专利名称：对瘢痕成纤维细胞生长具有抑制作用的蛋白质的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于蛋白质工程技术领域，具体而言，本发明涉及对瘢痕成纤维细胞生长具有抑制作用的蛋白质的应用。
背景技术：
皮肤的瘢痕形成能够产生功能、容貌和心理方面的病态，因此有必要进行治疗(参见Hunt，T. K. ,World J Surg 4(3) :271-7(1980) ；Nicolai, J. P.等，11 (1) :29-32(1987) )0 常规的瘢痕治疗包括，手术、注射皮质类固醇、放疗、硅胶薄膜敷贴和压力疗法等(参见 Mustoe, Τ. A.等，Plast Reconstr Surg, 110(2) :560-71 (2002))。这些方法大都治疗效果不好，有的副作用很大甚至影响修复和愈合。因此，寻求新的促修复分子，既能正向加速修复细胞增殖、促进愈合，又能降低胶原合成、负向调节瘢痕的形成，使两个矛盾的过程协调统一，对促进创伤愈合尤其是放创复合伤、大面积创伤、烧伤等难愈伤口愈合和具有纤维化倾向的组织修复，降低瘢痕形成，改善修复质量有着十分重要的意义。皮肤瘢痕形成的发病机制和生物学模式尚未完全知晓。瘢痕形成的特征在于生长超出了原始外伤部位周边，与家族因素有关，并很少退化(参见Tredget，E.E.，Arm N Y Acad Sci,888 :165-82 (1999))。增生性瘢痕是增生性红斑状纤维病变，经常随时间而经历分解，与组织挛缩相关(参见 Tredget，Ε. E.，Ann N Y Acad Sci，888 :165-82 (1999))。尽管瘢痕疙瘩和增生性瘢痕在遗传连锁和免疫学参数方面不同，但二者均与成纤维细胞过度增殖和过量胞外基质(ECM)沉积相关(参见Rockwell，W. B.等，Plast Reconstr Surg, 84(5) :827-37 ；Tsao, S. S.等，Semin Cutan Med Surg, 21(1) :46-75(2002) ；Nemeth，A. J.， J Dermatol Surg Oncol 19(8) :738-46 (1993))。中国专利申请第 201010106424. 8 号公开了一种人ski基因编码的蛋白质，其能够用于治疗皮肤瘢痕。本发明人令人惊讶地从现有蛋白质中发现了一种新的蛋白质及其片段的应用，其对瘢痕成纤维细胞生长具有抑制作用，为皮肤瘢痕的治疗提供了新的分子，而且分子量可以较小，更适宜减轻工程菌负担从而使得表达量增加。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的蛋白质应用，其中所述蛋白质对瘢痕成纤维细胞生长具有抑制作用，为皮肤瘢痕的治疗提供了新的分子，而且该分子可以较短。本发明的有益效果是能够用于皮肤瘢痕的治疗，而且蛋白质的抑制瘢痕成纤维细胞生长的活性高，分子量可以较小，且活性成剂量依赖性。具体而言，本发明提供了如SEQ ID NO :3所示序列的蛋白质。该蛋白质是本发明人长期研究获得的截短后的蛋白，甚至截去部分现有公开的蛋白质的结构域片段，在本发明人发现生物活性之前，无法被预期还能保持相应功能用途。
本发明还提供了包含如SEQ ID NO :3所示序列的蛋白质在制备抑制瘢痕成纤维细胞生长的药物中的应用。其中，所述蛋白质的序列如SEQ ID NO 2所示。其中，所述蛋白质的序列如SEQ ID N0:3所示。其中，所述蛋白质是单独应用的，即本发明提供了包含如SEQ ID NO :3所示序列的蛋白质单独作为有效成分在制备抑制瘢痕成纤维细胞生长的药物中的应用。另外，本发明还提供了包含如SEQ ID NO :3所示序列的蛋白质在制备抑制瘢痕形成的药物中的应用。其中，所述蛋白质的序列如SEQ ID NO 2所示。其中，所述蛋白质的序列如SEQ ID NO 3所示。其中，所述蛋白质是单独应用的，即本发明提供了包含如SEQ ID NO :3所示序列的蛋白质单独作为有效成分在制备抑制瘢痕形成的药物中的应用。另外，本发明还提供了包含如SEQ ID NO :3所示序列的蛋白质的制备方法，其包括
(1)以如SEQ ID N0:1 所示的 cDNA 为模板，使用引物 5，-TACCATATGACGATCGCATCGC-3， 和 5，-TGGGATCCTCTAGGACGTGAT-3，进行 PCR 扩增；
(2)PCR扩增用Nde I及BamHI酶双酶切后，克隆入pET_28a载体，构建成重组载体；
(3)将上述重组载体转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，IPTG诱导；
(4)对表达出的目的蛋白rsRII进行包涵体纯化和复性；和
(5)将复性产物经过M2+-NTA柱纯化，优选使用凝血酶进行酶切，这样获得的蛋白质的序列如SEQ ID NO :3所示。
图1是本发明的对瘢痕成纤维细胞生长具有抑制作用的蛋白质基因在BL21(DE3) 中的诱导表达，包涵体的提取，溶解和纯化，Ni+柱纯化的目的蛋白的SGS-PAGE鉴定和鼠抗 His6-tag的western-blotting鉴定结果，A图中泳道1是未经IPTG诱导5h后的全菌蛋白，2是经IPTG诱导证的全菌蛋白，3是超声裂解后沉淀，4是超声裂解后上清；B图中泳道 1是经break buffer洗脱后的沉淀，2是经extraction buffer洗脱后的上清，3_5 经过不同的咪唑浓度纯化后的目的蛋白；C图是泳道1是经Ni2+-NTA纯化后最终目的蛋白，2是经 Ni2+-NTA纯化后目的蛋白的Western blot。图2A表明不同浓度的本发明的对瘢痕成纤维细胞生长具有抑制作用的蛋白质对分离的瘢痕成纤维细胞作用48小时后，对兔的瘢痕成纤维细胞有明显抑制作用，且呈剂量依赖效应。图2B表明以^yg/ml的本发明的蛋白浓度检测在Mh，4 和7 对家兔瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用，同时也说明本发明的蛋白对人的瘢痕成纤维细胞也具有明显抑制作用(图示黑柱状图)。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。 在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中的常规方法，可参见《分子克隆实验指南执行》。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
实施例1基因的克隆材料家兔，人工饲养。(1)引物设计化学合成如下简并的正义寡核苷酸引物Fl 5，-ATGGGTCGGGGGCTGCTCNGGG-3，，与反义寡核苷酸引物 Rl :5，- CTATTTGGTAGT GTTNAG NGAGCCNTCT-3， (N=A, T, C or G)
(2)提取总RNA 应用RNA抽提试剂TRIzol (Invitrogen公司)提取出家兔血液中的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。(3)应用RT-PCR方法，以上述Fl和Rl为特异性引物，扩增出TGF-β RII cDNA的一段序列，全长为1704bp，克隆入pMD18-T载体(可购自^witrogen公司)，并对其碱基序列进行测定。RT-PCR的反应条件为以总RNA为模板，在50 μ 1反应体系中，加入5 X RT-PCR反应缓冲液10 μ l、25mM MgS042 μ IUOmM dNTP混合物1 μ 1、20 μ M的上下游引物各2. 5 μ 1、 AMV逆转录酶(Takara公司)1 μ 1、pfu高保真DNA聚合酶1 μ 1及RNA模板2 μ 1，补水至 50μ 1。RT-PCR循环参数为481逆转录451^11，941变性2 min，再进行^fPCR循环(94°C 变性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s)，最后于72°C延伸7 min。RT-PCR产物用的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约1704bp的DNA条带，克隆入pMD18-T载体，经含 Amp抗生素(50mg/ml)的琼脂糖平板筛选转化子，挑取出8个阳性克隆送往上海生工测序公司进行碱基序列测定，得到如SEQ ID N0:1所示的全长cDNA碱基序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
实施例2重组载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达
以实施例1得到的全长cDNA为模板，设计引物rsFl (5，-TACCATATGACGATCGCATCGC-3，)和 rsRl (5，-TGGGATCCTCTAGGACGTGAT-3，)扩增出 cDNA片段(简称为rsRII，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示)，引物分别引入酶切位点Nde I及BamHI，亚克隆入pET_28a载体，构建成重组载体pET28a-rsRII。将此重组载体转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，诱导表达出目的蛋白rsRII (其N端带有His-tag)。重组目的蛋白的包涵体的纯化和复性
IPTG诱导含有重组载体pET28a-rSRII的大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3) 5小时后，将 500 ml诱导表达菌离心后收集的菌体用break buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.9，10 mM EDTA, 1% (v/v) Sucrose,0. 2 mg/ml lysozyme)重悬，12 000 r/min离心 15 min,弃上清，再重悬于 wash buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.9，4 M Urea, 5 mM EDTA, 0. 5 mM DTT), 12 000 r/min离心 15 min,弃上清，再重悬于 extraction buffer (50 mM Glycine,16 mM NaOH, 5 mM GSH, 5 mM DTT, 8 M guanidine · HCl)，超声裂解后，离心后弃沉淀， 留上清经refolding buffer I (20 mM Tris-HCl, pH 7.9，0. 1 mM DTT)在4°C透析 3h， 然后经 refolding buffer II (20 mM Tris-HCl, pH 7.9，1 mM EDTA, 1 mM GSH, 0.1 mM GSSG)在4°C透析过夜，然后过Ni2+-NTA柱纯化，可以用凝血酶切除N端的His-tag，再 SDS-PAGE检测纯化的目的蛋白和用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。western 印迹分析
Western-blot中所用一抗为羊抗His6单抗，二抗为辣根过氧化酶标记的兔抗羊IgG。 其简要步骤是将诱导的产物先行SGS-PAGE，然后以半干法将蛋白电转移至PVDF膜上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5%脱脂奶粉室温封闭lh，与一抗孵育12h，与 HRP标记的二抗IgG孵育池，每步完成后均严格洗膜，最后加ECL避光显色。结果如图IC 所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。
实施例3重组表达的蛋白对家兔瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用实验取正常和临床上鉴定为瘢痕样本的兔组织，于盛有带有双抗的PBS溶液的小平皿中剪碎，利用I型胶原酶组织消化法分离家兔正常和瘢痕成纤维细胞，在37°C、5% C02浓度条件下培养。取分离的兔瘢痕成纤维细胞，用DMEM (含10% FCS)培养液调整细胞浓度至约 IX IO5个/ml，在96孔板中每孔加入50 μ 1细胞，再分组依次加入实施例2所制备的重组蛋白rsRII，重组蛋白的终浓度分别为10、20、30、40、501^/1111，以？85为空白对照。在37°C、 5% CO2浓度条件下培养48h，在体外通过MTT细胞毒试验检测重组蛋白对兔瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用实验，如图2所示，结果表明本发明克隆得到的重组蛋白以剂量依赖的方式抑制家兔瘢痕成纤维细胞生长，同时以40 μ g/ml的蛋白浓度检测在Mh，4 !和7 对家兔瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用，结果表明本发明克隆得到的重组蛋白对家兔瘢痕成纤维细胞生长具有明显抑制作用。直接选用实施例1所得的全长cDNA碱基序列编码的蛋白质重复上述试验，以 40 μ g/ml的蛋白浓度检测在7 对家兔瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用，发现抑制率为 7%，低于以上截短的片段的活性。
权利要求
1.如SEQID NO :3所示序列的蛋白质。
2.包含如SEQID NO :3所示序列的蛋白质在制备抑制瘢痕成纤维细胞生长的药物中的应用。
3.权利要求2所述的应用，其中所述蛋白质的序列如SEQID N0:2所示。
4.权利要求2所述的应用，其中所述蛋白质的序列如SEQID N0:3所示。
5.权利要求2所述的应用，其中所述蛋白质是单独应用的。
6.包含如SEQID NO :3所示序列的蛋白质在制备抑制瘢痕形成的药物中的应用。
7.权利要求6所述的应用，其中所述蛋白质的序列如SEQID N0:2所示。
8.权利要求6所述的应用，其中所述蛋白质的序列如SEQID N0:3所示。
9.权利要求6所述的应用，其中所述蛋白质是单独应用的。
10.如SEQID NO :3所示序列的蛋白质的制备方法，其包括(1)以如SEQ ID N0:1 所示的 cDNA 为模板，使用引物 5，-TACCATATGACGATCGCATCGC-3， 和 5，-TGGGATCCTCTAGGACGTGAT-3，进行 PCR 扩增；(2)PCR扩增用Nde I及BamHI酶双酶切后，克隆入pET_28a载体，构建成重组载体；(3)将上述重组载体转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，IPTG诱导；(4)对表达出的目的蛋白rsRII进行包涵体纯化和复性；和(5)将复性产物经过Ni2+-NTA柱纯化。
全文摘要
本发明提供了如SEQIDNO3所示序列的蛋白质及其在制备抑制瘢痕成纤维细胞生长和/或瘢痕形成的药物中的应用。
文档编号C07K14/47GK102153642SQ20111000093
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月5日 优先权日2011年1月5日
发明者刘洁婷, 刘海峰, 初彦辉, 吴丹, 王小花, 袁晓环, 赵冰海, 郭冉 申请人:牡丹江医学院