦部位的注射，活性组分将是以肠道外可接受的水溶液的形式，这些水溶液是无热原的并且具有适当的PH值、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够很好地制备适用的适宜溶剂，例如等渗的载体，如氯化钠注射液、林格(Ringer’s)注射液、乳酸化的林格注射液。可以按需要采用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加物，包括缓冲齐 ，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸等；抗氧化剂，如抗坏血酸(维生素c)和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烧基二甲节基氯化铵；氯化六甲双铵(hexamethonium chloride);苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯类(对羟苯甲酸类，parabens)，如甲基或丙基对羟基苯甲酸烷基酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3’_戊醇；及间-甲酚)；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA ;糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白络合物);和/或非离子表面活性剂，如吐温 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。本发明的结合成员可以以液体、半固态或固体形式配制，取决于分子的理化性质和递送途径。配制品可以包括赋形剂或赋形剂的组合，例如，糖类、氨基酸和表面活性剂。液体配制品可以包括宽范围的抗体浓度和PH值。例如，固体配制品可以通过例如由冷冻干燥、喷雾干燥或超临界流体技术干燥而产生。结合成员的配制品将取决于预期的递送途径。结合成员可以与载体一起制备，该载体将保护结合成员免于快速释放，如控制释放的配制品，包括包埋体、透皮贴片和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多制备这样的配制品的方法对于本领域技术人员是已知的(Robinson, 1978)。可以给予以下方式治疗口服，或通过注射(即皮下、关节内、静脉内、腹膜内、动脉内或肌肉内)途径，通过吸入、气管内途径，通过囊内途径(灌输到膀胱中)、或局部(例如眼内、鼻内、直肠、伤口内、皮肤上)。治疗可以通过脉冲输注用药，特别是以结合成员降低的剂·量。给药途径可以由治疗的物理化学特性决定，通过对疾病的特定考虑或通过优化效能的需求或使副作用最小化。一种特定的给药途径是静脉内途径。本发明的药物组合物的另一种给药途径是皮下途径。应当认为治疗将不仅限于临床应用。因此，使用无针设备的皮下注射也是有利的。组合物可以单独的或与其他治疗联合给予，取决于要治疗的条件同时地或顺次地(给予)。本发明的结合成员可以用作与另外的药物组分相配合的联合治疗的一部分。联合治疗可以用于提供显著的协同效应，特别是本发明的结合成员和一种或多种其他抗体(如在本文中披露的抗体Ab-Ol至Ab-50)或在以下出版物中描述的任何hCMV抗体的组合US5, 043，281 (Mashuho 等)、US5, 750，106 (Ostberg)、W093/021952A1 (Borrebaeck等)、W008/084410A2、W010/007463A1 和 W010/007533A2 (Lanzavecchia 和 Macagno)、W008/071806A1,W009/003975A1 和 W009/024445A1 (Funaro 等)、W009/114560A2 (Olsen)、W010/114105A I和W010/114106A1 (Takada等)或任何其它药物。本发明的结合成员可以同时或顺次地或作为与另外的治疗剂或药剂的组合制剂给药，用于治疗在本文中列举的一种或多种病状。本发明的结合成员可以用作化学敏化剂((1161]1086118；[1^861·),借此其可以提高抗病毒药剂的治疗效能，并且因而可以与一种或多种抗病毒药剂联合提供给药，同时地或顺次地。根据本发明的结合成员可以组合或加入一种或多种以下抗病毒药剂来提供，例如阿昔洛韦、泛昔洛韦、纟颜更昔洛韦、更昔洛韦、西多福韦、金刚烧胺、金刚乙胺、利巴韦林、扎那米韦和/或奥司他韦。本发明的结合成员以及一种或多种上述另外的药物组分可以用于药剂的生产。药剂可以用于向个体单独或联合给药，因此可以包括结合成员和另外的组分，作为组合制剂或作为单独制剂。单独制剂可以用于促进单独和连续或同时给药，并且允许通过不同途径的组分的给药，例如口服和肠道外给药。
根据本发明，提供的组合物可以对哺乳动物给药。给药通常是以“治疗有效量”的，这足以显示对病人有益。这样的益处可以是至少改善至少一种症状。给药的实际量和速率以及给药的持续时间，将取决于待治疗的性质和严重性、待治疗的特定哺乳动物、个体病人的临床病症、紊乱的原因、组合物的递送部位、结合成员的类型、给药的方法、给药的时刻表以及医学从业者已知的其他因素。治疗的处方是在普通从业者和其他医生的责任内，例如对剂量等的确定，并且可以取决于症状的严重性和/或待治疗的疾病的进展。本领域已知抗体的适当剂量(Ledermann等，1991 ;Bagshawe等，1991 )。可以使用在本文或在Physician’s Desk Reference (2009)中指明的特定剂量,作为适合于给药的药剂类型。本发明的结合成员的治疗有效量或适宜的剂量，可以通过比较其体外活性和在动物模型中的体内活性确定。已知小鼠和其他试验用动物到人的有效量的外推方法。精确的剂量将取决于大量因素，包括抗体是用于诊断、预防还是治疗，治疗区域的大小和位置，抗体的确切性质(例如全抗体还是片段)以及任何可检测的标记物的性质或附连在抗体上的其他分子。对于系统应用(全身应用)的典型抗体剂量将在100μ g至Ig的范围内，而对于局部应用在Iug至Img的范围内。可以给予最初较高的载药剂量，接着一个或多个较低的剂量。代表性地，抗体将是全抗体，例如IgG1同种型。这是用于成年病人的单次治疗的剂量，其可以适当地调整用于儿童、婴儿和新生儿，并且也调整其它抗体形式与分子量的比例。可以以每 天、每周两次、每周或每月的间隔重复治疗，由医生自行处理。治疗可以是每二到四周皮下给药，和每四到八周静脉注射。治疗可以是定期性的，并且给药的周期约为两周或更长，例如约三周或更长、约四周或更长、或约每月一次。治疗可以在移植手术之前和/或之后给予，和/或可以直接在外科治疗的解剖部位给药或施药(涂敷)。就剂量和给药需求而言，与本领域之前披露的抗hCMV的抗体相比，本发明的hCMV结合成员可以提供优势。例如，如果抗hCMV的治疗剂量较低，其可以具有显著优势，因为低剂量有利于皮下注射以及静脉内注射。本领域技术人员已知皮下用药可能受到结合成员的量的限制，例如每剂量所需的抗体分子。这是由于皮下注射受到能够在皮肤的一个部位注射的体积的限制。通常使用1.2ml以下的皮下注射体积。由于以大于50mg/ml的浓度配制用于皮下注射的结合成员可能更加困难，通过这种途径的大于IOOmg的剂量通常需要多次注射并且使病人更加不适。因此，例如更高效能的hCMV结合成员的较低剂量是有利的，因为其扩展了给药途径。实施例实施例I :hCMV特异件记忆B细胞的FACS分诜和IgG阳件记忆B细胞的EBV转化在获得知情供体的同意之后，从健康的hCMV血清反应阳性的供体中采集外周血(300ml),已经预先筛选了高gB结合效价和有效中和hCMV活性的这些供体的血清。外周血单核细胞(PBMC)通过Ficoll密度梯度离心(Lymphof lot, Biotest, Dreieich,德国)纯化。在使用抗人⑶22微珠(Mitenyi Biotech, Bergisch Gladbach,德国)富集B细胞之后,用下列试剂标记 B 细胞a、抗人 CD19-FITC (Miltenyi Biotec，德国)；b、抗人 CD27-PE (BDBioscience Pharmigen, Basel,瑞士)；c、抗人 IgG-bio (Jackson Immuno-Research, WestGrove, PA,美国)；d、抗生蛋白链菌素,Alexa i;Uu)r" 350 结合物(Molecular Probes Inc,Eugene，0R，USA)和e、Cy5-标记的糖蛋白B (IOOng每IxlO6个B细胞)。通过分选满足以下四个标准的细胞分离了 gB-特异性的、IgG-阳性记忆B细胞FITC+/PE+/Alexa Muor'350+和Cy5+ (见图2)。可替换地，用以下试剂标记B细胞a、抗人CD19_PerCP (Dianova,Hamburg,德国);b、抗人CD27_PE(BD Bioscience Pharmigen,Basel,瑞士);c、抗人IgG-FITC(Dianova, Hamburg,德国)；d、Cy5_标记的糖蛋白B (IOOng每IxlO6个B细胞)。使用l.'ACSCalibl!rKl(Becton Dickinson,Heidelberg,德国)分析或通过分选满足 PerCP+/PE+/FITC+和Cy5+标准的细胞分离这些gB-特异性的、IgG-阳性的记忆B细胞。在包含经照射的饲养细胞(人包皮成纤维细胞,HFF)的汇合层(confluent layer)的96-孔平底微量培养板中，使用MoFlo 细胞分选仪(Cytomation, Freiburg,德国)分选浓度为5或10个细胞/孔的细胞。在包括如先前描述(Ros6n等，1997 ；Bernasconi等，2002 Jung等，2002 ;Traggiai等2004)的细胞培养上清液(生产EBV的细胞系B95-8的30%上清液)和CpG ODN 2006 (2. 5 μ g/ml)的EBV存在下，经分选的细胞在以2mM的谷氨酰胺、100IU/ml的青霉素、100 μ g/ml的链霉素、50μΜ的2-巯基乙醇和10%胎牛血清(力口热失活的)(PAN-Biotech，Aidenbach，德国)补充的RPMI-1640完全培养基中生长。在三周之后，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)，对来自产生的细胞系的培养上清液筛选gB-特异性。简单地说，用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中的0.5 μ g/ml的糖蛋白B在4°C下涂布ELISA板(Nunc)，持续16h。涂有gB的板用以0. 05%的吐温(ELISA洗涤缓冲液)补充的磷酸盐缓 冲盐水(PBS)洗涤6次，并用以0. 05%的吐温和2%的胎牛血清(ELISA缓冲液)补充的PBS封闭2h。在室温下孵育每个孔中的50μ I培养上清液lh，在另外的洗涤步骤之后，使用与过氧化物酶(Jackson Immuno-Research,美国)结合的Fe Y片段-特异性二次抗体(二抗)显示了结合的抗体。在Ih孵育期之后，通过洗涤去除未结合的二次抗体，并且使用在0. 05M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH 5. 0),0. 05%H202中的50 μ I/孔的浓度为0. 04mg/ml的邻-苯基二胺测定酶活性。在室温下孵育10分钟之后，通过加入50 μ I/孔的2M H2SO4中止反应并使用 Spectramax 190ELISA 光度计(Molecular Devices, Sunnyvale, CA,美国)测定在492nm 下的光密度(0D)。Softmax Pro 3. O (Molecular Devices, USA)软件用于分析。实施例2 :体外hCMV中和实验使用在hCMV基因组中包括萤光素酶报告基因表达盒的hCMV重组株AD169(HB15-UL84prluc)，筛选gB-特异性的培养上清液的中和活性，当感染目标细胞(由ThomasStamminger 医生和教授善意提供的，Institute of Clinical and Molecular Virology,University Hospital Erlangen,德国)后该hCMV基因组导致萤光素酶的表达。在96孔板上，通过TCID50试验在初始的(初代)成纤维细胞(HFF或MRC-5细胞)中测定病毒上清液的传染效价，正如在Mahy和Kangro( 1996)中所描述的。对于基于萤光素酶的中和试验，在96孔U形底微量培养板中，在37°C下孵育等体积的gB-特异性上清液和经滴定的AD169 Δ Luc上清液(300pfu) lh。将抗体-病毒混合物转移到预先接种的HFF单层上。在37°C下另外孵育4h之后，用完全培养基替换抗体-病毒混合物。紧接着在37°C下孵育另外42h，用每孔100 μ I Glo溶解缓冲液(Promega，Madison, WI)溶解细胞。将30 μ I溶解的孔各自置于白色的96孔的LIA板(Greiner Bio-one, Frickenhausen,德国)中。向每个孔中加入50μ L 试验缓冲液(15mM KH2PO4, 25mM 双甘氨肽、IM MgSO4、0. 5M EGTA、5mMATP、ImM DTT)。每孔(以25mM双甘氨肽、IM MgS04、0. 5M EGTA、2mM DTT和0. 05mM D-荧光素)中注射50 μ LD-萤光素(P. J. K. Kleinbittersdorf,德国)溶液并通过 Centro LB 960 发光计(BertholdTechnologies, Bad Wildbad,德国)进行化学发光的检测。MicroWin2000 软件(MikrotekLaborsysteme, Overath,德国)用于分析。使用下列的计算以百分中和表示用发光计测定的相对光单位(RLU)%中和=IOOx (V0-Vn) /Vtl，其中Vn代表包括病毒和抗体的孔中的RLU，V0代表仅包括病毒的孔中的RLU。第一次筛选显示9种(其中和hCMV感染性)gB-特异性培养上清液，而第二次筛选显示另外3种(其中和hCMV感染性)gB-特异性培养上清液。将9种EBV永生化的记忆B细胞系和由它们产生的中和抗体命名为SMI、SM3、SM4、SM5、SM6、SM7、SM9、SMlO和SMll (见下表I)。将另外的3种EBV永生化的记忆B细胞系和由它们产生的中和抗体命名为SM12、2C2和1G2 (见下表I)。50%中和滴定度(滴度)(IC5tl)表示为导致hCMV感染降低50%的抗体浓度。同样，90%中和滴定度(IC9tl)表示为导致hCMV感染降低90%的抗体浓度。为了计算抗体的中和活性，通过ELISA测定培养上清液IgG浓度。为此目的，用抗-人IgG、Fe Y片段-特异性捕获抗体涂覆ELISA板(Jackson Immuno-Research,美国)。ELISA缓冲液中的SM-抗体培养上清液的两倍系列稀释液与已知浓度的多克隆IgG标准相比较(II. lmg/ml的储备浓度；Cat No :009-000-003, Jackson Immuno-Research,美国)。使用 ELISA Softmax Pro 3. O 软件计算样品的IgG浓度(Molecular Devices, Sunnyvale, CA,美国)。下表I中显示了相对于EBV细胞系培养上清液的IgG浓度的中和活性复I EBV-永生化的记忆B细胞系的性质
权利要求
1.一种针对人类巨细胞病毒(hCMV)gB蛋白的经分离的结合成员，其在残基100到447内的区域结合hCMV gB蛋白，所述残基编号为根据全长gB株AD169氨基酸SEQ ID No: 239定义的。
2.一种针对hCMV gB蛋白经分离的结合成员，其结合Kd至多是由表面细胞质基因组共振定义的InM的hCMV gB蛋白。
3.根据权利要求2所述的结合成员，其中，所述KD至多是O.5nM。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的结合成员，其中，所述KD至多是O.InM。
5.根据前述权利要求中的任意一项所述的结合成员，其中所述结合成员不结合至hCMVgB蛋白的抗原区I (AD-I)或抗原区2 (AD-2)。
6.根据前述权利要求中的任意一项所述的经分离的结合成员，其中需要中和50%hCMV的临床分离株的结合成员的浓度为10μ g/ml或小于在中和试验中用于人包皮成纤维细胞的hCMV感染的中和。
7.一种针对hCMV的经分离的结合成员，包括一组CDR :HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、IXDR2和IXDR3，其中所述组的⑶R具有来自以下一组⑶R的22个以下的氨基酸改变 HCDRl具有氨基酸SEQ ID No: 3 ; HCDR2具有氨基酸SEQ ID No: 4 ; HCDR3具有氨基酸SEQ ID No: 5 ; LCDRl 具有氨基酸 SEQ ID No: 93 ； LCDR2具有氨基酸SEQ ID No:94 ;以及 IXDR3具有氨基酸SEQ ID No: 95，并且其中，所述结合成员具有至多由表面细胞质基因组共振定义的50nM的Kd。
8.根据权利要求I至6中任意一项所述的针对hCMV的经分离的结合成员，包括一组⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和IXDR3，其中所述组的⑶R具有来自以下一组⑶R的22个以下的氨基酸改变，其中 HCDRl具有氨基酸SEQ ID No: 3 ; HCDR2具有氨基酸SEQ ID No: 4 ; HCDR3具有氨基酸SEQ ID No: 5 ; LCDRl 具有氨基酸 SEQ ID No: 93 ； LCDR2具有氨基酸SEQ ID No:94 ;以及 LCDR3 具有氨基酸 SEQ ID No:95。
9.根据任何权利要求7或8任意一项所述的结合成员，包括HCDRl，其中Kabat 残基 31 是 Asp 或 Gly ；Kabat 残基 32 是 His、Phe 或 Tyr ；Kabat 残基 33 是 Tyr ； Kabat残基34是Met、Ile或Leu ；以及 Kabat 残基 35 是 Val 或 Asn0
10.根据权利要求9所述的结合成员，其中，HCDRl是SEQID No:3。
11.根据权利要求7至10中任意一项所述的结合成员，包括HCDR2，其中Kabat 残基 50 是 Trp、Ser 或 Cys ；Kabat 残基 53 是 Gin、Asn 或 His ；Kabat 残基 54 是 Ser 或 Thr ； Kabat 残基 58 是 Gly、Lys、Asn 或 His ； Kabat残基60是Gly或Ala ；以及 Kabat 残基 64 是 Gln 或 Arg。
12.根据权利要求11所述的结合成员，其中，HCDR2具有氨基酸SEQID No:4。
13.根据前述权利要求中任意一项所述的结合成员，包括HCDR3，其中Kabat 残基 99 是 Thr 或 Ala ；Kabat 残基 100 是 Val 或 Met ； Kabat 残基 100A 是 Ser 或 Thr Kabat 残基 100B 是 Asn 或 Thr ；Kabat 残基 100C 是 Ser 或 Phe ；Kabat 残基 100E 是 Leu、Met 或 Ala ；Kabat 残基 100F 是 Ser 或 Gly ；Kabat 残基 100K 是 His 或 Tyr ；Kabat 残基 100L 是 Asn、Ser 或 Asp ；Kabat 残基 100M 是 Arg、VAl 或 Ile ;Kabat 残基 100N 是 Leu 或 Met ； Kabat残基101是Asp或Gly ；以及 Kabat 残基 102 是 Ala、Val 或 Ile0
14.根据权利要求13所述的结合成员，其中，HCDR3具有氨基酸SEQID No:5。
15.根据权利要求7至14中任意一项所述的结合成员，其中LCDRl中的Kabat残基26是Ser或Asn,或其中IXDRl中的Kabat残基27是Ser或Arg0
16.根据权利要求15所述的结合成员，其中，LCDRl是SEQID No:930
17.根据权利要求7至16中任意一项所述的结合成员，其中LCDR2中的Kabat残基56是 Ser 或 Pro。
18.根据权利要求17所述的结合成员，其中，LCDR2是SEQID No:94。
19.根据前述权利要求中任意一项所述的结合成员，包括LCDR3，其中Kabat 残基 89 是 Gly 或 Ala ；Kabat 残基 91 是 Pro 或 Trp ；Kabat 残基 93 是 Arg 或 Ser ；Kabat 残基 94 是 Ser 或 Asp ；Kabat 残基 95a 是 Ser、Gly 或 Ala ； Kabat残基96是Val或Tyr ；以及 Kabat 残基 97 是 Ile 或 Val。
20.根据权利要求19所述的结合成员，包括具有氨基酸SEQID No:95的IXDR3。
21.—种针对hCMV gB蛋白质的经分离的结合成员，包括抗体Ab-Ol至Ab-46的任意一种的 HCDR3、LCDR3 和 / 或一组 CDR。
22.根据权利要求21所述的经分离的结合成员，其在残基121至132和344至438内的区域结合hCMV gB蛋白，所述残基编号为根据全长gB菌株AD169的氨基酸序列SEQ ID:239定义的。
23.根据前述权利要求中任意一项所述的成员，包括一组CDR=HCDRl, HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，其中HCDRl 是 SEQ ID NO:3 ；HCDR2 是 SEQ ID NO:4 ；HCDR3 是 SEQ ID NO:5 ；LCDRl 是 SEQ ID NO:93 ； LCDR2 是 SEQ ID NO: 94;以及 LCDR3 是 SEQ ID NO:95。
24.根据前述权利要求中任意一项所述的结合成员，其中所述结合成员包括抗体分子或其功能片段，所述抗体分子或其功能片段包括抗体Vh区，并且其中所述Vh区具有在SEQID No: 2中显示的所述Vh区氨基酸序列。
25.根据前述权利要求中任意一项所述的结合成员，其中所述结合成员包括抗体分子或其功能片段，所述抗体分子或其功能片段包括抗体\区，并且其中所述\区具有在SEQID No:92中显示的所述VL区氨基酸序列。
26.—种包括重链和轻链的经分离的抗体分子，所述重链包括氨基酸SEQ ID No:2并且所述轻链包括氨基酸序列SEQ ID No:92。
27.—种结合hCMV gB蛋白的经分离的抗体分子，其中所述抗体分子包括至少90%同一于SEQ ID No:2的Vh区氨基酸序列和至少90%同一于SEQ ID No:92的\区氨基酸序列。
28.—种用于hCMV gB蛋白质的经分离的结合成员，包括抗体Ab-47至Ab-50的任意一种的 HCDR3、LCDR3 和 / 或一组 CDR。
29.根据权利要求28所述的经分离的结合成员，其在氨基酸残基133至343内的区域结合hCMVgB蛋白，所述残基编号为根据全长gB菌株AD169氨基酸SEQ ID No:239定义的。
30.根据权利要求I至6、28和29中任意一项所述的结合成员，包括一组⑶R=HCDRl,HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，其中HCDRl 是 SEQ ID No:243 ；HCDR2 是 SEQ ID No:244 ；HCDR3 是 SEQ ID No:245 ；LCDRl 是 SEQ ID No:263 ； LCDR2 是 SEQ ID No :264;以及 LCDR3 是 SEQ ID No:265。
31.根据权利要求I至6、28和29中任意一项所述的结合成员，包括一组⑶R=HCDRl,HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，其中HCDRl 是 SEQ ID No:248 ；HCDR2 是 SEQ ID No:249 ；HCDR3 是 SEQ ID No:250 ；LCDRl 是 SEQ ID No:268 ；LCDR2 是 SEQ ID No :269;以及LCDR3 是 SEQ ID No:270。
32.根据权利要求I至6、28和29中任意一项所述的结合成员，包括一组⑶R=HCDRl,HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，其中HCDRl 是 SEQ ID No:253 ；HCDR2 是 SEQ ID No:254 ；HCDR3 是 SEQ ID No:255 ；LCDRl 是 SEQ ID No:273 ；LCDR2 是 SEQ ID No :274;以及LCDR3 是 SEQ ID No:275。
33.根据权利要求I至6、28和29中任意一项所述的结合成员，包括一组⑶R=HCDRl,HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，其中HCDRl 是 SEQ ID No:258 ；HCDR2 是 SEQ ID No:259 ；HCDR3 是 SEQ ID No:260 ；LCDRl 是 SEQ ID No:278 ；LCDR2 是 SEQ ID No :279;以及LCDR3 是 SEQ ID No:280。
34.根据权利要求I至6和28至30中任意一项所述的结合成员，其中，所述结合成员包括抗体分子或其功能片段，所述抗体分子或其功能片段包括抗体Vh区，并且其中所述Vh区具有在SEQ ID No :242中显示的所述Vh区域氨基酸序列。
35.根据权利要求I至6和28、29和31中任意一项所述的结合成员，其中，所述结合成员包括抗体分子或其功能片段，所述抗体分子或其功能片段包括抗体Vh区，并且其中所述Vh区具有在SEQ ID No:247中显示的所述Vh区氨基酸序列。
36.根据权利要求I至6和28、29和32中任意一项所述的结合成员，其中，所述结合成员包括抗体分子或其功能片段，所述抗体分子或其功能片段包括抗体Vh区，并且其中所述Vh区具有在SEQ ID No:252中显示的所述Vh区氨基酸序列。
37.根据权利要求I至6和28、29和33中任意一项所述的结合成员，其中，所述结合成员包括抗体分子或其功能片段，所述抗体分子或其功能片段包括抗体Vh区，并且其中所述Vh区具有在SEQ ID No:257中显示的所述Vh区氨基酸序列。
38.根据权利要求I至6和28至30和34中任意一项所述的结合成员，其中，所述结合成员包括抗体分子或其功能片段，所述抗体分子或其功能片段包括抗体'区，并且其中所述' 区具有在SEQ ID No:242中显示的所述' 区氨基酸序列。
39.根据权利要求I至6和28、29、31和35中任意一项所述的结合成员，其中，所述结合成员包括抗体分子或其功能片段，所述抗体分子或其功能片段包括抗体\区，并且其中所述\区具有在SEQ ID No:267中显示的所述\区氨基酸序列。
40.根据权利要求I至6和28、29、32和36中任意一项所述的结合成员，其中，所述结合成员包括抗体分子或其功能片段，所述抗体分子或其功能片段包括抗体\区，并且其中所述'区具有在SEQ ID No :272中显示的所述'区氨基酸序列。
41.根据权利要求I至6和28、29、33和37中任意一项所述的结合成员，其中，所述结合成员包括抗体分子或其功能片段，所述抗体分子或其功能片段包括抗体\区，并且其中所述'区具有在SEQ ID No :277中显示的所述'区氨基酸序列。
42.一种包括重链和轻链的经分离的 抗体分子，所述重链包括氨基酸SEQ ID No:242并且所述轻链包括氨基酸序列SEQ ID No:262。
43.一种包括重链和轻链的经分离的抗体分子，所述重链包括氨基酸SEQ ID No:247并且所述轻链包括氨基酸序列SEQ ID No:267。
44.一种包括重链和轻链的经分离的抗体分子，所述重链包括氨基酸SEQ ID No:252并且所述轻链包括氨基酸序列SEQ ID No:272。
45.一种包括重链和轻链的经分离的抗体分子，所述重链包括氨基酸SEQ ID No :257并且所述轻链包括氨基酸序列SEQ ID No:277。
46.一种结合hCMV gB蛋白的经分离的抗体分子，其中所述抗体分子包括至少90%同一于SEQ ID:242的Vh区氨基酸序列和至少90%同一于SEQ ID No:92的\区氨基酸序列。
47.一种结合hCMV gB蛋白的经分离的抗体分子，其中所述抗体分子包括至少90%同一于SEQ ID:247的Vh区氨基酸序列和至少90%同一于SEQ ID No:267的\区氨基酸序列。
48.一种结合hCMV gB蛋白的经分离的抗体分子，其中所述抗体分子包括至少90%同一于SEQ ID:252的Vh区氨基酸序列和至少90%同一于SEQ ID No:272的\区氨基酸序列。
49.一种结合hCMV gB蛋白的经分离的抗体分子，其中所述抗体分子包括至少90%同一于SEQ ID:257的Vh区氨基酸序列和至少90%同一于SEQ ID No:277的\区氨基酸序列。
50.一种与前述权利要求中任意一项所述的结合成员或经分离的抗体分子竞争结合于hCMV gB蛋白的结合成员或抗体分子。
51.根据任何权利要求26、27、42至50中任意一项所述的抗体分子，其中抗体分子是IgG0
52.根据权利要求24、26、27、34至37和42至51中任意一项所述的抗体分子的经分离的VH区。
53.根据任何权利要求25至27和38至51中任意一项所述的抗体分子的经分离的VL区。
54.一种组合物，包括根据权利要求I至25和28至41中任意一项所述的经分离的结合成员、或根据权利要求26、27和42至51中任意一项所述的抗体分子，以及药用赋形剂。
55.一种组合物，包括根据权利要求I至25和28至41中任意一项所述的经分离的结合成员、或根据权利要求26、27和42至51中任意一项所述的抗体分子，在通过治疗对人类和动物体进行治疗的方法中的应用。
56.根据权利要求55的组合物，在治疗与hCMV相关的紊乱中的应用。
57.一种组合物，包括根据权利要求I至25和28至41中任意一项所述的经分离的结合成员、或根据权利要求26、27和42至51中任意一项所述的抗体分子，在治疗与hCMV相关的紊乱中的应用。
58.根据权利要求56所述的组合物或根据权利要求57所述的应用，其中所述紊乱是hCMV感染。
59.根据权利要求55至58中任意一项所述的组合物，进一步包括结合hCMVgB、gH、gL、UL128、UL130和/或UL131A蛋白质的经分离的结合成员或抗体分子。
60.一种治疗个体与hCMV相关的紊乱的方法，包括向所述个体给予根据权利要求I至25和28至41中任意一项所述的结合成员、或根据权利要求26、27和42至51中任意一项所述的抗体分子，并优选其中所述个体具有缺乏抵抗力的免疫系统。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，所述个体是孕妇、新生儿，移植接受者或感染HIV的个体。
62.—种经分离的核酸分子,包括编码根据权利要求I至25和28至41中任意一项所述的结合成员、根据权利要求52所述的Vh区、根据权利要求53所述的\区、或根据权利要求26、27和42至51中任意一项所述的抗体分子的核苷酸序列。
63.一种用根据权利要求62所述的核酸分子在体外转染或转导的宿主细胞。
64.一种产生结合成员、抗体分子或抗体Vh或\区的方法，包括在产生所述结合成员、抗体分子或抗体Vh或\区的条件下培养根据权利要求63的宿主细胞。
65.根据权利要求64所述的方法，其中，进一步包括分离和/或纯化所述结合成员、抗体分子、Vh区或'区。
66.根据权利要求64或权利要求65的方法，进一步包括将所述结合成员、抗体分子、Vh区或\区配制成包括至少一种另外组分的组合物。
67.一种用于产生针对hCMV抗体的抗原结合区的方法，所述方法包括，通过在包括HCDR1,HCDR2和HCDR3的母体Vh区的氨基酸序列中增加、缺失、替换或插入一个或多个氨基酸，其中，所述母体Vh区HCDR1、HCDR2和HCDR3是在表19中显示的一组HCDR，提供Vh区，其为母体Vh区的氨基酸序列变异体，以及可选地结合Vh区从而与一个或多个\区一起提供，以提供一种或多种VH/VL组合体；并且测试所述Vh区，其为母体Vh区或VH/VL的一种组合体或多种组合物以鉴定针对hCMV的抗体抗原结合区。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述一种或多种\区通过在包括LCDRl、LCDR2和LCDR3的母体' 区的氨基酸序列中增加、缺失、替换或插入一个或多个氨基酸的方式提供，其中所述母体\区IXDRl、IXDR2和IXDR3是如表19所示的⑶R的\组，产生一个或多个\区，其中的每一个是所述母体\区的氨基酸序列变异体。
69.根据权利要求67或权利要求68的方法，其中所述Vh区通过⑶R诱变提供，所述Vh区是母体Vh区的氨基酸序列变异体。
70.根据任何权利要求67至69所述的方法，进一步包括以组分IgG、scFv、Fab或双特异性抗体分子或多特异性抗体产生抗体抗原结合区。
71.一种用于产生结合hCMV的结合成员的方法，所述方法包括提供编码Vh区的起始核酸或各自编码Vh区的系列起始核酸，其中所述一个Vh区或多个Vh区包括编码将要替换的HCDRl、HCDR2和/或HCDR3或缺少HCDRl、HCDR2和/或HCDR3编码区；将所述起始核酸或起始系列核酸与编码或由如表19所示的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3的氨基酸序列的变异体产生的一种供体核酸或多种供体核酸组合,使得所述一种供体核酸或多种供体核酸插入所述起始核酸或起始系列核酸的CDR1、CDR2和/或CDR3区，以便提供编码Vh区的核酸的产物系列；表达所述产物系列的核酸以产生Vh区产物；可选地使所述VHg产物和一个或多个' 区结合；选择针对hCMV的结合成员，所述结合成员包括Vh区产物或可选地' 区产物；并且回收所述结合成员或编码它的核酸。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述供体核酸由所述HCDRl和/或HCDR2和/或HCDR3的突变产生。
73.根据权利要求72所述的方法，包括通过核酸的随机突变提供所述供体核酸。
74.根据权利要求67至73中任意一项所述的方法，进一步包括附着Vh区产物，所述Vh区被包含在所述回收的结合成员到抗体恒定区内。
75.根据权利要求67到74中任意一项所述的方法，包括提供IgG、scFv、Fab或双特异性抗体分子或多特异性抗体，其包括所述Vh区产物和\区产物。
76.根据权利要求67至75中任意一项所述的方法，进一步包括测试所述抗体抗原结合区或结合成员结合hCMV以中和hCMV的能力。
77.根据权利要求76所述的方法，其中，获得包括结合和中和hCMV的抗体分子的结合成员。
78.一种中和对象或样品中hCMV的方法，包括以有效量的、从约O. I至约5. O μ g/ml的浓度给予所述对象或样品根据权利要求I至25和28至41中任意一项所述的结合成员、或根据权利要求26、27和42至51中任意一项所述的抗体分子，以降低hCMV感染至少50%。
全文摘要
本发明涉及结合成员，特别是抗体分子，其中和人类巨细胞病毒(hCMV)的生物效应。该结合成员可用于治疗和预防hCMV感染。
文档编号C07K16/08GK102892782SQ201080064592
公开日2013年1月23日 申请日期2010年12月22日 优先权日2009年12月23日
发明者乌尔夫·格拉文德尔, 迈克尔·马赫, 路易斯·马丁-帕拉, 索尼娅·珀奇, 纳贾·施平德勒, 海因里希·施蒂希特, 安娜-卡塔琳娜·维格斯, 托马斯·温克勒 申请人:4-抗体股份公司