专利名称：大孔吸附树脂富集精制木通皂苷d的制备方法
技术领域：
本发明涉及木通皂苷D的制备方法，具体涉及一种大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法。
背景技术：
木通皂苷D是从天然的中药续断中提取得到的，不同纯度的木通皂苷D有抗老年痴呆活性。传统的木通皂苷D提取方法是药材粉碎成米粒大小用95%的乙醇水浴回流提取 3次，提取液过滤合并，减压浓缩回收乙醇至小体积，浓缩液用石油醚萃取脱脂，至石油醚无色，脱脂后的浓缩液调PH3-4，用氯仿分次萃取，合并萃取液，中和氯仿萃取液至Ph7，减压回收氯仿近干，得到木通皂苷D粗品，木通皂苷D粗品经硅胶柱用不同比例的氯仿甲醇系统洗脱纯化，再经ODS柱用甲醇水系统洗脱，最终得到纯度为90%的木通皂苷D。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，该制备方法采用大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D，制备工艺简单易行，方便工业化实施。本发明的技术解决方案是该制备方法包括以下步骤
(1)药材提取浓缩取续断药材粗颗粒置于容器中，加入10倍量的质量浓度90%的乙醇，浸泡2小时，水浴回流提取2小时，滤过；药渣再用10倍量的质量浓度90%的乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过；合并3次滤液，减压浓缩回收乙醇至无醇味，得浓度为0. Ig生药/ml的浓缩液；
(2)大孔吸附树脂富集取浓度为0.Ig生药/ml的浓缩液，用已经处理过的大孔吸附树脂富集，由乙醇水溶液洗脱，得0. Ig生药/ml的富集液；
(3)大孔吸附树脂精制取浓度0.Ig生药/ml的富集液，用已经处理过的大孔吸附树脂精制，由甲醇或乙醇水溶液洗脱，回收溶剂至近干，经减压干燥，得到木通皂苷D。其中，采用D101、HPD-100, Seplite LX-68、HPD-200A、HPD-722、HPD-721 大孔吸附树脂富集制备木通皂苷D的富集液，乙醇水溶液的质量浓度为20%-95%，洗脱液的体积为 4-8倍量的柱体积，50%的乙醇水溶液为最佳洗脱液。其中，富集用大孔吸附树脂的预处理先用4倍量柱体积蒸馏水漂洗，再用质量浓度95%的乙醇浸泡12小时，然后用2倍柱体积质量浓度95%的乙醇淋洗以脱除致孔剂或低聚物，终点以流出的乙醇加水不显混浊为标准，流速为lBV/h，最后用4倍量柱体积蒸馏水洗至无醇味，流速为2BV/h。其中，采用ODS-AA (50 μ m)、ODS-AQ (50 μ m)、0DS_AA (75 μ m)、0DS_AQ (75 μ m)、 ODS-BP (40-60 μ m)大孔吸附树脂精制木通皂苷D的富集液，甲醇水溶液的质量浓度为 10%-90%，洗脱液的体积为6-8倍量的柱体积，50%-70%的甲醇水溶液为最佳洗脱液。其中，采用ADS-7大孔吸附树脂精制木通皂苷D的富集液，由乙醇水溶液洗脱，乙醇水溶液的质量浓度为20%-70%，洗脱液的体积为4-8倍量的柱体积，50%-70%的乙醇水溶液为最佳洗脱液。其中，ADS-7大孔吸附树脂的预处理用2-4倍树脂体积的质量浓度5%的盐酸处理，流速1 BV/h ；6倍柱体积水洗至中性，流速2BV/h ；再用2-4倍柱体积的含质量3%氢氧化钠的50%乙醇水溶液洗脱，流速1 BV/h ；6倍柱体积水洗至pH试纸检测为中性，流速2BV/ h ；再用3倍柱体积质量浓度4%氢氧化钠水溶液洗脱，流速为lBV/h ；6倍柱体积水洗至pH 试纸检测为中性，流速为2BV/h。其中，ODS大孔吸附树脂的预处理以质量浓度95%的乙醇浸泡和洗涤，再用水洗至无醇味。本发明的制备方法在药材提取、浓缩后，浓缩液经大孔吸附树脂富集，再经大孔吸附树脂精制，得到纯度90%以上的木通皂苷D，制备工艺简单易行，工艺路线短，工业化生产
效率高。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术解决方案的限制。实施例1 木通皂苷D的富集液的制备
1.富集木通皂苷D富集液的树脂D101、HPD-100、S印lite LX-68、HPD-200A、HPD_722、 HPD-721 ；
2.层析柱径高比径高比为1:4-1:9；
3.吸附材料的吸附量药材重g树脂湿重g=l :1 5 ；
4.温度10-350C ；
5.富集用大孔吸附树脂的预处理先用4倍量柱体积蒸馏水漂洗，再用质量浓度95% 的乙醇浸泡12小时，然后用2倍柱体积质量浓度95%的乙醇淋洗以脱除致孔剂或低聚物， 终点以流出的乙醇加水不显混浊为标准，流速为lBV/h，最后用4倍量柱体积蒸馏水洗至无醇味，流速为2BV/h ；
6.药材提取浓缩分别取续断药材粗颗粒6份，每份为200g，分别置于3000ml的圆底烧瓶中，分别加入10倍量的质量浓度90%的乙醇，浸泡2小时，分别水浴回流提取2小时，分别滤过；药渣再分别用10倍量的质量浓度90%的乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过；分别合并3次滤液，分别减压回收乙醇至无醇味，分别配制成生药药液为1 :1的水溶液(lg/ ml)；
7.上样液取药材提取浓缩液配浓度为0.Ig生药/ml的上样液，上样液的流速为每小时1个柱体积；
8.洗脱液分别依次用水、20%、30%、35%、50%、95%的乙醇水溶液洗脱，洗脱液的体积分别为4-8倍量的柱体积，洗脱液流速为每小时2个柱体积；
9.几种型号树脂富集木通皂苷D的结果分别取浓度为0.Ig生药/ml的上样液各 2000ml，相当于200g生药，分别上已经处理过的D101、HPD_100、S印lite LX-68、HPD_200A、 HPD-722、HPD-721，树脂体积为960ml，分别依次用水、20%、30%、35%、50%、95%的乙醇水溶液洗脱，洗脱液的体积为4-8倍量的柱体积；分别合并50%的乙醇洗脱液，分别回收溶剂至小体积，分别以水定容为2000ml，分别称为富集液1、富集液2、富集液3、富集液4、富集液5、富集液6 ；6种不同树脂得到的木通皂苷D富集液分别经HPLC测定其浓度，并经浓度和总体
积计算当中木通皂苷D的含量及其转移率。 实施例2 木通皂苷D富集液中木通皂苷D的含量测定
1.色谱条件Agilent-1260型高效液相色谱仪，色谱柱为Bostonanalytics, Green ODS-AQ 4. 6 X 150mm 5um，波长为 212nm，进样量为 20ul，流速为 1. Oml/min，柱温为 25°C，流动相为乙腈-水(30:70)；
2.对照品木通皂苷D溶液精密称定木通皂苷D对照品粉末4.97mg，移至5 mL容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，过0.45 ym微孔滤膜，得0.9940 mg/mL的MD对照液；含量测定时，用移液管精密量取MD对照液0.2 mL，流动相(乙腈-水=30:70)溶解并稀释至1 mL，过0.45 ym微孔滤膜，浓度为0.9940/5 = 0. 1988mg/ml ；
3.木通皂苷D样品液分别称取实施例1的富集液1-6号样品液各1ml，分别以流动相 (乙腈- 水=30:70)定容至IOml ；
4.富集液1-6号样品液中木通皂苷D含量测定
分别精取上述富集液1-6号样品待测液，过0.45 ym微孔滤膜，分别精取上述各样品液和对照品溶液20ul，注入色谱柱，按上述色谱条件测定；
5.测定的结果对照品中木通皂苷D峰面积Swms=694.2 ；测得各样品中木通皂苷D 峰面积=St^nl =287.5，S#p2 =281.1，S^n3 =285.7，S#P 4 =284.0，S#P 5 =279.4，St^6 =291. 2 ；
计算得到的各木通皂苷D样品中木通皂苷D的浓度 C样品广 C对照品 XS样品/S5wm=O. 1988X694. 2/287. 5=0. 480mg/ml C样品2= C对照品 XS样品2/S对照品=0. 1988X694. 2/281. 1=0. 491mg/ml C样品3= C对照品 XS样品 3/S对照品=0. 1988X694. 2/285. 7=0. 483mg/ml C样品4= C对照品 XS样品4/S对照品=0. 1988X694. 2/284. 0=0. 486mg/ml C样品5= C对照品 XS样品 5/S对照品=0. 1988X694. 2/279. 4=0. 494mg/ml C样品6= C对照品 XS样品6/S对照品=0. 1988X694. 2/291. 2=0. 474mg/ml 计算得到富集液1-6样品中木通皂苷D的含量
富集样品液1中木通皂苷D的含量=CtisiXVtisi=O. 480mg/mlX2000ml=9. 60g 富集样品液2中木通皂苷D的含量=Ctis2Xvtis2=OjgimgAilXZOOOml =9. 82g 富集样品液3中木通皂苷D的含量=Ctis3XVtis3=O. 483mg/ml X 2000ml =9. 66g 富集样品液4中木通皂苷D的含量=Ctis4XVtis4=O. 486mg/ml X 2000ml =9. 72g 富集样品液5中木通皂苷D的含量=Ctis5XVtis5=O. 494mg/ml X 2000ml =9. 88g 富集样品液6中木通皂苷D的含量=Ctis6XVtis6=O. 474mg/ml X 2000ml =9. 48g 计算得到富集液1-6样品中木通皂苷D的转移率已知原药材当中木通皂苷D的百分含量为5. 15%，提取的转移率为98%，提取后的药液中木通皂苷D的含量为5. 05% ；本实验所用药材的量均为200g，200g药材提取液中木通皂苷D的含量应该为10. Ig ； 富集之后不同吸附材料得到的富集液中木通皂苷D的转移率分别如下 富集样品液1中木通皂苷D的转移率=富集样品液1中木通皂苷D的含量/药液中木通皂苷 D 的含量=9. 60g /10. lg=95. 0%
富集样品液2中木通皂苷D的转移率=富集样品液1中木通皂苷D的含量/药液中木通皂苷 D 的含量=9. 82g /10. lg=97. 2%
富集样品液3中木通皂苷D的转移率=富集样品液1中木通皂苷D的含量/药液中木通皂苷 D 的含量=9. 66g /10. lg=95. 6%
富集样品液4中木通皂苷D的转移率=富集样品液1中木通皂苷D的含量/药液中木通皂苷 D 的含量=9. 72g /10. lg=96. 2%
富集样品液5中木通皂苷D的转移率=富集样品液1中木通皂苷D的含量/药液中木通皂苷 D 的含量=9. 88g /10. lg=98. 0%
富集样品液6中木通皂苷D的转移率=富集样品液1中木通皂苷D的含量/药液中木通皂苷 D 的含量=9. 48g /10. lg=93. 9%
结论上述1-6份吸附材料得到的富集液中木通皂苷D的转移率在93. 9%-98. 0%之间， 可以认为上述各种吸附材料，均适用于富集续断提取液中的木通皂苷D。
实施例3 木通皂苷D的精制
1.精制木通皂苷D富集液的大孔吸附树脂ADS-7、0DS-AA(50 μ m)、0DS_AQ (50 μ m)、 ODS-AA (75 μ m)、ODS-AQ (75 μ m)、ODS-BP (40-60 μ m);
2.层析柱径高比径高比为1:4-1:9；
3.大孔吸附树脂的吸附量续断药材g吸附材料g=l :1 5 ；
4.温度10-350C ；
5.精制大孔吸附树脂的预处理
其中，ADS-7大孔吸附树脂的处理用2-4倍树脂体积的质量浓度5%的盐酸处理，流速1 BV/h ；6倍柱体积水洗至中性，流速2BV/h ；再用2-4倍柱体积的含质量3%氢氧化钠的 50%乙醇水溶液洗脱，流速1 BV/h ；6倍柱体积水洗至pH试纸检测为中性，流速2BV/h ；再用3倍柱体积质量浓度4%氢氧化钠水溶液洗脱，流速为lBV/h ；6倍柱体积水洗至pH试纸检测为中性，流速为2BV/h，备用；
其中，ODS大孔吸附树脂的预处理以质量浓度95%的乙醇浸泡和洗涤，再用水洗至无醇味；
6.上样液分别采用实施例1中的第1号富集液水溶液共6份，待进行精制；上样液的浓度为0. Ig生药/ml富集液水溶液，上样液的流速为每小时2个柱体积；
7.洗脱液洗脱液分别为甲醇水溶液和乙醇水溶液，甲醇水溶液的比例为1:9一9 1 进行梯度洗脱，洗脱液的体积分别为4-8倍量的柱体积；洗脱流速为每小时2个柱体积；
8.几种吸附树脂精制木通皂苷D的结果
五种ODS吸附树脂制备木通皂苷D 分别取5份浓度为0. Ig生药/ml的富集液水溶液 2000ml，分别上已经处理过的 ODS-AA (50 μ m)、0DS-AQ (50 μ m)、ODS-AA (75 μ m)、ODS-AQ (75 μ m),ODS-BP (40-60 μ m)吸附树脂柱；分别依次用甲醇水溶液洗脱，洗脱液的比例为1 9-9 :1，洗脱液的体积分别为6-8倍量的柱体积；合并洗脱液比例为5 5-7 3的洗脱液， 回收溶剂至近干，经65°C减压干燥，分别得到木通皂苷D，得到的木通皂苷D分别为5. 2g、 5.3g、5.2g、5.2g、5. lg，分别称为样品(1)、样品(2)、样品(3)、样品(4)、样品(5)；
ADS-7大孔树脂柱制备木通皂苷D 取浓度为0. Ig生药/ml的富集液水溶液2000ml，上已经处理过的ADS-7大孔树脂柱，依次用水-20%乙醇-30%乙醇-35%乙醇-50%乙醇-70% 乙醇水溶液洗脱，洗脱液的体积分别为4-8倍量的柱体积，合并50%和70%乙醇水溶液洗脱液，回收溶剂至近干，经65°C减压干燥，得到木通皂苷D，得到的木通皂苷D为5. 3g，称为样品(6)。 实施例4 木通皂苷D精制液中木通皂苷D的含量测定
1.色谱条件同实施例2;
2.对照品木通皂苷D溶液精密称定木通皂苷D对照品粉末4.97mg，移至5 mL容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，过0.45 ym微孔滤膜，得0.9940 mg/mL的MD对照液；含量测定时，用移液管精密量取MD对照液0.2 mL，流动相(乙腈-水=30:70)溶解并稀释至1 mL，过0.45 ym微孔滤膜，浓度为0.9940/5 = 0. 1988mg/ml ；
3.木通皂苷D样品供试液分别称取实施例3的ODS-AA(50 μ m)、0DS_AQ (50 μ m)、 ODS-AA (75 μ m),ODS-AQ (75 μ m)、0DS_BP (40-60 μ m)、ADS_7 精制得到的木通皂苷 D 样品各lml，分别用乙腈-水-甲醇=30:70:25定容为25ml，分别标注为样品(1)、样品(2)、样品⑶、样品(4)、样品(5)、样品(6)；
4.木通皂苷D样品的含量测定分别精取上述木通皂苷D样品液和对照品溶液各 20ul，注入色谱柱，按上述色谱条件测定；
5.各样品木通皂苷D称量结果样品α)=15· 2mg ；W样品(2)=14· Omg ；W样品(3)=14· 9mg ；W样品 ⑷=15. Img ；W样品⑴=15. 3mg ；W样品⑷=15. 2mg ；
6测定的结果对照品中木通皂苷D峰面积Swms=702. 2 ；测得各样品供试液中木通皂苷D的峰面积:S样品⑴=1966. 3 ；S样品⑵=1812. 7 ；S样品⑶=1931. 4 ；S样品⑷=1950. 1 ；S样品⑴ =2005.2 ;S样品(6) =1957.9 ；
计算得到的各样品中木通皂苷D的浓度
C样品(1)=C对照品X §样品(1)/S对照品=0.1988X1966.3/"02.2==0.5567mg/,mlC样品(2)=C对照品X S样品⑵/S对照品=0.1988X1812.7/"02.2==0.5132mg/,mlC样品(3)=C对照品X S样品⑶/S对照品=0.1988X1931.4/"02.2==0.5468mg/,mlC样品(4)=C对照品X S样品⑷/S对照品=0.1988X1950.1/"02.2==0.5521mg/,mlC样品(5)=C对照品X S样品(5)/S对照品=0.1988X2005.2/"02.2==0.5677mg/,mlC样品(6)=C对照品X S样品(6)/S对照品=0.1988X1957.9/"02.2==0.5543mg/,ml
计算得到各样品中木通皂苷D的百分含量
C样品⑴ XV样品⑴/W样品⑴=0· 5567mg/mlX25ml/15. 2mg=91. 6%。C样品⑵ XV样品⑵/W样品⑵=0. 5132mg/mlX25ml/14. 0mg=91. 6%。C样品⑶ XV样品⑶/W样品⑶=0. 5468mg/mlX25ml/14. 9mg=91. 7%。C样品⑷ XV样品⑷/W样品⑷=0. 5521mg/mlX25ml/15. lmg=91. 4%。C样品⑶ X V样品⑴/W样品⑴=0. 5677mg/mlX25ml/15. 3mg=92. 8%。C样品⑷ XV样品⑷/W样品⑷=0. 5543mg/mlX25ml/15. 2mg=91. 2%。结论上述各种用于精制的吸附树脂得到的样品纯度均大于90%，达到中药一类新药的纯度要求，符合精制的需要。
权利要求
1.大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤(1)药材提取浓缩取续断药材粗颗粒置于容器中，加入10倍量的质量浓度90%的乙醇，浸泡2小时，水浴回流提取2小时，滤过；药渣再用10倍量的质量浓度90%的乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过；合并3次滤液，减压浓缩回收乙醇至无醇味，得浓度为0. Ig生药/ml的浓缩液；(2)大孔吸附树脂富集取浓度为0.Ig生药/ml的浓缩液，用已经处理过的大孔吸附树脂富集，由乙醇水溶液洗脱，得0. Ig生药/ml的富集液；(3)大孔吸附树脂精制取浓度0.Ig生药/ml的富集液，用已经处理过的大孔吸附树脂精制，由甲醇或乙醇水溶液洗脱，回收溶剂至近干，经减压干燥，得到木通皂苷D。
2.根据权利要求1所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于 其中，采用 D101、HPD-100、S印lite LX-68、HPD-200A、HPD-722、HPD_721 大孔吸附树脂富集制备木通皂苷D的富集液，乙醇水溶液的质量浓度为20%-95%，洗脱液的体积为4-8倍量的柱体积。
3.根据权利要求2所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于 富集木通皂苷D的富集液时，采用质量浓度50%的乙醇水溶液。
4.根据权利要求2所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于 其中，富集用大孔吸附树脂的预处理先用4倍量柱体积蒸馏水漂洗，再用质量浓度95%的乙醇浸泡12小时，然后用2倍柱体积质量浓度95%的乙醇淋洗以脱除致孔剂或低聚物，终点以流出的乙醇加水不显混浊为标准，流速为lBV/h，最后用4倍量柱体积蒸馏水洗至无醇味，流速为2BV/h。
5.根据权利要求1所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于 其中，采用 ODS-AA (50 μ m)、ODS-AQ (50 μ m)、ODS-AA (75 μ m)、ODS-AQ (75 μ m)、ODS-BP (40-60 μ m)大孔吸附树脂精制木通皂苷D的富集液，甲醇水溶液的质量浓度为10%-90%，洗脱液的体积为6-8倍量的柱体积。
6.根据权利要求5所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于 精制木通皂苷D的富集液时，采用质量浓度50%-70%的甲醇水溶液脱液。
7.根据权利要求1所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于 其中，采用ADS-7大孔吸附树脂精制木通皂苷D的富集液，由乙醇水溶液洗脱，乙醇水溶液的质量浓度为20%-70%，洗脱液的体积为4-8倍量的柱体积。
8.根据权利要求7所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于 精制木通皂苷D的富集液时，采用质量浓度50%-70%的乙醇水溶液洗脱。
9.根据权利要求7所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于 其中，ADS-7大孔吸附树脂的预处理用2-4倍树脂体积的质量浓度5%的盐酸处理，流速1 BV/h ；6倍柱体积水洗至中性，流速2BV/h ；再用2-4倍柱体积的含质量3%氢氧化钠的50% 乙醇水溶液洗脱，流速1 BV/h ；6倍柱体积水洗至pH试纸检测为中性，流速2BV/h ；再用3 倍柱体积质量浓度4%氢氧化钠水溶液洗脱，流速为lBV/h ；6倍柱体积水洗至pH试纸检测为中性，流速为2BV/h。
10.根据权利要求5所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于其中，ODS大 孔吸附树脂的预处理以质量浓度95%的乙醇浸泡和洗涤，再用水洗至无醇味。
全文摘要
本发明公开了大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，取续断药材粗颗粒置于容器中，加入10倍量的质量浓度90%的乙醇，浸泡2小时，水浴回流提取2小时，滤过；药渣再用10倍量的质量浓度90%的乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过；合并3次滤液，减压浓缩，得浓缩液；取浓缩液用已经处理过的大孔吸附树脂富集，由乙醇水溶液洗脱，得富集液；取富集液用已经处理过的大孔吸附树脂精制，由甲醇或乙醇水溶液洗脱，回收溶剂至近干，经减压干燥，得到木通皂苷D。本发明的制备方法在药材提取、浓缩后，浓缩液经大孔吸附树脂富集，再经大孔吸附树脂精制，工艺简单易行，路线短，工业化生产效率高。
文档编号C07J63/00GK102180937SQ201110075470
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者纪乐军 申请人:江苏神华药业有限公司