紫贻贝Hydramacin-1基因及其重组蛋白和制备方法

专利名称：紫贻贝Hydramacin-1基因及其重组蛋白和制备方法
技术领域：
本发明涉及克隆基因和抗菌肽，具体涉及紫贻贝Hydramacin-1基因及其重组蛋白和制备方法。
背景技术：
抗菌肽是一类广泛存在于整个生物界中的双亲性小分子碱性多肽，是机体先天免疫的关键因子。根据抗菌肽的序列、二级结构和抗菌特性等，将已发现的抗菌肽分为三大类(1)不含半胱氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素、马盖宁等；( 具有半胱氨酸的环型抗菌肽，如防御素，抗真菌肽等；C3)富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等。此外，近年来发现某些抗菌肽可由前体大分子酶解产生，如淡水螯虾(Pacifastacus leniusculus)的血蓝蛋白C-端酶解后可产生具有抗菌活性的多肽。抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生抗性，并且抗菌肽对真核细胞几乎没有毒副作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，而且也作用于真菌、原虫、某些病毒和肿瘤细胞，同时，还能加速免疫和伤口愈合过程。由于病原菌对抗生素逐步产生抗药性，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。 软体动物抗菌肽的研究始于1996年，Charlet等从贻贝(Mytilusedulis)中分离到了富含半胱氨酸的贻贝素(mytilin，具有8个保守的半胱氨酸残基)和贻贝霉素(mytimicin，具有12个半胱氨酸)，序列比对表明与昆虫抗菌肽有较高的相似性。Hubert从贻贝(Mytilus galloprovincialis)中纯化到含4对二硫键的MGDl (含有38个氨基酸残基，含有2个半胱氨酸)，其具有广谱的抗G+和G—活性。

发明内容
本发明从紫贻贝中克隆得到如序列表SEQ ID NO. 1所示的Hydramacin-I基因，该克隆基因的表达得到如序列表SEQ ID NO. 2所示的重组蛋白，该重组蛋白为新的紫贻贝抗菌肽，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌等具有抗菌效果。本发明还提供了紫贻贝Hydramacin-1基因和重组蛋白的制备方法，该制备方法能得到纯度较高的紫贻贝抗菌肽，紫贻贝抗菌肽具有开发抗菌药物应用的前景。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种紫贻贝Hydramacin-I基因，为克隆基因，该Hydramacin-I基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示；该克隆基因表达的重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0. 2所示，该重组蛋白即为紫贻贝抗菌肽，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌等具有抗菌效果。紫贻贝抗菌肽的制备方法，包括下述步骤1)总RNA提取用Trizol试剂从感染鳗弧菌的紫贻贝的血淋巴中提取总RNA，得到RNA，存于_80°C备用；提取方法依hvitrogen公司的Trizol试剂说明书进行；
2)mRNA纯化用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA ；纯化方法依据QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行；3) cDNA模板溶液制备用cDNA Synthesis Kit试剂盒(购于Mratagene公司)将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作方法依试剂盒说明书进行包括双链cDNA经末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Β ο I内切酶酶切等，用QIAEX IIAgarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒(购于QIAGEN公司)对大于IOObp的酶切片段进行回收， 回收的酶切片段与Uni-ZAP XRvector载体(购于hvetrogen公司)连接，得到是cDNA质粒，用 ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit 试剂盒(购于 Mratagene 公司)对 cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入体积百分终浓度为7%的二甲基亚砜(DMSO)，得到含抗菌肽基因的cDNA模板溶液，存于_80°C ；具体包装、测定和扩增方法依试剂盒说明书进行；4)抗菌肽基因筛选紫贻贝cDNA文库EST序列的大规模测定从已构建文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3在MegaBACElOOO测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*. abi, *· abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*. seq)和质量文件(*. seq. qual)， 依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13 (准确率大于95% ) 且长度大于IOObp的序列作为EST数据。紫贻贝EST序列的同源性分析及Hydramacin-1基因片段的筛选将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获的Contigs与 Singletons在数据库中进行BLAST分析，根据相似性分析结果寻找出与Hydramacin-I基因同源的EST序列。5)基因克隆紫贻贝Hydramacin-I基因cDNA全长序列的获得采用cDNA末端快速扩增技术 (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)，根据已经获得的目的基因的部分片段设计基因特异性引物 Pl (5 ‘ GTGGGATTCT ATTGGGTTTG 3')禾口 P2(5' GAAGCGAATG TGATTGGTGA 3')，以接头通用引物Adapter dT在M-MLV反转录酶的作用下引导反转录合成cDNA。用接头通用引物Universal primer分别和基因特异性引物进行Nested-PCR，扩增基因3 ‘末端。PCR产物用胶回收试剂盒(购于上海中科开瑞生物芯片公司)进行回收和纯化得到PCR 纯化产物，将所述PCR纯化产物与pMD-18T载体(购于大连宝生生物工程有限公司)连接， 连接产物转化E. coli ToplO感受态细胞(购于北京全氏金生物技术有限公司)中，阳性转化子经PCR筛选后测序，序列拼接得到全长cDNA序列的克隆质粒，即为抗菌肽基因的克隆质粒；3 ’ RACE所用反应体系及条件一扩体系IOXPCR Buffer 2. 5 μ LMgCl2(25mM)1. 2μ LdNTP (2. 5mM)2. O μ LUniversal primer 0. 5 μ L
水 17. 05 μ LcDNA (模板) 1 μ LTaq0. 25μ LPl (引物) 0. 5μ L条件首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性45秒，60°C至56°C每循环降低0. 5°C，退火30秒，72°C延伸1分钟，共进行10个循环，再进入下列循环94°C变性45秒，56 °C退火1分钟，72 °C延伸1分钟，共进行20个循环，最后72°C延伸10分钟二扩体系IOXBuffer 2. 5 μ LMgCl2(25mM) 1. 2μ LdNTP (2. 5mM) 2. 0 μ LUniversal primer 0. 5 μ L/K17. 05 μ LTaq0. 25 μ LP20· 5 μ L稀释后的一扩产物 IyL条件首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性30秒，56°C退火45 秒，72 °C延伸1分钟，共进行30个循环，最后72°C延伸10分钟。)上述PCR buffer溶液、dNTP、PCR水、iTaq DNA聚合酶均购自Promega公司，通用引物购自上海生工科技有限公司。6)重组质粒构建对抗菌肽基因的克隆质粒进行扩增反应，扩增反应正向引物为含有Nde I酶切位点的核苷酸序列(5，-CATATGAATG TGATTGGTGA TTGCTG-3，，其中划线上的序列表示Nde I酶切位点)，反向引物为含Β ο I酶切位点和6个His纯化标签的 5，-CTCGAGTTA |G TGGTGGTGGT GGTGGTC^ AAA ACCGCACCAC CATG-3，，其中下划线为Bio I酶切位点，方框为His纯化标签)核苷酸序；将扩增片段纯化回收，导入PMD18-T simple (购于大连宝生生物工程有限公司)载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌T0P10感受态细胞(购于北京全式金生物技术有限公司)中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nde I和B10 I (均购于NEB公司)双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生生物工程有限公司)对酶切产生的目的片段纯化回收，得到编码重组蛋白的抗菌肽重组基因，测序该抗菌肽重组基因，该抗菌肽重组基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1 所示，将该抗菌肽重组基因导入经同样双酶切的表达载体pET_21a(购于Novagen公司)，得到重组质粒；重组质粒构建具体依《分子克隆第三版》操作方法扩增反应条件为首先94°C 预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共进行 30个循环，最后72°C延伸10分钟；7)抗菌肽重组基因表达将上述重组质粒转入表达宿主菌BL21 (DE3) -plysS (购于北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性重组质粒，测序确认，挑取单克隆重组质粒，将单克隆重组质粒接种于200ml Super Optimal Broth (S0B，购于上海生工科技有限公司)培养基中，接种浓度为220rpm，37°C培养至0D600 = 0. 5-0. 7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使终浓度达到lmmol/ml，继续培养汕，4°C，5000rpm,离心lOmin，收集菌液；
8)重组蛋白纯化对上述菌液超声破碎、离心、提取、GE的HisTrap螯合柱层析纯化、洗脱，得到重组蛋白，即本发明的紫贻贝抗菌肽，经测序，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，具体纯化方法依蛋白纯化试剂盒的说明书操作。本发明的引物由上海生工科技有限公司合成。与现有技术相比，本发明的优点在于从紫贻贝中克隆得到如序列表SEQ ID NO. 1 所示的Hydramacin-I基因，该克隆基因的表达得到如序列表SEQ ID NO. 2所示的重组蛋白，该重组蛋白为新的紫贻贝抗菌肽，对海洋来源的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有很强的抑制活性，具有开发为广谱抗菌类药物、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值；该紫贻贝克隆基因和重组蛋白的制备方法，通过总RNA提取、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、抗菌肽基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤，能得到纯度较高的重组的紫贻贝抗菌肽。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例紫贻贝抗菌肽的制备一、用Trizol试剂从感染鳗弧菌的紫贻贝的血淋巴中提取总RNA，得到总RNA， 提取方法依^witrogen公司的Trizol试剂说明书进行取紫贻贝血细胞50ml，2000g离心lOmin，弃上清，向沉淀细胞中加入20ml的TRIZOL (Invitrogen)中，用高速分散器将细胞分散，室温下剧烈震荡10秒；加入細1氯仿，剧烈震荡30秒；4°C 10，OOOg高速离心IOmin ；吸取上清液于一个新离心管中，加入冰浴过的等体积异丙醇(约15ml)，置于-20°C静置1小时以上；4°C 10，OOOg高速离心10分钟；小心弃去上清液；用5ml 70% 的乙醇清洗沉淀；4°C 10，OOOg高速离心10分钟，小心弃去上清液；真空干燥5分钟，用约 600 μ lRNase-free water溶解RNA，待完全溶解后储存于_80°C备用。二、用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA，具体纯化方法依QIAGENE公司的01 igotex mRNA纯化试剂盒说明书进行包括在37 V水浴加热 OligotexSuspension,震荡混勻，室温放置；70°C水浴加热OEB Buffe ；向500 μ 1总RNA溶液(RNA含量约为 2mg)中加入650 μ 1 of OBB buffer, 135 μ 1 of Oligotex Suspension, 650 μ 1 ofRNase-free water，70°C加热体系3分钟；取出反应体系后，室温下放置10分钟， 15，OOOg离心2分钟，小心吸走上清液，用600 μ 1 0W2重悬Oligotex-mRNA沉淀，剧烈震荡。 然后将悬浊液移入放在1. 5ml离心管中的spin column内，15，000g离心1分钟，将spin column转移到一个新的1. 5ml离心管中，加入600 μ 1 0W2，15，000g离心1分钟，将进入离心管的液体丢弃，将spin column转移到另一新的1. 5ml离心管中；向spin column中加入 50 μ 1已经加热到700C的OEB buffer,轻轻混勻，15，OOOg离心1分钟；向spin column再加入50 μ 1 OEBbuffer,混勻后15，OOOg离心1分钟；回收离心管中的mRNA溶液约100 μ 1。三、用cDNA Synthesis Kit试剂盒将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作依试剂盒说明书进行包括双链cDNA经末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、 Xho I内切酶酶切等，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒对大于IOObp 的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体连接，得到cDNA质粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒对cDNA质粒进行噬菌体包装、 滴度测定和噬菌体文库扩增，具体方法参照说明书进行，扩增后的文库加入终浓度为7%的 DMSO溶液，得到cDNA模板溶液，存于_80°C备用。第一链cDNA合成在RNase-free的200 μ 1离心管中依次需用试剂混勻，然后加入30μ 1 poly (A)引物+RNA (5 μ g)，混勻，室温下放置10分钟后，向体系中加入1.5μ 1的一链合成酶MratMcript RT (50U/ μ 1)，终体积达到50 μ 1，轻轻混勻反应体系，离心数秒， 42°C温育1小时。二链合成在冰上依次向含有一链cDNA的离心管中加入需用反应物反应，再向反应体系中加入 2μ 1 RNase Η(1· 5U/μ 1)，11 μ 1 DNA polymerase 1(9. OU/μ 1), 轻轻混勻反应体系，离心数秒，16°C放置2. 5小时后立即将反应体系置于冰上。补平cDNA末端向二链合成体系中加入需用反应物，快速震荡反应体系离心后，于72°C反应30分钟；加入200 μ 1酚-氯仿[1 1 (ν/ν)]，震荡混勻体系，室温下高速离心2分钟，转移上清至新的离心管中；加入等体积的氯仿，震荡混勻，室温下高速离心2分钟，然后转移上清至新管中； 加入下列试剂使cDNA沉淀，并震荡体系20μ 1 3Μ sodium acetate, 400 μ 1 100% (ν/ν) ethanol, _20°C沉淀过夜；4°C高速离心60分钟，小心弃去上清，保留沉淀；加入500 μ 1的 70%乙醇轻轻洗涤沉淀，室温高速离心2分钟；轻轻吸去乙醇，在真空离心机中干燥沉淀； 用9 μ 1含有EcoR I adapters的溶液溶解沉淀并于4°C放置至少30分钟。EcoR I接头的连接向体系中加入下列成分1 μ 1 IOXligase buffer, 1 μ 1 IOmM rATP, 1 μ 1 T4DNA ligaseGU/μ 1)，离心后8°C放置过夜；70°C 30分钟灭活连接酶。磷酸化EcoRI末端离心反应物2秒，室温放置5分钟冷却，加入下列反应物用于磷酸化接头1 μ IlOXligase buffer,2 μ 1 IOmM rATP,5 μ 1 sterile water,2 μ 1 T4polynucleotide kinase (5U/μ 1), 37°C温育30分钟，70°C 30分钟灭活激酶，离心2秒后室温放置5分钟冷却。Bio I内切酶酶切向体系中加入下列成分 μ 1 Xho I buffer supplement, 3 μ 1 Xho I (40U/ μ 1), 37°C温育1. 5小时，加入125 μ 1的100% (ν/ν)乙醇，_20°C放置过夜，4°C离心60分钟，弃去上清，完全干燥沉淀，用50 μ 1 ddH20溶解沉淀。cDNA片段回收方法从浓度为1. 0%的琼脂糖凝胶上将DNA带切下，将大约250mg 的胶块放入1. 5ml离心管中，加入相当于3倍胶块体积的Buffer QXlJf QIAEX II剧烈震荡30秒，充分混勻，向含有胶块的Buffer QXl中加入60 μ 1 QIAEX II，50°C加热10分钟， 溶解胶块；每2分钟震荡一次，保持溶液始终为黄色；13，OOOrpm离心30秒，小心吸去上清液；用500 μ 1 Buffer QXl清洗沉淀，重悬沉淀，13，OOOrpm离心30秒并小心吸去上清液； 用500 μ 1 PE Buffer清洗沉淀2次，重悬沉淀，13，OOOrpm离心30秒，弃上清液，真空干燥 15分钟至沉淀变白，加入20 μ 1 ρΗ8. 5的IOmM Tris-Cl溶液室温下溶解5分钟。cDNA 与载体(Uni-ZAP XR vector, Invetrogen)连接在另一干净的 200 μ 1 离心管中依次加入下列试剂2· 5μ 1 resuspended cDNA( > 100ng) ,0. 5μ 1 IOXligase buffer,0. 5 μ 1 IOmM rATP(pH7. 5),1. 0 μ 1 Uni-ZAP XR vector (1 μ g),0.5 μ 1 T4DNA ligase (4U/ μ 1)。12°C放置过夜。噬菌体文库的包装从-80°C冰箱中取出包装蛋白，迅速用手握住融化，立即加入 4 μ 1重组cDNA,用微量移液器吸头混勻体系(不要产生气泡)，离心5秒，室温(22°C )温育2小时，加入500 μ 1的SM buffer和20 μ 1氯仿，轻轻混勻反应体系。快速离心数秒，沉淀蛋白碎片，转移上清至新管中。
包装反应的滴度测定在含有氨苄青霉素的LB固体培养基(1升培养基含有氯化钠10g，胰蛋白胨log，酵母提取物5g，琼脂粉15g，pH7. 5)上将菌株XLl-Blue MRF，划线培养，37°C过夜培养；用LB液体培养基(1升培养基含有氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，pH7. 5)培养单克隆菌落，30°C，200rpm摇床培养过夜；4°C，IOOOg下离心10分钟沉淀细菌。用25ml IOmM MgSO4重悬细菌；用IOmM MgSO4重悬XLl-BlueMRF’细胞，使浓度达到 0D600 = 0. 5 ；将包装产物按下列比例与宿主菌混合(1) 1 μ 1包装产物+200 μ 1 XLl-Blue MRF，(OD600 = 0 . 5) ； (2)0. 1 μ 1 包装产物 +200 μ IXLl-Blue MRF，(OD600 = 0 . 5)；将混合体系置于37°C温育15分钟使噬菌体充分附着在宿主细胞表面；加入3ml融化状态下约48°C 的NYZ上层培养基(1升培养基含有氯化钠5g，MgSO4 · 7H20 2g，NZ胺10g，酵母提取物5g， 琼脂糖7g，pH7. 5)；迅速铺在干燥预热过的NYZ琼脂培养基(1升培养基含有氯化钠5g， MgSO4 · 7H20 2g，NZ胺10g，酵母提取物5g，琼脂粉15g，ρΗ7· 5)上，静置10分钟后，倒置于 37°C过夜培养；8小时后可见噬菌斑；分别计数两个平板的噬菌斑数目，计算其滴度(每毫升生长的噬菌斑数目，pfu/ml)。30°C 200rpm条件下，用LB液体培养基过夜培养XLl-Blue MRF，细胞50ml ； IOOOg 离心宿主细胞10分钟；用25ml IOmM MgSO4重悬细胞，测定600纳米可见光下菌液吸光度， 然后用IOmM MgS04将菌液稀释至浓度为0D600 = 0.5;将含有大约5X104pf·u噬菌体颗粒的悬浊液与600 μ 1浓度为0D600 = 0. 5的XLl-Blue MRF’细胞混合，置于Falcon 2059聚丙烯管中，37°C温育混合液15分钟，使噬菌体充分附着在宿主菌表面；将混合液加入约48°C的
6.5ml液态NZY上层培养基中，混勻后倒入新鲜的150mmNZY琼脂糖培养基平板上，静置平板10分钟，倒转平板置于37°C约8小时(噬菌斑直径不超过2mm)；在每块平板上倒入大约 10ml SM 缓冲液(1 升缓冲液中含有 5. 8g NaCl, 2. 0gMgS04 ·7Η20，50. 0ml IM Tris-HCl [ρΗ
7.5], 5. 0ml 2% [w/v]白明胶)，4°C放置过夜；将所有平板上的SM缓冲液回收入新的聚丙烯管中，每块平板再用anl SM缓冲液清洗一次并回收上清液；向回收液中加入终浓度为 5% (ν/ν)的氯仿，室温下放置15分钟，混勻，500g离心10分钟去除细胞碎片，将上清液转移至新聚丙烯管中，并重复步骤8、9至上清液澄清，加入终浓度为7% (v/v)DMS0，储存于-80°C。测定扩增文库滴度(方法同前)。四、cDNA模板溶液中抗菌肽基因的确认用Exassist Helper Phage和SOLR菌株均购于Mratagene公司)从Uni- ZAP XR Vector上体外切割pBluescript噬菌粒(进行体外切割；然后质粒cDNA的大规模提取和测序分析获得目的EST序列，对上述EST测序结果，用BLASTn和BLASTx程序分析，根据相似性分析结果寻找出抗菌肽基因片段。五、对上述含抗菌肽基因的cDNA模板溶液进行巢式PCR扩增得到PCR产物，PCR 扩增的特异性引物Pl的核苷酸序列为5’-GTGGGATTCT ATTGGGTTTG-3’，特异性引物P2的核苷酸序列为5’ -GAAGCGAATG TGATTGGTGA-3’，PCR产物用胶回收试剂盒进行回收和纯化得到PCR纯化产物，将所述PCR纯化产物与pMD-18T载体连接得到克隆质粒，克隆质粒转入大肠杆菌T0P10F感受态细胞中，挑选阳性转化子经PCR筛选后测序，序列拼接得到抗菌肽 Hydramacin-I基因的全长cDNA序列；阳性克隆质粒提取，得到Hydramacin-1基因的克隆质粒；3 ’端PCR扩增一扩的反应体系和反应条件为10XPCRbuffer溶液2. 5μ 1、摩尔浓度为25mM的MgCl2溶液 1. 2 μ 1、摩尔浓度为2. 5mM的dNTP溶液2. 0 μ 1、摩尔浓度为IOpmol/ μ 1的特异性引物Pl溶液0.5 μ 1、摩尔浓度为lOpmol/μ 1的通用引物溶液0. 5 μ 1、浓度为5U/μ 1 WhqDNA polymerase 0. 25μ 1, cDNA模板(文库)溶液1 μ 1，用PCR水定容到25 μ 1 ；反应在ABI Veriti PCR仪中进行，反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性45秒，60°C至56°C每循环降低0. 5°C，退火30秒，72°C延伸1分钟，共进行10个循环， 再进入下列循环94°C变性45秒，56°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，共进行20个循环， 最后72°C延伸10分钟；3，端PCR扩增二扩反应体系和反应条件为10XPCR buffer溶液 2. 5 μ 1、摩尔浓度为25mM的MgCl2溶液1. 2 μ 1、摩尔浓度为2. 5mM的dNTP溶液2. 0 μ 1、摩尔浓度为lOpmol/μ 1的特异性引物Ρ2溶液0. 5 μ 1、摩尔浓度为lOpmol/μ 1的通用引物溶液 0. 5 μ 1、浓度为 5υ/μ 1 的 Taq DNA polymerase 0. 25 μ 1，模板溶液 1 μ 1，用 PCR 水定容到25 μ 1，反应在ABIVeriti PCR仪中进行，反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性30秒，56°C退火45秒，72°C延伸1分钟，共进行30个循环，最后72°C 延伸10分钟。六、对抗菌肽基因的克隆质粒再进行扩增反应，(扩增反应正向引物为含有Nde I 酶切位点的核苷酸序列5’ -CATATGAATGTGATTGGTGA TTGCTG-3’，反向引物为含Β ο I酶切位点和6个His纯化标签的核苷酸序列5’ -CTCGAGTTA G TGGTGGTGGT GGTGGTG AAA ACCGCACCAC CATG-3’)；将扩增片段纯化回收，导入pMD18_T载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌T0P10F、感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nde I和)(h0 I双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒对酶切产生的目的片段纯化回收，得到编码重组蛋白的抗菌肽重组基因，测序该抗菌肽重组基因，该抗菌肽重组基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，将该抗菌肽重组基因导入经同样双酶切的表达载体pET-21a，得到重组质粒；重组质粒构建具体依《分子克隆第三版》操作方法扩增反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共进行30 个循环，最后72°C延伸10分钟。七、将上述重组质粒转入表达宿主菌BL21_plysS中，筛选阳性重组质粒，测序确认，挑取单克隆重组质粒，将单克隆重组质粒接种于200ml Super Optimal Broth培养基中，接种浓度为220rpm，37°C培养至OD600 = 0. 5-0. 7，加入IPTG，使终浓度达到lmmol/ml, 继续培养汕，40C，5000rpm,离心lOmin，收集菌液。八、对上述菌液超声破碎、离心、提取、GE的HisTrap螯合柱层析纯化、洗脱，得到重组蛋白，即本发明的紫贻贝抗菌肽，经测序，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0. 2所示；在收集的菌体沉淀，加入适量的菌体裂解液(0.5M NaCl，5mM咪唑，IOmM Tris-HCl pH 8. 0，lmg/ml溶菌酶)重悬沉淀，向体系中加入lmg/ml的溶菌酶，室温放置半小时；超声波处理，条件为20W，处理60次，每次2秒，间隔14秒；用15%的SDS-PAGE分离胶电泳分析(Laemmli，1970)上清和沉淀，Coomassie brilliant blueR-250后用凝胶成像系统照相。应用例将紫贻贝抗菌肽加入试管中制成浓度为2. 2mg/ml抗菌肽液共9管，分别接种产气肠杆菌，奇异变形杆菌，枯草芽孢杆菌，滕黄微球菌，海洋真菌链孢粘帚菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌，恶臭假单胞菌以及鳗弧菌各5 μ 1，使每管最终菌液浓度约为5X IO5CFU/ ml，培养M小时后，利用酶标仪测定600nm的光吸收值，确定MIC值，得到如表1所示的结果，从表1中可以看出，紫贻贝抗菌肽对上述3种革兰氏阳性菌和上述6种革兰氏阴性菌都有效，说明本发明的紫贻贝抗菌肽是一种广谱抗菌肽，且疗效较好。其中产气肠杆菌，奇异变形杆菌，枯草芽孢杆菌，滕黄微球菌，海洋真菌链孢粘帚菌以及金黄色葡萄球菌37°C培养；副溶血弧菌，恶臭假单胞菌以及鳗弧菌培养；具体步骤调节各菌至OD6tltl为1后，稀释1000倍备用。在96孔板中每孔中加入 100 μ 1 LB液体培养基，再在每一行第一个孔中加入100 μ 1抗菌肽，混勻后从第一个孔中吸出100 μ 1加到第二个空中，混勻后吸出100 μ 1加到第三个孔中，依此类推，第10个孔中吸出的100 μ 1不再加到第11孔中。每行1-11孔中都接种稀释好的相应菌种5 μ 1，第12 孔为只含培养基的对照。培养Mh以上，测定吸光值，并计算相应MIC。最终测得如表1所示的紫贻贝抗菌肽对各菌的MIC值表紫贻贝抗菌肽对以上各种菌都有一定的抑制作用，其中藤黄微球菌、 枯草芽孢杆菌、产气肠杆菌、副溶血弧菌的作用最为显著，最小抑菌浓度分别为1. lmg/mL、 0. 28mg/mL、l. lmg/mL、0. 55mg/ml0表1 紫贻贝抗菌肽对各菌的MIC值表
权利要求
1.紫贻贝Hydramacin-I基因，为克隆基因，其特征在于该Hydramacin-I基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
2.权利要求1所述的紫贻贝Hydramacin-1基因表达的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。
3.制备权利要求2所述的紫贻贝Hydramacin-1基因表达的重组蛋白的方法，其特征在于包括下述步骤1)总RNA提取用Trizol试剂从感染鳗弧菌的紫贻贝的血淋巴中提取总RNA，得到总 RNA，存于-80°C备用；2)mRNA纯化用OligotexmRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA ；3)cDNA模板溶液制备用cDNA Synthesis Kit试剂盒将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒对大于IOObp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体连接，得到是cDNA质粒，用 ZAP- cDNA Gigapack 111 Gold Cloning Kit试剂盒对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入体积百分终浓度为7%的二甲基亚砜，得到含抗菌肽基因的cDNA模板溶液，存于-80°C ；4)基因筛选从上述已构建文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3在 MegaBACElOOO测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件数据经Phred程序处理转化为序列文件和质量文件，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13且长度大于IOObp的序列作为EST数据；将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获的Contigs与Singletons在数据库中进行 BLAST分析，根据相似性分析结果寻找出与Hydramacin-1基因同源的EST序列；5)基因克隆采用cDNA末端快速扩增技术，根据已经获得的目的基因的部分片段设计基因特异性引物Pl 如序列表SEQ ID N0. 3所示，P2 如序列表SEQ ID N0. 4所示，以接头通用引物Adapter dT在M-MLV反转录酶的作用下引导反转录合成cDNA ；用接头通用引物 Universal primer分别和基因特异性引物进行Nested-PCR，扩增基因3 ‘末端，PCR产物用胶回收试剂盒进行回收和纯化得到PCR纯化产物，将所述PCR纯化产物与pMD-18T载体连接，连接产物转化E. coli ToplO感受态细胞中，阳性转化子经PCR筛选后测序，序列拼接得到全长cDNA序列的克隆质粒；扩增反应体系及条件，一扩体系10XPCR Buffer :2. 5 μ L，MgCl2 (25mM) :1. 2 μ L， dNTP (2. 5mM) 2. O μ L, Universal primer 0. 5μ L,PCR/jC :17. 05μ L,cDNA|ffe. 1 μ L,Taq 0. 25 μ L，P1引物0. 5 μ L ；条件首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性45 秒，60°C至56°C每循环降低0. 5°C，退火30秒，72°C延伸1分钟，共进行10个循环，再进入下列循环94°C变性45秒，56°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，共进行20个循环，最后72°C 延伸 10 分钟；二扩体系10 XBuffer 2. 5 μ LjMgCl2 (25mM) 1. 2 μ L, dNTP (2. 5mM) :2. O μ L， Universal primer 0. 5μ L,PCR/jC :17. 05 μ L, Taq 0. 25 μ L, P2 弓|物0. 5 μ L，稀释后的一扩产物1 μ L ；条件首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性30秒，56°C退火 45秒，72 °C延伸1分钟，共进行30个循环，最后72°C延伸10分钟；6)重组质粒构建对上述克隆质粒进行扩增反应，扩增反应正向引物为含有NdeI酶切位点的如序列表SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，反向引物为含B10 I酶切位点和6 个His纯化标签的如序列表SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列；将扩增片段纯化回收，导入 PMD18-T simple载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌TOPlO感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nde I和B10 I双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒对酶切产生的目的片段纯化回收，得到编码重组蛋白的重组基因紫贻贝Hydramacin-1基因，测序该重组基因，该重组基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，将该重组基因导入经同样双酶切的表达载体pET-21a，得到重组质粒；7)重组基因表达将上述重组质粒转入表达宿主菌BL21(DE;3)-plysS，筛选阳性重组质粒，测序确认，挑取单克隆重组质粒，将单克隆重组质粒接种于200ml Super OptimalBroth培养基中，接种浓度为220rpm，37 °C培养至0D600 = 0. 5-0. 7，加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷，使终浓度达到lmmol/ml，继续培养3h，4°C，5000rpm,离心lOmin， 收集菌液；8)重组蛋白纯化对上述菌液超声破碎、离心、提取、GE的HisTrap螯合柱层析纯化、洗脱，得到重组蛋白，该重组蛋白为紫贻贝抗菌肽，经测序，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表 SEQ ID NO. 2 所示。
全文摘要
本发明公开了从紫贻贝中克隆得到如序列表SEQIDNO.1所示的Hydramacin-1基因，该克隆基因的表达得到如序列表SEQIDNO.2所示的重组蛋白，该重组蛋白为新的紫贻贝抗菌肽，对海洋来源的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有很强的抑制活性，具有开发为广谱抗菌类药物、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值；该紫贻贝克隆基因和重组蛋白的制备方法，通过总RNA提取、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、抗菌肽基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤，能得到纯度较高的重组的紫贻贝抗菌肽。
文档编号C07K14/435GK102206646SQ20111007538
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者母昌考, 王春琳, 赵建民, 陈磊磊 申请人:宁波大学