专利名称：一种抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及ー种抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体，具体涉及一种能够特异性结合并抑制Aap蛋白功能的具有抑制表皮葡萄球菌生物膜形成作用的单克隆抗体并鉴定该抗体识别的B细胞抗原表位。
背景技术：
表皮葡萄球菌是ー种导致人体生物膜感染性疾病的重要病原体，其致病力主要在于它可以在植入性医疗材料表面形成生物膜，从而使表皮葡萄球菌感染在这些植入病人体内慢性化和持续化。由于形成生物膜的表皮葡萄球菌可以抵抗多种抗生素和宿主免疫系统的清除作用，所以一旦发生表皮葡萄球菌生物膜感染，治疗的最終方法只能是摘除或更换植入性医疗材料。因此，具有抑制细菌生物膜形成作用的单克隆抗体在发挥治疗生物膜感染性疾病方面具有广泛的应用前景。研究表明，在表皮葡萄球菌形成生物膜的过程中，细菌可以通过向细胞外释放多糖、核酸、蛋白质等多种物质促使细菌间发生相互粘附聚集，从而辅助和加强细菌菌落的聚集和细菌生物膜的形成；在这些辅助细菌生物膜形成的物质当中，Aap蛋白是介导表皮葡萄球菌相互粘附聚集和生物膜形成的ー种重要细胞外蛋白；所述的Aap蛋白主要由A、B两个结构域构成，通过蛋白C端的特殊基序锚连在表皮葡萄球菌的细胞壁上发挥介导表皮葡萄球菌形成细菌生物膜的作用。现有文献证明针对Aap蛋白的动物免疫血清或抗体可明显抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成。
发明内容
本发明的目的是提供ー种抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体；具体涉及ー种能够特异性结合并抑制Aap蛋白功能的具有抑制表皮葡萄球菌生物膜形成作用的单克隆抗体并鉴定该抗体识别的B细胞抗原表位。具体而言，本发明的ー种抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体以表皮葡萄球菌聚集相关蛋白(Aap)的截短体为抗原制备而成；所述的单克隆抗体能识别位于Aap蛋白中的特异表位并抑制Aap蛋白的功能，从而发挥抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的作用。更具体的说，本发明的抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体，其特征在于，以表皮葡萄球菌Aap蛋白B结构域的蛋白截短体AapBrptl. 5(位于表皮葡萄球菌ATCC 12228株Aap蛋白氨基酸序列中第1088位至1296位)为抗原，免疫Bal b/c小鼠制备而成；经测定，所述的单克隆抗体为小鼠IgG，其针对的B细胞抗原表位位于抗原蛋白氨基酸序列的103位至122位之间，所述的抗原蛋白氨基酸序列具有序列I的结构(PGKPGVKNPDTGEVVTPPVD)。本发明中，所述的细菌是革兰氏阳性球菌，尤其涉及表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌或化脓性链球菌。 本发明中，所述的单克隆抗体通过下述技术方案制备
采用表皮葡萄球菌ATCC 12228株的基因组DNA，克隆Aap蛋白编码序列中第3262位至3888位碱基的DNA片段，并采用原核表达载体pMAL和大肠杆菌BL21 (DE3)表达所述的DNA片段所编码的蛋白AapBrptl. 5 ；
采用Ni2+亲和层祈、TEV蛋白酶水解蛋白标签、分子筛等方法对AapBrptl. 5蛋白进行纯化，制得免疫小鼠所用的抗原蛋白。本发明采用酶联免疫试验(ELISA)、蛋白免疫印迹试验(Western blot)检测AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体与表皮葡萄球菌Aap蛋白结合的亲和カ与特异性；采用微量细菌生物膜检测试验、激光共聚焦显微镜检测试验，检测AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响；同时还采用大肠杆菌表达截短AapBrptl. 5蛋白以及免疫共沉淀试验，测定AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体识别的B细胞抗原表位。如图I所示,ELISA和Western blot检测表明，所述的单克隆抗体在被稀释到lng/mL以下时,仍然能特异性结合表皮葡萄球菌Aap蛋白。如图2A和图2B所示，微量细菌生物膜检测表明，所述AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体对表皮葡萄球菌RP62A株生物膜的形成有明显的抑制作用，使得生物膜形成被抑制40%左右(如图2A所述);所述的单克隆抗体在培养基中的浓度大于I μ g/mL时能发挥抑制生物膜形成的作用，并且抑制作用随抗体浓度増大而增大；但当抗体浓度大于20μ g/mL后，抑制作用不再随抗体浓度増大而增大(如图2B所示)。如表I所示，所述的单克隆抗体除能抑制表皮葡萄球菌RP62A株生物膜形成外，还能抑制多种表皮葡萄球菌临床菌株生物膜的形成。表I AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响
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#临床菌株均来自中国上海的中山医院及瑞金医院，
*各菌株的生物膜形成能力用“++”和“+”表示，其中“++”表示生物膜形成能力较强，“+”表示生物膜形成能力较弱。如图3所示，激光共聚焦显微镜检测表明，表皮葡萄球菌RP62A株在所述的AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体存在的条件下形成的生物膜中存在大量微小孔洞，并且生物膜中的很多部位明显变薄，同时生物膜中的死亡细菌数量増大。如图4所示,大肠杆菌表达截短抗原蛋白以及免疫共沉淀试验表明，AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体结合Aap蛋白的B细胞抗原表位位于AapBrptl. 5蛋白中氨基酸序列的103位至122位之间，即位于如下序列之中PGKPGVKNPDTGEVVTPPVD。
本发明的AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体可进ー步进行人源化改造,改造后的抗体可作为抗表皮葡萄球菌的抗体药物使用；本发明的AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体针对的B细胞抗原表位多肽能用于制备抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗。本发明的抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体及其B细胞表位具有以下优点
(O所述AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体能特异性结合表皮葡萄球菌生物膜形成过程中的关键蛋白Aap，并发挥抑制生物膜形成的作用；
(2)所述AapBrptl.5蛋白单克隆抗体能较为广谱的抑制多种菌株的表皮葡萄球菌的生物膜形成；
(3)所述AapBrptl.5蛋白单克隆抗体的B细胞抗原表位为ー个线性的氨基酸序列表位，提示相应的表位多肽有可能诱导动物或人体产生与本发明单克隆抗体功能相似的具有 抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的抗体，即该抗体的表位多肽能用于制备抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗。本发明的抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体可用于制备抗革兰氏阳性球菌生物膜形成的药物，和用于制备治疗由革兰氏阳性球菌引起的疾病的药物；所述的抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体所针对的B细胞抗原表位区域可用于制备抗革兰氏阳性球菌生物膜形成疫苗。
图I是AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体同表皮葡萄球菌RP62A株以及ATCC 12228株细菌裂解液上清蛋白的Western blot,
其中，图中所示的印迹条带对应的蛋白经质谱鉴定为Aap蛋白及其蛋白水解片段。图2是AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体对表皮葡萄球菌RP62A株生物膜形成的影响， 其中，A表明以不做任何处理的细菌生物膜(RP62A)以及10 μ g/mL的正常小鼠IgG处
理(Mock)为对照，10 μ g/mL的AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体(MAb)加入培养基中同表皮葡萄球菌RP62A株共同培养14小时后，利用结晶紫染色观察发现，单克隆抗体可明显抑制细菌生物膜的形成；B表明不同浓度的AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体对表皮葡萄球菌RP62A株生物膜形成的影响。图3是激光共聚焦显微镜观察单克隆抗体对表皮葡萄球菌RP62A株生物膜形成的影响，以不做任何处理的细菌生物膜(RP62A)以及10 μ g/mL的正常小鼠IgG处理(Mock)为对照，将10 μ g/mL的AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体(MAb)加入培养基中同表皮葡萄球菌RP62A株共同培养14小时,再利用Live-Dead染色试剂盒(美国Invitrogen公司)染色后并在激光共聚焦显微镜(德国Leica公司，型号TCS SP5)下观察生物膜的三维结构，
其中，绿色荧光显示为活细菌，红色荧光显示为死细菌，深色箭头标记生物膜中存在的微小孔洞，白色箭头标记生物膜中变薄的部位。图4是AapBrptl. 5蛋白单克隆抗的B细胞抗原表位鉴定，
其中，A表明将AapBrptl. 5蛋白截短为ト160、ト102、ト53后，分别同AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体进行免疫共沉淀实验检测抗体同抗原的相互作用，初步确定抗体识别的抗原表位；B表明通过A图中的表位确定了 AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体识别抗原表位的大致区域后，再将Aapfcptl. 5蛋白截短为1-132、1-122、1-112、1-102，并分别同Aapfcptl. 5蛋白单克隆抗体进行免疫共沉淀实验检测抗体同抗原的相互作用，精确检测抗体识别的抗原表位；图中，“ IP”表示共沉样品的Western blot检测，“Mock”表示用正常小鼠IgG进行的对照共沉样品的Western blot 检测，“Input”表示共沉前单克隆抗体同各截短体混合物的Western blot 检测。
具体实施例方式下面结合实验例对本发明进一步详细描述但不限制本发明。实施例1，制备单克隆抗体
采用表皮葡萄球菌ATCC 12228株的基因组DNA，克隆Aap蛋白编码序列中第3262位至3888位碱基的DNA片段，并采用原核表达载体pMAL和大肠杆菌BL21 (DE3)表达所述的DNA片段所编码的蛋白AapBrptl. 5 ；
采用Ni2+亲和层祈、TEV蛋白酶水解蛋白标签、分子筛等方法对AapBrptl. 5蛋白进行纯化，制得免疫小鼠所用的抗原蛋白。本发明以表皮葡萄球菌Aap蛋白B结构域的蛋白截短体AapBrptl. 5(位于表皮葡萄球菌ATCC 12228株Aap蛋白氨基酸序列中第1088位至1296位)为抗原，免疫Bal b/c小鼠制得单克隆抗体，測定结果显示，所述的单克隆抗体为小鼠IgG，其针对的B细胞抗原表位位于抗原蛋白氨基酸序列的103位至122位之间，所述的抗原蛋白氨基酸序列具有序列 I 的结构(PGKPGVKNPDTGEVVTPPVD)。实施例2利用酶联免疫试验(ELISA)和蛋白免疫印迹(Western blot)试验检测AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体对AapBprtl. 5及Aap蛋白的结合亲和力和识别特异性
ELISA检测单克隆抗体对AapBprtl. 5蛋白的结合亲和力的实验方法如下
将储存液浓度为0. 4 mg/mL的单克隆抗体系列稀释(起始稀释浓度为1:10000，每次稀释一倍)，然后分别加入包被好AapBrptl. 5蛋白的96孔酶标板中37° C孵育I小时。经过反复洗板后再加入HRP标记的羊抗小鼠ニ抗37° C孵育I小时。反复洗板后加入显色底物孵育显色并終止反应后，读取各孔在450 nm和630 nm处的吸光值。区分阴性和阳性读数的Cut-off值定为0. 20 (A450/A630)。终点稀释度的选取定为当A450/A630数值正好大于
0.20时的抗体稀释度。ELISA结果如下表
表2
杭体稀释度 Ι0Κ 丨20K [40K I80K I160K ]320Κ 640Κ [1280Κ 1°° *
Α450/Α630 12. 79]2. 505 [2· 108 lj. 49 10. 914 ]θ. 526 Jo. 309 [o. 203 10. 074
*表示单克隆抗体被无限稀释，即未加入单克隆抗体的阴性对照。结果说明，AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体的ELISA效价大于1:1280000/0. 4 mg/mL,该单克隆抗体对AapBrptl. 5蛋白具有较高的亲和力。Western blot检测AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体对Aap蛋白的识别特异性实验方法如下
I.将2mL过夜生长的表皮葡萄球菌RP62A株及ATCC 12228株细菌离心收集并重悬后，加入溶葡萄球菌酶IOyg在37° C处理半小吋。20000g高速离心后取上清蛋白行7%SDS-PAGE电泳。电泳后将凝胶中的蛋白电转运至0. 45 μ m的PVDF膜上。在4° C中将转有蛋白的PVDF膜置于5%的脱脂牛奶中封闭过夜。
2.利用5%的脱脂牛奶将储存液浓度为O. 4 mg/mL的AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体稀释至I ng/mL后，与转有蛋白的PVDF膜于室温孵育2小吋。反复洗膜后再将膜与HRP标记的羊抗小鼠ニ抗室温孵育I小吋。反复洗膜后将膜至于ECL底物中反应，并将蛋白印迹情况反映在X光片上。3.将位于PAGE胶中对应于Western blot中出现的印迹条带相对应的蛋白条带挖出，并对胶中的蛋白进行质谱分析。如图I所示,结果表明，所述的AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体在被稀释到Ing/mL以下时，仍然可以结合表皮葡萄球菌Aap蛋白，并且结合特异性较高。实施例3 Aap蛋白单克隆抗体抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成
采用微量细菌生物膜检测试验(96孔板生物膜形成试验)，将表皮葡萄球菌生物膜形成阳性株RP62A、1457、C408、C328、C847分别与单克隆抗体混合(终浓度10 μ g/mL)，接种于96孔板上，4° C孵育2小时后37° C培养14小吋。细菌在孔内形成的生物膜采用结晶紫染 色法检测，结晶紫染色水洗后，根据A570读数判断细菌生物膜形成的強弱。实验方法如下I.表皮葡萄球菌接种于新鲜的TSB培养基中，37° C培养过夜。2.细菌1:200用新鲜的TSB培养基稀释接种于96孔板，每孔200 μ I。加入Aap蛋白单克隆抗体(终浓度为10yg/mL)，4° C孵育2小时后37° C静置培养14小时，每个样品采用三复孔上样。因单克隆抗体属于小鼠IgG，因此设置相同浓度的正常小鼠IgG处理表皮葡萄球菌生物膜为阴性对照。3.弃菌液，用PBS洗板3次，晾干，每孔加200 μ L 2%结晶紫室温染色5分钟。4.弃染液，用水洗板，将板晾干,酶标仪Α570读数，每个样品读数取三复孔的均值。5.应用如下公式计算AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体对表皮葡萄球菌生物膜形成的抑制率
阴性对照Α570均值ー样品Α570均值
_ X100%
阴性对照Α570均值
如表I所示，结果表明，所述的AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体在体外能明显抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，与加入正常小鼠IgG的阴性对照相比，能显著降低表皮葡萄球菌生物膜的形成。实施例4表皮葡萄球菌在Aap蛋白单克隆抗体存在的条件下形成的生物膜结构的改变
采用激光共聚焦显微镜观察在AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体存在的条件下表皮葡萄球菌形成生物膜的结构。将表皮葡萄球菌RP62A株与AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体混合(终浓度10 μ g/mL)后接种于FluoroDishes中，4° C孵育2小时后37° C静置培养14小时，细菌在Dish底部形成的生物膜用Live-Dead染色试剂盒染色,并将Dish中的生物膜至于激光共聚焦显微镜下观察。实验方法如下
I.表皮葡萄球菌RP62A接种于新鲜的TSB培养基中，37° C培养过夜。2.细菌用新鲜的TSB培养基1:200稀释接种于FluoroDishes中，每Dish2 mL。加入AapBrptl.5蛋白单克隆抗体(终浓度为lOyg/mL)，" C孵育2小时后37° C静置培养14小吋。因单克隆抗体属于小鼠IgG，因此设置相同浓度的正常小鼠IgG处理表皮葡萄球菌生物膜为阴性对照，同时设置未处理生物膜对照。3.弃菌液，用PBS洗板3次，加入Live-Dead染色液(含有SYT09和PI各I μ Μ)染色15分钟。4.将Dish置于Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜下，用63倍物镜予以观察，并拍摄轴距0.5 μ m步进的生物膜断层扫描照片。利用Imaris软件处理生物膜的激光共聚焦数据，并得到三维重建的生物膜立体结构。如图3所述，结果表明，相比未处理生物膜和阴性对照生物膜的三维结构，表皮葡萄球菌RP62A株在该单克隆抗体存在的条件下形成的生物膜中存在大量微小孔洞，并且生物膜中的很多部位明显变薄，同时生物膜中的死亡细菌数量增多。实施例5利用大肠杆菌表达截短抗原蛋白以及免疫共沉淀測定单克隆抗体识别的B细胞抗原表位
利用大肠杆菌表达AapBrptl. 5蛋白截短体，并运用免疫共沉淀測定单克隆抗体同各截短蛋白之间的相互作用情况测定AapBrptI. 5蛋白单克隆抗体识别的B细胞抗原表位。试验方法如下
I.将AapBrptl.5蛋白的编码DNA片段PCR扩增并插入带有GBl-His-tag的蛋白表达载体pETMG中，构建表达GBl-His-AapBrptl. 5 (GB-Aap)融合蛋白的载体pETMG-AapBrp11. 5。2.以pETMG-Aapfcpt 1. 5质粒中GB-Aap的DNA编码区为模板，设计弓I物PCR扩增GB-Aap蛋白的C末端系列蛋白截短体编码DNA片段(毎次截短约150个碱基)，并插入蛋白表达载体pET28a中用以在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达下列蛋白截短体GB_Aap FL, GB-Aap
aa 1-160 GB-Aap aa:1-102 GB-Aap aa:卜53。3.利用Ni2+亲和层析纯化上述大肠杆菌表达的截短蛋白。将纯化所得的蛋白20yg与IOyg Aap蛋白单克隆抗体在共沉淀缓冲液(20 mMTris-HCl (pH 8.0), 137mMNaCl, I mM EDTA, 1% (vol/vol) Triton X-100 )中 4。C 混合孵育 I 小时，然后加入protein G-coupled Sepharose树脂50 μ L继续在4° C混合孵育I小时。在利用共沉淀缓冲液反复洗涤树脂后，将树脂在2Χ上样缓冲液中煮沸5分钟，并进行15% SDS-PAGE电泳。将PAGE凝胶上的蛋白电转运至0. 22 μ m的PVDF膜上之后，将膜至于5%的脱脂牛奶中4° C封闭过夜。再用小鼠抗His-tag抗体检测相应的蛋白截短体是否结合了 AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体并由该抗体介导结合于protein G-coupled Sepharose上。4.初步确定了 AapBrptl. 5蛋白单克隆抗体B细胞抗原表位位于AapBrptl. 5蛋白中的大致位置之后，再次利用pETMG-AapBrptL 5质粒中GB-Aap的DNA编码区为模板，设计引物PCR扩增GB-Aap蛋白的C末端系列蛋白截短体编码DNA片段(毎次截短约30个碱基)，并插入蛋白表达载体pET28a中用以在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达更为精确的蛋白截短体(GB-Aap aa: 1-132，GB-Aap aa: 1-122，GB-Aap aa: 1-112,GB-Aap aa: 1-102),并用免疫共沉淀精确确定单克隆抗体的B细胞抗原表位。
如图4所示,结果表明，所述的AapBrptL 5蛋白单克隆抗体结合与AapBrptL 5蛋白的B细胞抗原表位位于蛋白氨基酸序列的103位至122位之间，具有如SEQ ID NO I所示的氨基酸序列。
权利要求
1.ー种抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体，其特征在干，以表皮葡萄球菌聚集相关蛋白Aap的截短体为抗原,免疫Bal b/c小鼠制成。
2.按权利要求I所述的抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体，其特征在于，所述的抗原为表皮葡萄球菌Aap蛋白B结构域的蛋白截短体AapBrptl. 5，其位于表皮葡萄球菌ATCC12228株Aap蛋白氨基酸序列中第1088位至1296位。
3.—种权利要求I的抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体针对的B细胞表位，其特征在于，所述的B细胞抗原表位位于抗原蛋白氨基酸序列的103位至122位之间。
4.按权利要求3所述的抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体针对的B细胞表位，其特征在于，所述的抗原蛋白氨基酸序列具有序列I的结构。
5.按权利要求I所述的抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体，其特征在于，所述的细菌是革兰氏阳性球菌。
6.按权利要求5所述的抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体，其特征在于，所述的细菌是表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌或化脓性链球菌。
7.权利要求I所述的抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体在制备抗革兰氏阳性球菌生物膜形成的药物中的用途。
8.权利要求I所述的抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体在制备治疗由革兰氏阳性球菌引起的疾病的药物中应用。
9.权利要求3的抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体针对的B细胞表位区域在制备抗革兰氏阳性球菌生物膜形成的疫苗中的用途。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种抑制细菌生物膜形成的单克隆抗体及其针对的B细胞表位；本发明的单克隆抗体以表皮葡萄球菌聚集Aap蛋白B结构域的蛋白截短体AapBrpt1.5为抗原，免疫Balb/c小鼠制成；所述的单克隆抗体能识别位于Aap蛋白中的特异表位并抑制Aap蛋白的功能，从而发挥抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的作用。本发明的单克隆抗体可用于制备治疗由革兰氏阳性球菌引起的生物膜相关疾病的药物，所述单克隆抗体针对的B细胞抗原表位多肽可用于制备抗革兰氏阳性球菌生物膜形成的疫苗。
文档编号C07K7/08GK102649817SQ201110044708
公开日2012年8月29日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者瞿涤, 胡健 申请人:复旦大学