专利名称：一种文蛤多肽的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生化与生物医药领域，具体的说是一种文蛤多肽的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是一种发病率高、严重威胁人类健康的疾病。自20世纪中后期以来，癌 症发病率一直呈现上升的趋势。在经典的肿瘤治疗方法中，化疗药物一直发挥着重要的作 用，而且也取得了相当大的进步，但仍然存在选择性差、毒副作用大等缺点。因此，临床上迫 切需要研制与开发选择性高、特异性强、疗效确切的抗肿瘤药物。海洋覆盖着地球表面积的71%，是生命的发源地，也是潜力巨大的海洋生物资源 库。据统计，海洋的生物种数远远超过陆地，约占地球生物总数的80%，共计约30门50多 万种，这种物种多样性构成了海洋药物资源化学多样性的基础。此外，海洋环境具有高盐、 高压、低温、低光照、寡营养等不同于陆地环境的特点。为适应这种特殊的生态环境，海洋生 物不仅形态各异，而且产生了与陆地生物不同的代谢系统和机体防御系统。在其生长和代 谢过程中，产生并积累了大量结构新颖、功能独特的活性物质。因此，海洋生物的多样性、海 洋环境的独特性以及海洋生物活性物质结构的新颖性使海洋成为创新药物的丰富源泉。文蛤Meretrix meretrix Linnaeus为帘蛤科软体动物，是我国重要的海洋贝类资 源，利用文蛤治疗肿瘤在我国具有悠久的历史。《神农本草经》记载“文蛤主恶疮”，具有软 坚散结、扶正祛邪之功效，可润五肺、止消渴、开脾胃、用于肺结核、高血压、肿瘤、肾虚耳鸣 的治疗。清代汪昂的《本草备要》中也有文蛤除瘤的记载。近年来，我国学者针对文蛤进行 了一系列研究。冷波等将文蛤勻浆液经乙醇抽提、分子筛过滤层析，纯化得到一个分子量为 3147.41Da的多肽，该多肽在体外能够显著抑制胃癌细胞BGC-823的增殖。中国药科大学张 钼通过超滤、大孔吸附层析、凝胶过滤层析等方法从文蛤中纯化得到了糖肽MGP0405，其对 人鼻咽癌KB细胞有抑制作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种文蛤多肽的应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为、—种文蛤多肽的应用文蛤多肽在制备预防和/或治疗恶性肿瘤药物中的应用。所述文蛤多肽在制备预防和/或治疗人肺癌细胞、人肝癌细胞、人宫颈癌上皮细 胞、人结肠癌细胞、人乳腺癌细胞或人胰腺癌细胞药物中的应用。所述文蛤多肽通过诱导细 胞周期阻滞来抑制肿瘤细胞增殖。所述文蛤多肽通过抑制微管聚合来诱导细胞周期阻滞。所述文蛤多肽按如下步骤制备1)取新鲜文蛤体液，离心，上清进行硫酸铵分级沉淀，每次在4°C静置沉淀12小 时；2)将步骤1)中所得活性成分沉淀用水溶解，分别用50KDa和5KDa超滤膜过滤，待 用；
3)取步骤幻中分子量在5_50KDa之间的活性部分过CM-kpharosefast flow阳 离子交换柱，用分别含浓度为0M、0. 1M、0. 5M或2M的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为 0. IM NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用；所述缓冲液为0. 05M NaAc, pH5. 5缓冲液；4)将步骤幻所得活性组分过Phenyl Sepharose 6 fast flow疏水柱，用分别含 浓度为2. 5M、2M、IM或OM的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为IM NaCl的缓冲液的洗脱峰， 待用；所述缓冲液为0. 05M NaAc, pH5. 5的缓冲液；5)将步骤4)所得洗脱组分用快速蛋白液相色谱(FPLC)的ReSOurCel5Q阴离子交 换柱进行分离，洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的 100%，B液以每分钟1. 5%的速率上升，流速为lml/min，当B液占总洗脱液体积的5. 5%时 出现活性组分，即为N-末端序列为IDEI QNTGGGTNFR，其分子量为15KDa的单一组分文蛤多 肽，其中 A 液为 0. 02M Tris, ρΗ9· 0，B 液为 IM NaCl,0. 02Μ Tris, ρΗ9· 0。所述步骤1)中上清进行硫酸铵分级沉淀，即为将新鲜文蛤体液离心，收集上清 液，向上清中缓慢加入硫酸铵至30%饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵 至70%饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至95%饱和度，离心收集沉 淀。所述步骤1)中离心条件为lOOOOXg，离心20分钟。本发明所具有的优点1、海洋环境高盐、高压、低温、低光照、寡营养的特点是海洋生物产生并积累了大 量结构新颖、功能独特的活性物质。2、文蛤作为一种营养丰富的海洋贝类食品，其可预见的安全性使其具有广泛及长 期用药的潜力。3、本发明从文蛤中分离得到具有抗肿瘤作用的多肽Merel5，实验证实，该多肽在 体外能够诱导人肺癌细胞株A549发生G2/M期细胞周期阻滞，并对其他多种肿瘤细胞均有 显著的细胞毒活性。与现有的化疗药物相比，抗肿瘤多肽类药物具有分子量小、无免疫原 性、结构简单、活性高、毒副作用小、不易产生耐药性等优点。
图1为本发明实施例1制备的文蛤多肽的SDS-PAGE电泳分析图。图2为本发明实施例提供的抗肿瘤文蛤多肽对肺癌细胞A549细胞周期的影响图， 其中A.未加实施例1制备所得的文蛤多肽处理的A549细胞；Β、30 μ g/ml实施例1制备所 得的文蛤多肽处理的A549细胞；C、60 μ g/ml实施例1制备所得的文蛤多肽处理的A549细 胞。图3为本发明实施例提供的抗肿瘤文蛤多肽对肺癌细胞A549微管蛋白聚合的影 响图，其中A为未加实施例1制备所得文蛤多肽处理的A549细胞；B、30yg/ml实施例1 制备所得的文蛤多肽处理的A549细胞；C、60 μ g/ml实施例1制备所得的文蛤多肽处理的 A549细胞。
具体实施例方式实施例1文蛤体液抗肿瘤多肽的制备
(1)取新鲜文蛤，开壳收集其体液，经IOOOOXg离心20分钟，去除沉淀。按照硫酸 铵沉淀剂用量表向上清中缓慢加入已研磨成细粉末状的硫酸铵至30%饱和度，4°C静置12 小时，IOOOOXg离心20分钟，分别收集沉淀和上清，再次向上清中加入硫酸铵至70%饱和 度，4°C静置12小时，IOOOOXg离心20分钟，收集沉淀和上清，按上述方法再次向上清中加 入硫酸铵至95%饱和度，4°C静置12小时，IOOOOXg离心20分钟，收集沉淀。(2)将活性组分所在的沉淀用纯水溶解，微滤以去除不溶物，然后过5KDa和50KDa 超滤膜将其按分子量划分成三部分。(3)取分子量在5_50KDa之间的活性部分对纯水透析，然后对缓冲液充分透析， 将透析好的样品过CM-kpharose fast flow阳离子交换柱，分别用含不同浓度0M、0. 1M、 0. 5M、2M的NaCl的缓冲液洗脱。所用缓冲液为0. 05M NaAc,pH5. 5缓冲液。将各洗脱峰对 纯水透析，冷冻干燥，各取少量用适量纯水溶解，用BCA法测定蛋白浓度后，用MTT比色法 检测各组份活性，发现活性组分位于含有0. IM NaCl的洗脱液中，将活性组份置于_20°C保 存。(4)将步骤(3)中活性组分用含有2. 5M NaCl的缓冲液充分透析，将透析好的样品 过Phenyl Sepharose 6fast flow疏水柱，分别用含不同浓度2M、1M、0M的NaCl的缓冲液 洗脱。所用缓冲液为0.05M NaAc，pH5. 5缓冲液。将各洗脱峰对纯水透析，冷冻干燥，各取 少量用适量纯水溶解，用BCA法测定蛋白浓度后，用MTT比色法检测各组份活性，发现活性 组分位于含有IM NaCl的洗脱液中，将活性组份置于_20°C保存。(5)将步骤(4)中活性组分用A液溶解后，用快速蛋白液相色谱(FPLC)的 Resource 15Q阴离子交换柱进行分离，采用梯度洗脱方法进行活性组分洗脱。洗脱液为A 液和B液，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的100%，B液以每分钟1. 5%的速率上升，流 速为lml/min。将各洗脱峰对纯水透析，冷冻干燥，各取少量用适量纯水溶解，用BCA法测定 蛋白浓度后，MTT比色法检测各组份活性，发现当B液占总洗脱液体积的5. 5%时出现活性 组分，将活性组分置于_20°C保存。所用A液为0. 02M Tris, ρΗ9· 0，B液为IMNaCl,0. 02Μ Tris, ρΗ9· 0。(6)将步骤(5)中活性组分用A液溶解，经高效液相色谱(HPLC) C-18反相柱检测 纯度。洗脱液为Α液为0. l%TFA+99. 9%超纯水，B液为0. l%TFA+99. 9%乙腈，进行梯度 洗脱。起始浓度为A液90%，B液10%，B液浓度每分钟上升1 %，流速为0. 5ml/min,当B 液占总洗脱液体积的43. 5%时出现洗脱峰。洗脱峰为单一峰，说明该组分为单一组分。此 组分N-末端序列测定为IDEIQNTGGGTNFR，等电点由等电聚焦电泳测定为PI = 8. 85。(7)将此单一组分进行SDS-PAGE鉴定。取此单一组分进行电泳，用分子量范围在 14. 4-116KDa的蛋白Marker作为对照。5%的浓缩胶采用80V电压，15%的分离胶采用120V 电压。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液进行染色。6小时后，用脱色液脱色直至蛋白质条 带清晰可见。结果发现在MKDa左右有单一的蛋白条带(参见图1)。实施例2Mere 15在体外抑制肿瘤细胞增殖的检测细胞人肺癌细胞(AM9)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人宫颈癌上皮细胞(Hela)、人 结肠癌细胞(HCT-116)、人乳腺癌细胞(MCF-15)、人胰腺癌细胞(ASPC-I)。MTT法各种细胞株按照常规方法传代培养。取对数生长期的细胞，调节细胞密度至5 X IO4个/ml，按每孔180 μ 1接种于96孔细胞培养板中，于37°C，5%二氧化碳的培养 箱中培养Mh。样品为上述实施例制备所得文蛤多肽，将样品设定5个浓度梯度，即15，30， 45，60，75 μ g/ml，每个浓度设四个平行孔。阳性对照组为5-FU，阴性对照组为不含样品的 培养基。每孔各加样品或对照20 μ 1。培养48小时后，每孔各加入浓度为5mg/ml的MTT 50 μ 1，继续培养4小时，除去上清液。每孔各加入DMSO 150 μ 1，在微量震荡器上震荡15分 钟，至结晶完全溶解后，用酶标仪测定各孔在570纳米处的吸光值(0D值)。取四个平行孔 的平均OD值按公式顶％= (0D_对照-OD样品)/0D_对照X 100%计算样品对细胞增殖的抑制 率( % )，并计算其半数抑制浓度IC5。。实验结果Merel5对人肺癌细胞(AM9)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人宫颈癌上皮 细胞(Hela)、人结肠癌细胞(HCT-116)、人乳腺癌细胞(MCF-15)、人胰腺癌细胞(ASPC-I)半 数抑制浓度IC5tl参见表1。表lMerel5 对 A-549、BEL-7402、Hela、HCT-116、MCF-15、和 ASPC-1 的半数抑制浓
度 IC5O
权利要求
1.一种文蛤多肽的应用，其特征在于文蛤多肽在制备预防和/或治疗恶性肿瘤药物 中的应用。
2.按权利要求1所述的文蛤多肽的应用，其特征在于所述文蛤多肽在制备预防和/ 或治疗人肺癌细胞、人肝癌细胞、人宫颈癌上皮细胞、人结肠癌细胞、人乳腺癌细胞或人胰 腺癌细胞药物中的应用。
3.按权利要求1或2所述的文蛤多肽的应用，其特征在于所述文蛤多肽通过诱导细 胞周期阻滞来抑制肿瘤细胞增殖。
4.按权利要求1或2所述的文蛤多肽的应用，其特征在于所述文蛤多肽通过抑制微 管聚合来诱导细胞周期阻滞。
5.按权利要求1所述的文蛤多肽的应用，其特征在于1)取新鲜文蛤体液，离心，上清进行硫酸铵分级沉淀，每次在4°C静置沉淀12小时；2)将步骤1)中所得活性成分沉淀用水溶解，分别用50KDa和5KDa超滤膜过滤，待用；3)取步骤幻中分子量在5_50KDa之间的活性部分过CM-kpharosefast flow阳离 子交换柱，用分别含浓度为0M、0. 1M、0. 5M或2M的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为0. IM NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用；所述缓冲液为0. 05M NaAc, pH5. 5缓冲液；4)将步骤幻所得活性组分过WienylSepharose 6fast flow疏水柱，用分别含浓度为 2. 5M、2M、1M或OM的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为IM NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用； 所述缓冲液为0. 05MNaAc, pH5. 5的缓冲液；5)将步骤4)所得洗脱组分用快速蛋白液相色谱(FPLC)的Resource15Q阴离子交 换柱进行分离，洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的 100%，B液以每分钟1. 5%的速率上升，流速为lml/min，当B液占总洗脱液体积的5. 5%时 出现活性组分，即为N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa的单一组分文蛤多 肽，其中 A 液为 0. 02M Tris, ρΗ9· 0，B 液为 IM NaCl,0. 02Μ Tris, ρΗ9· 0。
6.按权利要求5所述的文蛤多肽的应用，其特征在于所述步骤1)中上清进行硫酸 铵分级沉淀，即为将新鲜文蛤体液离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至30%饱和 度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至70%饱和度；离心，收集上清液，向上清 中缓慢加入硫酸铵至95%饱和度，离心收集沉淀。
7.按权利要求5或6所述的文蛤多肽的应用，其特征在于所述步骤1)中离心条件为 10000 X g，离心20分钟。
全文摘要
本发明涉及生化与生物医药领域，具体的说是一种文蛤多肽的应用。文蛤多肽在制备预防和/或治疗恶性肿瘤药物中的应用。本发明从文蛤中分离得到具有抗肿瘤作用的多肽Mere15，实验证实，该多肽在体外能够诱导人肺癌细胞株A549发生G2/M期细胞周期阻滞，并对其他多种肿瘤细胞均有显著的细胞毒活性。与现有的化疗药物相比，抗肿瘤多肽类药物具有毒副作用小、不易产生耐药性等优点。
文档编号C07K14/435GK102125686SQ20111003654
公开日2011年7月20日 申请日期2011年1月31日 优先权日2011年1月31日
发明者刘明, 林秀坤, 王翠翠, 魏鉴腾 申请人:中国科学院海洋研究所