专利名称：pET15b-PEP-1-VP3质粒及构建、PEP-1-VP3融合蛋白及表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及质粒pET15b-PEP-l-VP3的构建及PEP-1-VP3融合蛋白的表达。
背景技术：
VP3是新近发现的由鸡贫血病毒编码产生的小分子蛋白(编码VP3基因全长366bp，编码的产物VP3蛋白由121个氨基酸组成，分子量为13. 6 kD)，VP3蛋白具有广谱的诱导肿瘤细胞凋亡作用，而对正常细胞无凋亡活性和无毒性，因此，VP3蛋白很可能成为一种抗肿瘤候选药物，但前提是VP3蛋白必须在细胞内才能发挥其诱导肿瘤细胞凋亡的效应，VP3蛋白不能以天然活性形式穿透细胞，由于缺乏有效的把VP3蛋白导入细胞的方法而限制了其生物学活性的发挥。
发明内容
为了把VP3蛋白导入细胞内部，发挥其特异性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，本发明提供了一种可以以天然活性形式穿透细胞的pET15b-PEP-l-VP3质粒及构建、PEP-1-VP3融合蛋白及表达纯化方法。pET15b-PEP-l-VP3质粒，其中以图I所示的pET15b为表达载体，PEP-1-VP3基因序列见序列表I。PEP-1-VP3融合蛋白，其氨基酸序列见序列表2。一、所述的 pET15b-PEP-l_VP3 质粒的构建
(I)PCR反应及其产物的鉴定、回收和纯化
以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板，设计合成上下游引物进行PCR扩增，扩增条件起始变性95°C lmin，然后执行如下反应95°C 30s, 68°C 3min，35个循环，最后68°C延伸3min。PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳后鉴定，回收并纯化366bp的VP3 cDNA片段。(2)同源重组反应
运用靶向克隆酶，将纯化后的VP3 cDNA与带有共同酶切位点及相同末端序列的线性pET15b-PEP-l进行同源重组连接。(3)转化、筛选及测序鉴定
将重组连接产物转化大肠杆菌DH5a，并涂布到含氨苄青霉素(100ug/ml)的琼脂TB培养基上16小时，挑选白色单菌落接种于含有氨苄青霉素(lOOug/ml)的TB培养基中培养24小时，少量提取质粒，通过Xho I和BamH I双酶切电泳鉴定，然后将质粒测序鉴定。二、PEP-1-VP3融合蛋白的表达及纯化 (I) PEP-1-VP3融合蛋白的表达
将pET15b-PEP-l-VP3重组质粒转化Ε· coli (Rosetta)，铺在含氨苄青霉素(IOOug/ml)的TB培养基上16小时，挑取单个菌落至200ml含有氨苄青霉素(100ug/ml)的TB培养基中37°C下放大培养，当细菌生长至OD 600值为0. 5-1. O时加入0. 83mol/L IPTG至终浓度0. 83mol/L,置25°C下诱导培养12小时，4°C 5000rpm离心5min，收集菌体，然后用PBS洗涤3次。(2) PEP-1-VP3融合蛋白的纯化
因表达的PEP-1-VP3融合蛋白 主要以包涵体形式存在，故参照文献将收集的菌体溶于50ml 缓冲液 A (lXPBS，20mM 咪唑，6M 尿素，PH8. 0)中，400W、lOmin、间隔 5min，4°C超声破菌破包涵体41min，破菌完全的菌液较清，置超速冷冻离心机中20000rpm、4°C离心lOmin。，融合蛋白以可溶性形式存在于上清中，将上清缓慢加入Ni2+-氮基三乙酸琼脂糖亲和层析柱，上样完毕后，杂交结合3小时，以便使融合蛋白上的6个组氨酸标签与层析柱内的Ni2+结合，用10倍体积的缓冲液A过柱，洗去未结合的杂蛋白，然后用洗脱缓冲液B (1XPBS，500mM咪唑，6M尿素，PH7. 5)将融合蛋白洗脱下来。本发明通过克隆VP3基因，用基因工程手段构建出pET15b-PEP-l-VP3重组质粒，表达出PEP-1-VP3融合蛋白，然后通过纯化，较高地表达和纯化出PEP-1-VP3融合蛋白从而成功制备了可穿透细胞的PEP-1-VP3融合蛋白，为特异性诱导肿瘤细胞凋亡奠定了基础。
图I是pET15b-PEP-l_VP3质粒的构建流程图。图2是PCR扩增产物的电泳图。图3是pET15b-PEP-l_VP3重组质粒用Xho I和BamH I双酶切鉴定图。图4是裂解细菌总蛋白纯化前后行12%SDS_PAGE电泳结果。图5是裂解细菌总蛋白纯化后行Western bloting结果。
具体实施例方式一、本发明使用的试剂和材料
I、试剂
限制性内切酶Xho I、BamH I、预染蛋白分子量标准(P0066)购自New EnglandBiolabs 公司，Taq 聚合酶及 dNTP, IPTG 购自美国 Promega 公司，DNA Fragment QuickPurification/Recover’Kit购自北京鼎国生物技术有限责任公司，200bp DNA Ladder购自北京赛百盛基因技术有限公司，靶向克隆酶试剂盒(LP Recco PCR Cloning Kit)购自Loopile Company Limited, Ni2+-氮基三乙酸琼脂糖亲和层析柱购自Bio Basic Inc,Western blot检测试剂盒购自KPL公司。2菌种、质粒和引物
PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒由昆明医学院王剑松教授惠赠；pET15b_PEP_l、大肠杆菌DH5a、E. coli (Rosetta)由十堰市人民医院临床医学研究所提供。根据GeneBank中的VP3cDNA序列，设计5’端分别加有酶切位点Xho I和BamH I的PCR上下游引物，上游引物5’ -ACGTAAAGTGCTCGAGATGAACGCTCTCCAAGAA-3’，下游引物5’ -GTTAGCAGCCGGATCCTTACAGTCTTATACGCCT-3’，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。二、 实施例
实施例I :pET15b-PEP-l-VP3质粒的构建，结合图I所示的构建流程图描述如下
1.1 PCR反应及其产物的鉴定、回收和纯化以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板，设计合成上下游引物进行PCR扩增，扩增条件起始变性95°C lmin，然后执行如下反应95°C 30s, 68°C 3min，35个循环，最后68°C延伸3min, PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳后鉴定，回收并纯化366bp的VP3 cDNA片段。I. 2同源重组反应
运用靶向克隆酶，将纯化后的VP3 cDNA与带有共同酶切位点及相同末端序列的线性pET15b-PEP-l进行同源重组连接。
I. 3转化、筛选及测序鉴定
将重组连接产物转化到大肠杆菌DH5a，并涂布到含氨苄青霉素(100ug/ml)的琼脂TB培养基上16小时，挑选白色单菌落接种于含有氨苄青霉素(lOOug/ml)的TB培养基中培养24小时，少量提取质粒，通过Xho I和BamH I双酶切鉴定，然后送往上海生工生物有限公司进行测序鉴定，PEP-1-VP3的核苷酸序列见序列表I。实施例2 PEP-1-VP3融合蛋白的表达及纯化
(I)PEP-1-VP3融合蛋白的表达
将pET15b-PEP-l-VP3重组质粒转化E. coli(Rosetta)，铺在含氨苄青霉素(100ug/ml)的TB培养基上16小时，挑取单个菌落至200ml含有氨苄青霉素(100ug/ml)的TB培养基中37°C放大培养，当细菌生长至0D600为O. 5-1. O时加入O. 83mol/L IPTG至终浓度O. 83mol/L，置25°C诱导培养12小时，4°C 5000r/min离心4 min,收集菌体，然后用PBS洗涤3次。(2) PEP-1-VP3融合蛋白的纯化
因表达的PEP-1-VP3融合蛋白主要以包涵体形式存在，故参照文献将收集的菌体溶于50ml 缓冲液 A (lXPBS，20mM 咪唑，6M 尿素，PH8. O)中，400W、lOmin、间隔 5min，4°C超声破菌破包涵体41min。破菌完全的菌液较清，置超速冷冻离心机中20000rpm、4°C离心lOmin，融合蛋白以可溶性形式存在于上清中，将上清缓慢加入Ni2+-氮基三乙酸琼脂糖亲和层析柱，上样完毕后，杂交结合3小时，以便使融合蛋白上的6个组氨酸标签与层析柱内的Ni2+结合，用10倍体积的缓冲液A过柱，洗去未结合的杂蛋白，然后用洗脱缓冲液B (1XPBS，500mM咪唑，6M尿素，PH7. 5)将融合蛋白洗脱下来。(3) PEP-1-VP3 融合蛋白行 12%SDS_PAGE 和 Western-bloting 鉴定及进一步纯化 收集细菌裂解液和洗脱峰值的洗脱液分别行12%SDS-PAGE电泳，将电泳后的凝胶置
于考马斯亮蓝G-250液中染色。另将洗脱峰值的洗脱液行12%SDS-PAGE电泳后的凝胶在IOOmA下转膜2h后取出，在膜上加兔抗多聚组氨酸抗体(I 1000)于室温下孵育过夜，加山羊抗兔抗体(I :10000)室温下孵育2小时，然后用ECL显影。将洗脱峰值的洗脱液在4°C下依次放置在4M尿素12小时，2M尿素12小时，IXPBS 24小时(此步骤重复3次)，透析脱盐，用直径0. 22um的一次性滤器过滤透析后的蛋白，以牛血清白蛋白(lmg/ml)做对照，采用Bradford方法测定PEP-1-VP3融合蛋白的浓度，然后将PEP-1-VP3融合蛋白分装于1.5ml的eppendorf管内，置_20°C保存备用。三、结果
3. I PCR产物
从图2中可见，以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板，加入VP3上下游引物行PCR扩增，PCR产物行I. 2%普通琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见在400bp位点处出现明显的特异性366bp VP3 片段。
3. 2pET15b-PEP-l-VP3质粒双酶切鉴定结果
从图3中标识为2的电泳图中可看出，构建的pET15b-PEP-l-VP3质粒经XhoI和BamHI双酶切后可见在454bp和5700bp处有两条明显的条带，它们分别是PEP-VP3和pET15b序列。3. 3 PEP-1-VP3 融合蛋白行 12%SDS_PAGE 和 Western bloting 鉴定结果pET15b-PEPl-VP3重组质粒转化E. coli (Rosetta)，在IPTG诱导下，能稳定而高效地
表达出PEP-1-VP3融合蛋白。从图4中可看出，细菌裂解液(标识I)和洗脱峰值洗脱液(标识2)行12%SDS-PAGE检测，可见细菌裂解液中含有许多条蛋白条带，洗脱液中蛋白条带较少，但在17. 6KD处均可见PEP-1-VP3目标蛋白条带。从图5中可看出，将洗脱峰值洗脱液12%SDS-PAGE电泳后凝胶进一步行Western bloting分析，可见到有明显PEP-1-VP3目标蛋白。经检测，融合蛋白占细菌总蛋白的30%，PEP-1-VP3融合蛋白的产量为15. 66 mg/100ml菌液。四、分析讨论
VP3蛋白必须进入肿瘤细胞内才能发挥其诱导凋亡的作用，而细胞膜的生物屏障又不允许其自由进入细胞限制了这一具有潜在抗肿瘤物质的临床应用。如何对VP3分子进行改造，使其能自由进入细胞内发挥功效，具有重要的意义。蛋白质转导技术是指利用具有蛋白质转导结构域的蛋白质或多肽，将具有治疗作用的外源性蛋白导入细胞内发挥效应，这种具有穿过细胞膜能力的多肽称为细胞穿透肽，PEP-I是其中的一种，由21个氨基酸残基组成，分为三部分富含色氨酸的疏水区(KETWWETffffTEW)，连接区(SQP)和富含赖氨酸的亲水区(KKKRKV)。PEP-I做为人工合成的转导肽，具有其他转导肽所无法比拟的优势。首先，PEP-I转导肽可以将靶蛋白以一种有活性的结构形式转导入细胞内，不需要依赖于HSP90分子伴侣的重折叠作用其次，PEP-I融合蛋白具有更高的稳定性、安全性、而且不受血清的影响不易产生过敏反应等。本研究采用同源重组的方法，成功构建了原核表达质粒pET15b-PEP-1-VP3，首先我们设计合成扩增VP3片段的PCR引物，在上下游引物的5’端分别引入XhoI和BamHI的酶切位点，并且引物内还包含有与pET15b-PEP-l末端相同的序列，以便后期可以采用靶向克隆的方法，将PCR扩增出VP3片段与pET15b-PEP-l进行同源重组连接。将pET15b-PEP-l-VP3重组质粒转化到E、Coli (Rosrtta)，在IPTG诱导下，能稳定而高效地表达出PEP-1-VP3融合蛋白，因该融合蛋白大多数以包涵体的形式存在，故参照文献方法破菌破包涵体释放细菌总蛋白。在设计中，我们选用pET15b做为表达载体，主要是利用其可使表达的PEP-1-VP3融合蛋白N端特异性加上6个组氨酸残基，而6个组氨酸残基又可以与层析柱中的Ni2+进行特异性结合，从而简化了表达的PEP-1-VP3融合蛋白的分离及纯化工艺。行SDS-PAGE和Western-bloting检测结果证实，在17. 6KD处出现PEP-1-VP3目标蛋白。经检测，融合蛋白占细菌总蛋白的30%，PEP-1-VP3融合蛋白的产量为15.66 mg/100ml菌液，说明此法制备的融合蛋白效率较高。本研究成功构建了原核表达质粒pET15b-PEP-l_VP3，并较高地表达和纯化出PEP-1-VP3融合蛋白，为该蛋白的产业化发展以及下一步研究pEP-1介导VP3穿透哺乳动物细胞发挥其特异性诱导肿瘤细胞凋亡作用奠定了实验基础。
权利要求
1.pET15b-PEP-l-VP3质粒，其中以图I所示的pET15b为表达载体，PEP-1-VP3基因见序列表I中的核苷酸序列。
2.PEP-1-VP3融合蛋白，是序列表2中的氨基酸序列。
3.pET15b-PEP-l-VP3质粒的构建，其特征在于构建步骤如下 (1)PCR反应及其产物的鉴定、回收和纯化 以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板，设计合成上下游引物进行PCR扩增，扩增条件起始变性95°C lmin，然后执行如下反应条件95°C 30s, 68°C 3min，35个循环，最后68°C延伸3min，PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳后鉴定，回收并纯化366bp的VP3 cDNA片段； (2)同源重组反应 运用靶向克隆酶，将纯化后的VP3 cDNA与带有共同酶切位点及相同末端序列的线性pET15b-PEP-l进行同源重组连接； (3)转化、筛选及测序鉴定 将连接产物转化大肠杆菌DH5a，并涂布到含氨苄青霉素(100ug/ml)的琼脂TB培养基上16小时，挑选白色单菌落接种于含有氨苄青霉素(lOOug/ml) TB的培养基中培养24小时，少量提取质粒，通过Xho I和BamH I双酶切鉴定，然后将质粒测序鉴定。
4.PEP-1-VP3融合蛋白的表达及纯化 (1)PEP-1-VP3融合蛋白的表达 将pET15b-PEP-l-VP3重组质粒转化E. coli(Rosetta)，铺在含氨苄青霉素(100ug/ml)的TB培养基上16小时，挑取单个菌落至200ml含有氨苄青霉素(100ug/ml) TB培养基中37°C放大培养，当细菌生长至0D600为O. 5-1. O时加入O. 83mol/L IPTG至终浓度O. 83mol/L,置25°C诱导培养12小时，4°C 5000rpm离心5min，收集菌体，然后用PBS洗涤3次； (2)PEP-1-VP3融合蛋白的纯化 因表达的PEP-1-VP3融合蛋白主要以包涵体形式存在，故参照文献将收集的菌体溶于50ml 缓冲液 A (lXPBS，20mM 咪唑，6M 尿素，PH8. O)中，400W、lOmin、间隔 5min，4°C超声破菌破包涵体41min，破菌完全的菌液较清，置超速冷冻离心机中20000rpm、4°C离心lOmin，融合蛋白以可溶性形式存在于上清中，将上清液缓慢加入Ni2+-氮基三乙酸琼脂糖亲和层析柱，上样完毕后，杂交结合3小时，以便使融合蛋白上的6个组氨酸标签与层析柱内的Ni2+结合，用10倍体积的缓冲液A过柱，洗去未结合的杂蛋白，然后用洗脱缓冲液B (1XPBS，500mM咪唑，6M尿素，PH7. 5)将融合蛋白洗脱下来。
全文摘要
本发明提出了pET15b-PEP-1-VP3质粒及构建、PEP-1-VP3融合蛋白及表达。具体如下以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板，设计合成上下游引物进行PCR扩增，扩增条件起始变性95℃1min，然后执行如下反应条件95℃30s，68℃3min，35个循环，最后68℃延伸3min。PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳后鉴定，回收并纯化366bp的VP3cDNA片段；因表达的PEP-1-VP3融合蛋白主要以包涵体形式存在，将收集的菌体溶于50ml缓冲液A中，400W、10min、间隔5min，4℃超声破菌破包涵体41min。破菌完全的菌液较清，置超速冷冻离心机中20000rpm、4℃离心10min，融合蛋白以可溶性形式存在于上清中，将上清液缓慢加入Ni2+-氮基三乙酸琼脂糖亲和层析柱，上样完毕后，杂交结合3小时。
文档编号C07K19/00GK102618567SQ20111003089
公开日2012年8月1日 申请日期2011年1月28日 优先权日2011年1月28日
发明者石小燕, 邓守恒, 陈萍 申请人:石小燕