专利名称：一种高效生产Trx-hCTRP2的方法
技术领域：
本发明涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物技术，具体来说涉及到一种高效生产还有组氨酸标签的thi0red0XinCTrX)-hCTRP2融合蛋白。
背景技术：
脂联素是一种由脂肪细胞分泌产生的细胞因子，1995年由Scherer等在小鼠的 3T3脂肪细胞中首次发现。研究表明，它具有增加脂肪酸氧化、提高葡萄糖摄取量、改善胰岛素抵抗、调控血管内皮的炎症反应等作用，且与肥胖、2型糖尿病和心血管疾病密切相关。 CTRPs (Clq-tumor necrosis factor-related protein)是一类与脂联素结构与功能都很相似的新型蛋白质家族，NCBI数据库中共有该家族已发现的12个成员(CTRP1-12)的cDNA 及蛋白质序列。CTRl^s蛋白由四个不同的结构域组成一个N-末端信号肽，一个短的可变结构域，一个胶原结构域，和一个与补体蛋白Clq同源的C-末端球形结构域。Wong等发现， CTRPs在哺乳动物中都是可分泌的糖蛋白。并且，CTRPs不像脂联素，只在脂肪组织表达，它们可以在多种组织中表达。CTRPs具有高保守性。鼠CTRPs与相应的人的CTRPs在N-端可变区有53%-100% 的氨基酸一致性，在C-端这样的一致性达到了 82% -99%。在CTRPs (CTRPs) 1-7中，CTRP2 的生物学功能及结构都是与脂联素最为相似的。在C2C12肌管细胞中，CTRP2也能够快速激活AMPK、ACC、p44/42MAPK途径。当用全长型CTRP2、CTRP2球状结构域(gCTRP2)或者原核表达的脂联素刺激C2C12肌管细胞16h，可以观察到肝糖原的积累量上升了 6-8倍。CTRP2 也能够显著促进脂肪酸的氧化。Wong等认为，CTRP2可以作为一种潜在的胰岛素增敏剂。 CTRP2在人、鼠、大鼠、牛、猪、斑马鱼等物种中都有非常高的保守性。随着对CTRP作用机制的不断深入，人CTRP2作为药物，其需求量也大大增加。 目前，市场上还没有人重组hCTRP2蛋白，动物或昆虫细胞仅能低水平地表达hCTRP2。本研究组利用酵母表达系统对其进行表达，虽然hCTRP2可以在酵母中分泌表达，但表达的 hCTRP2在酵母中非常不稳定，一旦分泌表培养液中即发生降解，因此无法得到全长且均一的hCTRP2蛋白(参见图8)。大肠杆菌的表达产物通常以包涵体形式存在，要通过变性复性得复杂操作才能得到活性形式的hCTRP2，从而减少了活性蛋白的产率，本申请发明人也利用很多大肠杆菌的其它表达载体如pET28-a(+)，对其进行了诱导表达，发现表达的产物均为包涵体蛋白，没有可溶形式的hCTRP2(参见图9)；最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活。因此，目前市场还没有人重组hCTRP2蛋白出售。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效生产Trx_hCTRP2的方法，根据该方法可获得大量稳定、可溶且具有生物活性的Trx_hCTPR2融合蛋白。解决上述目的的技术方案如下
一种高效生产Trx_hCTRP2的方法，主要包括以下步骤(1)克隆人hCTRP2基因以从人脂肪细胞中提取的总mRNA为模板，先用RT-PCR 扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出完整hCTRP2基因片段，所用hCTRP2 特异引物中引入BamH I酶切位点和在未端引入Bio I酶切位点，回收PCR产物连接到质粒 PMD20-T载体，得质粒hCTRP2/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列；(2)构建原核表达载体将表达载体pET32_a (+)和质粒hCTRP2/pMD20_T经过)(ho I及BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32/hCTRP2 ；(3)转化重组载体到大肠杆菌宿主中利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32/ hCTRP2转化到大肠杆菌T0P10菌株中，再从T0P10中提取重组载体pET32/hCTRP2 ；用热激法，将重组载体pET32/hCTRP2转入到大肠杆菌表达菌株中(优选为BL21 (DE!3)菌株)，经 LB Amp抗性平板筛选得到包含有重组载体pET32/hCTRP2的BL21 (DE3)转化子；(4)可溶诱导表达得到的大肠杆菌重组转化子在37°C培养至0D_为0. 45-0. 65 时加入浓度为0. 2mM-0. 5mM的IPTG，37°C诱导4小时以上，诱导表达重组蛋白体；(5)利用镍亲合层析和分子筛的方法对hCTRP2蛋白进行纯化，得到了高纯度的 hCTRP2可溶蛋白。优选地，所述镍亲合层析和分子筛的方法对hCTRP2蛋白进行纯化为收集经 IPTG诱导后的表达菌的菌体，将菌体重悬液于buffer A(50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 20mMimidazole and 3mM protease inhibitor PMSF, pH 8. 0)用超声破碎仪进行破碎； 破碎后的菌液进行离心；离心所得到的上清液加入到经buffer A预平衡的镍亲合层析柱中；经 buffer B(50mM Tris-HCl,300mM NaCl,50mM imidazole and 3mM PMSF, pH 8.0) 漂洗蛋白纯化柱子后，依次加入不同150mM，200mM and 250mM浓度的咪唑buffer C(50mM Tris-HCl, pH 8. 0, 300mMNaCl, 3mM PMSF)将蛋白洗脱下来，洗脱的蛋白脱内毒素后，利用 SuperdexG-75对其进行进一步的纯化，得到高纯度的重组蛋白。优选地，所述hCTRP2特异引物为hCTRP2-for 5' -GCCTCGAGAAAAGAGACCCACTGCTTGGCGC-3，hCTRP2-rev :5，-GCTCTAGATA CCTCGTTGGGGTCATC-3，。本发明所述Trx_hCTRP2生产方法，经过本发明人大量实验的筛选，最终利用 PET32作为载体、优化组合诱导表达条件，最终可高效表达可溶hCTRP2融合蛋白的方法，既保证了 hCTRP2融合蛋白的生物学活性也高效地获得了大量稳定蛋白。用本发明所述的生产hCTRP2的方法具有显著的优势一是表达产物与增溶因子 Trx融合，可以得到可溶形式的hCTRP2蛋白；二是在该表达系统内，hCTRP2蛋白按适当的方式折叠、形成正确的二硫键并保持天然构象；三是表达产物带有HIS标签，摸索出一条有效纯化活性重组hCTRP2的方法；四是测定了大肠杆菌表达的Trx_hCTRP2的生物活性，测定结果表明动物试验和细胞试验都证明表达的Trx-hCTRP2具有很好的生物活性。
图1是本发明hCTRP2基因PCR结果示意图；图2是本发明载体构建示意图；图3是本发明表达载体的酶切验斑点图4是本发明表达产物的优化图；图5是本发明表达产物的纯化及验证图；图6是本发明表达产物的细胞水平活性分析图；图7是本发明表达产物的动物水平活性分析图；图8是本发明人利用酵母表达载体得到的产物的WB分析图片；图9是本发明人以pET28_a(+)作为表达载体得到的结果示意图。
具体实施例方式本发明选用大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、载体扩增菌株T0P10和表达载体 pET32-a(+)均购自美国hvritrogen公司。所用培养基配方如下1)LB液体培养基NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存；2)LB/Amp平板NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70°C以下，加入ImLAmpicillin (100mg/ml)，充分混均后倒板，4°C避光保存；3)LB/Amp培养基NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌后， 冷却至70°C以下，加入ImLAmpicillin(100mg/ml)，充分混均，4°C保存。LB液体培养基 NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存；4) 50 X TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液=Tris碱121g，冰乙酸28. 6mL, 0. 5mol/L EDTA (pH8. 0) 50mL,加蒸馏水定容至500mL，室温保存；5) 50mg/mL氨苄青霉素保存液氨苄青霉素0. 5g，加蒸馏水溶解并定容至10mL，分装后于-20°C保存；6) 5 X SDS-PAGE 上样缓冲液:1M Tris-HCl (pH 6. 8) 1. 25mL, SDS 0. 5g, BPB 25mg, 甘油2. 5mL，加去离子水溶解后定容至5mL，分装(约500 μ L每份)后于室温保存，使用每份加入25 μ L β -巯基乙醇混勻；7) 5 X SDS-PAGE 电泳缓冲液=Tris 15. lg，甘氨酸 94g，SDS 5. 0g，加入约 800mL 去
离子水，充分搅拌溶解后定容至1L，室温保存；8)考马斯亮蓝R-250染色液考马斯亮蓝R-2500. 25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去离子水并搅拌均勻，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；9)考马斯亮蓝脱色液冰乙酸50mL，甲醇150mL，去离子水300mL，充分混合后，室
温保存；本实施例所述的高效生产hCTRP2的方法，主要包括以下步骤1、克隆人hCTRP2基因以从人脂肪细胞中提取的总mRNA为模板，设计一对引物， 以从人血白细胞中提取的总mRNA为模板，先用RT-PCR扩增总cDNA，用hCTRP2特异引物扩增出完整人重组hCTRP2基因片段，RT-PCR条件为95°C预变性，％iin，一个热循环；94°C热变性30s，55°C褪火30s，72°C延伸45s，34个热循环；72°C复性lOmin。所获得的扩增片断连接到PMD20-T载体(购自于广州TAKARA公司)，得质粒hCTRP2/pMD20_T，用PCR，酶切和核酸测序鉴定，测定序列与Genebank公布的hCTRP2的序列一致。
PCR扩增引物为hCTRP2-for :5，-GCCTCGAGAAAAGAGACCCACTGCTTGGCGC-3，(SEQ ID NO. 1)hCTRP2-rev :5’ -GCTCTAGATA CCTCGTTGGGGTCATC-3，。(SEQ ID NO. 2)PCR结果如图1所示。2、构建 pET32/hCTRP2 质粒1)用Xho I和BamH I双酶切重组质粒hCTRP2/pMD20_T，获得目的片断hCTRP2，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司):
权利要求
1.一种高效生产Trx_hCTRP2的方法，其特征在于主要包括以下步骤(1)克隆人hCTRP2基因以从人脂肪细胞中提取的总mRNA为模板，先用RT-PCR扩增总 cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出完整hCTRP2基因片段，所用hCTRP2特异引物中引入BamH I酶切位点和在未端引入Β ο I酶切位点，回收PCR产物连接到质粒pMD20_T 载体，得质粒hCTRP2/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列；(2)构建原核表达载体将表达载体pET32-a(+)和质粒hCTRP2/pMD20_T经过BioI及 BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32/hCTRP2 ；(3)转化重组载体到大肠杆菌宿主中利用T4DNA连接酶连接，将重组载体pET32/ hCTRP2转化到大肠杆菌TOPlO菌株中，再从TOPlO中提取重组载体pET32/hCTRP2 ；用热激法将重组载体pET32/hCTRP2转入到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，LB Amp抗性平板筛选得到包含有重组质粒pET32/hCTRP2的大肠杆菌表达菌株转化子；(4)可溶诱导表达得到的大肠杆菌重组转化子在37°C培养至0D600为0.45-0. 65时加入浓度为0. 2mM-0. 5mM的IPTG，37°C诱导4小时以上，诱导表达重组蛋白体；(5)利用镍亲合层析和分子筛的方法对hCTRP2蛋白进行纯化，得到了高纯度的hCTRP2 可溶蛋白。
2.根据权利要求1所述的高效生产Trx-hCTRP2的方法，其特征是，所述镍亲合层析和分子筛的方法对hCTRP2蛋白进行纯化为收集经IPTG诱导后的表达菌的菌体，将菌体重悬液于buffer A用超声破碎仪进行破碎；破碎后的菌液进行离心；离心所得到的上清液加入到经buffer A预平衡的镍亲合层析柱中；经buffer B漂洗蛋白纯化柱子后，依次加入不同 150mM,200mM and 250mM浓度的咪唑buffer C将蛋白洗脱下来，洗脱的蛋白脱内毒素后， 利用Superdex G-75对其进行进一步的纯化，得到高纯度的重组蛋白，所述buffer A为pH 8.0、50mM Tris-HCl，300mM NaCl,20mM imidazole and 3mM protease inhibitor PMSF 溶液，buffer B为pH 8. 0、50mM Tris-HCl, 300mM NaCl,50mM imidazole and 3mM PMSF溶液， buffer C 为 pH 8. 0、50mM Tris-HCl, 300mMNaCl, 3mM PMSF 溶液。
3.根据权禾腰求1所述的高效生产TrX-hCTRP2的方法，其特征是，步骤⑴中所述特异引物为5，"GCCT0GAGMMGAGA00CACTGCTTGGCGC-3，:5，-GCTCTAGATA 0CT0GTTGGGGTCATC-3，。
4.根据权利要求1-3任一项所述的高效生产Trx-hCTRP2的方法，其特征是，步骤(3) 中大肠杆菌表达菌株为大肠杆菌BL21 (DE3)。
全文摘要
本发明公开了一种高效生产Trx-hCTRP2的方法，该方法主要包括以下步骤克隆人hCTRP2基因，构建原核表达载体表达载体pET32-a(+)和质粒hCTRP2/pMD20-T经过XhoI及BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32/hCTRP2，转化重组载体到大肠杆菌宿主中，可溶诱导表达；纯化。本发明所述生产方法，利用pET32作为载体、优化组合诱导表达条件，最终可高效表达可溶hCTRP2融合蛋白的方法，既保证了hCTRP2融合蛋白的生物学活性也高效地获得了大量稳定蛋白。
文档编号C07K1/22GK102206282SQ20111007759
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者吴东海, 徐爱民, 李侍武, 李洪波, 金守光 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院