专利名称：检测环丙沙星的scFv抗体、其编码基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学检测领域，具体地说，涉及一种检测环丙沙星的SCFv抗体、其编码基因及应用。
背景技术：
环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)，化学名称为1_环丙基_6_氟-1，4_ 二氢_4_氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸，是合成的第三代喹诺酮类抗菌药物，具广谱抗菌活性，杀菌效果好，几乎对所有细菌均具有抗菌活性，在畜牧业生产中广泛使用。但因其具有一定的毒性，在动物性食品中的残留对食品卫生和公共健康产生威胁。检测环丙沙星残留量的化学分析方法需要昂贵的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测环丙沙星的scFv抗体及编码该抗体的基因。本发明的另一目的是提供上述scFv抗体及其编码基因在检测环丙沙星中的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种检测环丙沙星的scFv抗体，其包括重链和轻链，其中，重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ IDNo. 1和SEQ ID No. 2所示。本发明还提供上述scFv抗体的氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的scFv抗体。例如，在重链上，将第M位的Ala替换为Wie,或是将第89位的Glu替换为Asp ；在轻链第96位的Thr添加kr，或是将轻链第34位的Trp缺失；均不会影响该抗体的功能。本发明还提供编码上述scFv抗体的基因，其中，编码scFv抗体重链的基因具有 SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，编码scFv抗体轻链的基因具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。本发明还提供含有编码上述scFv抗体的基因的载体。本发明还提供含有上述载体的宿主细胞。本发明进一步提供上述scFv抗体、编码该抗体的基因、含有所述基因的载体或含有该载体的宿主细胞在检测环丙沙星中的应用。本发明还提供上述scFv抗体的制备方法，即将编码上述scFv抗体的基因构建至表达载体中并转化宿主细胞，然后进行蛋白的表达及分离纯化。其中，所述表达载体为 PCANTAB5E。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果本发明检测环丙沙星的scFv抗体，主要采用竞争性ELISA方法定性或定量检测样品中环丙沙星的残留；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；采用高特异性的环丙沙星scFv抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高等特点。本发明的方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测。
图1 随机挑选20个scFv-pCANTAB5e重组质粒sfil和NotI双酶切电泳图，M DL2000 核酸分子量 Marker，1 20 :scFv-pCANTAB5e 酶切产物。图2 为30个重组菌诱导表达产生可溶性抗体scFv-ELISA结果。图3 重组菌诱导表达产物SDS-PAGE电泳图，1 重组菌诱导表达上清液，2 重组菌诱导表达胞间质，3 阴性对照。图4 环丙沙星诱导表达上清中可溶性重组抗体间接竞争ELISA标准曲线。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中使用的试剂盒材料均为市售商品。实施例1免疫原及检测原的偶联制备1、材料牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺(EDC)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、环丙沙星(CIP)标准品、透析膜、透析膜处理液、磁力搅拌仪、紫外分光光度仪。2、方法采用混合酸酐法，将环丙沙星与蛋白大分子(BSA、OVA)进行偶联，制备免疫原和包被原。2. 1免疫原及包被原合成及纯化A.中间产物制备a.取20mg药物置于烧杯中，加入^iil DMF，若溶解不充分，可在超声波中助溶；b.充分溶解后，加入25mg EDC和20mg NHS,磁力搅拌反应；c.将以上烧杯用锡箔纸包裹好，室温磁力搅拌反应M小时，此液为A液。B.合成及初步纯化a.取 50mg BSA (或 OVA)溶于 6ml PBS (0. 01M, ρΗ7· 4)中，充分溶解，此液为 B 液；b.在磁力搅拌下，将A液逐滴滴入B液中；c.用锡箔纸将烧杯包裹，室温搅拌反应过夜；d.待以上反应完成，将过夜反应液转移至处理好的透析袋中，于4°C冰箱中，用 PBS透析3天。透析中，前3次，每隔2小时换液，之后每8-12小时换液；e.透析结束后，将透析袋内的溶液以4000rpm离心30min，取上清，_20°C冻存；f.取透析液在紫外分光光度仪下，检测偶联效果及偶联物浓度。实施例2小鼠免疫1、材料Balb/c小鼠(雄性、6周龄)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、96孔酶标板、免疫原CIP-BSA、包被原CIP-0VA、包被缓冲液(Na2CO3缓冲液0. 05N，pH9. 6)、封闭液脱脂乳PBS)、洗涤缓冲液(PBS、0. 1% Tween20PBST)、终止液、鼠抗环丙沙星单克隆抗体、HRP标记羊抗鼠IgG抗体、TMB显色液。2、方法2.1小鼠免疫a.取100 μ g免疫原CIP-BSA加入等量弗氏完全佐剂，制成乳化剂；b.首免取8只6周龄Balb/c小鼠，采用背部多点注射免疫，0. 2ml/只，同时设置生理盐水对照组；C. 二免与三免免疫方法取100 μ g免疫原与等量弗氏不完全佐剂制成乳化剂， 背部多点免疫小鼠；每次免疫间隔15天。d.三免后15天，处死小鼠，摘取脾脏，_70°C冻存。眶下窦取血，离心取血清。2. 2ELISA检测免疫小鼠血清抗体效价a.将包被原 CIP-OVA 用包被缓冲液，按照 0. 5mg/l、0. 4mg/l、0. 3mg/l、0. 2mg/l、 0. lmg/1浓度梯度，200 μ 1/孔，包被酶标板，4°C包被过夜；b.洗涤弃包被液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；c.封闭向每孔加满封闭液，于37 °C封闭1. 5小时；d.洗涤弃封闭液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；e.加血清将小鼠血清用 PBS 按照 1 IOOU 200,1 400,1 800,1 1600、 1 3200、1 6400、1 12800,1 25600、1 51200进行梯度稀释后，加入封闭好的酶标孔中，200 μ 1/孔，37°C孵育反应2小时；f.洗涤弃血清稀释液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；g.加酶标二抗HRP标记羊抗鼠IgG抗体用PBS做1 10000稀释，200 μ 1/孔， 37 °C孵育反应1小时；h.洗涤弃酶标抗体液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；i.显色加入200 μ 1/孔TMB显色液，37°C孵育显色45min左右；j.终止用200 μ 1/孔终止液，终止显色，在450nm处读值。3、结果通过间接ELISA检测，包被原最佳浓度0. 2mg/mL·环丙沙星免疫组的3只小鼠(3、 4、8号)血清抗体效价达到1 1观00以上，可满足进一步实验的需要。实施例3免疫小鼠脾细胞RNA的提取及通过RT-PCR获得cDNA1、材料免疫小鼠脾脏、细胞筛、DEPC处理的灭菌PBS、DEPC处理去离子水、总RNA提取试剂盒RNA iso Plus (Takara公司)、反转录试剂盒(Takara公司)。2、方法2. 1脾细胞总RNA的提取采用总RNA提取试剂盒RNAiso Plus，参照说明书进行a.剔除脾脏外周脂肪及外膜细胞，用DEPC处理的灭菌PBS清洗后，将脾脏置于细胞筛上，用眼科剪剪碎脾脏，用5ml DEPC处理去离子水冲洗细胞筛，收集筛下的细胞；b. 8000g 4°C离心 2min,弃上清；c.调整细胞浓度至IO7个/ml，向每IO7个细胞中加入1 ^il的RNAiso Plus ；
d.用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀；室温静置5min ；e.向上述的勻浆裂解液中加入氯仿(RNA iso Plus的1/5体积量)，剧烈振荡15 秒，待溶液充分乳化(无分相现象)后，于室温静置5min;12，(KK)g 4°C离心15min;f.从离心机中小心取出离心管，此时勻浆液分为三层，S卩无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相，吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)；g.向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混勻后，在15 30°C下静置 IOmin ；h. 12000g 4°C离心 IOmin ；i.弃上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇Iml (切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12，OOOg 4°C离心5min后小心弃去乙醇(为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)；j.室温干燥沉淀2 5分钟，加入适量的不含Rnase的水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-70°C保存；k.在微量紫外分光光度计上测定得到的RNA的量。2. 2反转录合成cDNA从-70°C低温冰箱中取出获得的小鼠脾脏RNA，在低温环境下进行操作。采用商品化总RNA提取试剂盒(Takara)，参照说明书进行a.在Microtube管中配制下列混合液，10 μ 1反应体系
dNTPs混合物1μl
OligodT 引物1μl
模板RNA2μ1
无RNA酶水6μ1b.将以上反应体系，迅速置于PCR仪上，设置以下参数进行变性、退火反应，反应条件为:65°C,5min ；4°C ；c.反应结束，离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部；d.采用Takara公司反转录试剂盒，在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，20 μ 1反应体系
上述变性、退火后反应液ΙΟμΙ5xPrimeScript RT 缓冲液4μ1RNase抑制剂0.5μ1Prime Script RTase (第二步)0.5μ1RNase Free dH205μ1 e.将以上反应体系，迅速置于PCR仪上，设置以下参数进行变性、退火反应，反应条件为 A2°C 30min ；95°C 5min ；
f.扩增获得cDNA第一链，-70°C保存。3、结果根据免疫小鼠血清抗体效价，选取了效价高的小鼠脾脏，通过提取RNA并进行反转录，共制得环丙沙星免疫组小鼠(共3只3、4、8号)脾细胞cDNA文库，cDNA浓度均达到 420ng/μ 1。实施例4scFv单链抗体库的构建1、材料免疫小鼠 cDNA、重组噬菌体抗体系统(Recombinant PhageAntibody System) (27-9400-01)包括重链引物混合物、轻链引物混合物和linker引物混合物、(Pharmacia公司)、long amp Taq DNA 聚合酶(NEB 公司)、琼脂糖凝胶、DNAladder (DL2000、lkb)、凝胶回收试剂盒(TaKara公司)、质粒提取试剂盒(TaKara公司)、T4DNA连接试剂盒(NEB公司)、 限制性内切酶(sfiI、NotI) (NEB公司)、pMD18-Tsimple载体系统(TaKara公司)、DH5a工程菌、TGl宿主菌、pCANTABk噬菌体载体、0. IN CaCl2、酵母提取物、Tryptone、氨苄青霉素、 卡那霉素。2、方法2. IVH 禾口 VL 基因 PCR 扩增A.从超低温冰箱取出cDNA，在低温环境下构建VH基因PCR扩增反应体系
5xPCR缓冲液20 μLIOmM dNTP (each)6 pLcDNA (约 200ng )5 μ ν重链引物对4 μ Long amp Taq4 μL双蒸水补足100 μL将以上反应体系除long amp Taq外，加入到PCR管中，迅速置入PCR仪中，并设置以下参数进行扩增950C 5min 热启动，加入 Long amp Taq 后94°C lmin，55°C 2min，65°C 2min ；35 个循环后，65°C 10min，4°C保温。PCR扩增结束，取全部扩增产物与适当上样缓冲液混勻，加入到琼脂糖凝胶中，90V电泳40min，紫外下观察并记录扩增结果，并切取符合大小(340bp)的目的条带。B.从超低温冰箱取出cDNA，在低温环境下构建VL基因PCR扩增反应体系5 xPCR缓冲液20成
IOmMdNTP (每种)6 pL
cDNA (约 200ng)5 pL
轻链引物混合物
Longamp Taq4 pL
双蒸水补足IOOpL反应体系将以上反应体系除long amp Taq外，加入到PCR管中，迅速置入PCR仪中，并设置以下参数进行扩增950C 5min 热启动，加入 Long amp Taq 后94°C lmin，55°C 2min，65°C 2min ；35 个循环后，65°C 10min，4°C保温。PCR扩增结束，取全部扩增产物与适当上样缓冲液混勻，加入到琼脂糖凝胶中，90V电泳40min，紫外下观察并记录扩增结果，并切取符合大小(325bp)的目的条带。C. PCR扩增产物切胶纯化回收使用胶纯化试剂盒(Takara公司)回收，参照说明书进行a.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体；b.切碎胶块，称量胶块重量，以Img = 1 μ 1进行计算；c.向胶块中加入胶块3倍体积的胶块融化液DR-I缓冲液；d.均勻混合后75°C加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化(约 6 10分钟)；e.向上述胶块融化液中加入DR-I缓冲液量的1/2体积量的DR-II缓冲液，均勻混合。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇；f.将试剂盒中的Spin柱安置于收集管上；g.将上述操作e的溶液转移至Spin柱中，12，OOOrpm离心1分钟，弃滤液；h.将 500μ IWRinse A 加入 Spin 柱中，12，OOOrpm 离心 30 秒钟，弃滤液;i.将 700μ IWRinse B 加入 Spin 柱中，12，OOOrpm 离心 30 秒钟，弃滤液;j.重复操作步骤i ；k.将Spin柱安置于收集管上，12，OOOrpm离心1分钟；1.将Spin柱安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin柱膜的中央处加入25 μ 1的灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液，室温静置1分钟；m. 12，OOOrpm 离心 1 分钟洗脱 DNA。将纯化回收获得的VH和VL基因片段，在微量紫外分光光度计上测定片段的量。2. 2S OE-PCR 拼接 VH-Linker-VL 基因采取“VH-Linker-VL”形式将VH基因、Linker及VL基因进行拼接。采用二步法 SOR-PCR法进行。取以上纯化获得的VH和VL基因片段，在低温环境下构建scFv基因拼接PCR扩增
反应体系5xPCR缓冲液 IOmM dNTP (每种)
10 μL 5 μ ν
VH基因片段 VL基因片段
约 50 ng 约 50 ng
Linker引物混合物
4 μL 2 pL 补足50 μL
Long amp Taq
双蒸水将以上反应体系加入到PCR管中，迅速置入PCR仪中，并设置以下参数进行扩增 940C Imin，63 °C 4min，7 个循环。2. 3引入sfil、NotI酶切位点A.以上反应结束，立即取出反应体系，迅速加入预先配制好的以下反应体系将以上反应体系迅速置入PCR仪中，并设置以下参数进行扩增940C lmin，55°C 2min，65°C 2min，30 个循环后，65°C 10min，4°C保温。PCR扩增结束，取全部扩增产物与适当上样缓冲液混勻，加入到琼脂糖凝胶中，90V电泳40min，紫外下观察并记录扩增结果，并切取符合大小(750bp)的目的条带。B. scFv拼接产物切胶纯化回收使用凝胶纯化试剂盒Oiiagen)回收，参照说明书进行a.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体；b.切碎胶块，称量胶块重量，以Img = 1 μ 1进行计算；c.加入3倍胶块体积量的QG缓冲液，50°C水浴，融解胶块；d.加入等体积的异丙醇，充分混勻；e.将试剂盒中的Spin柱安置于收集管上；f. 13000rpm 离心 lmin，弃滤液；g.向Spin柱中央膜加入500 μ 1 QG缓冲液洗柱，13000rpm离心lmin,弃滤液；h.向柱中加入750 μ 1 PE缓冲液，室温作用5min, 13000rpm离心lmin,弃滤液；i.重复操作h—次；j.将Spin柱安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin柱膜的中央处加入30 μ 1 EB 缓冲液，室温静置1分钟；k. 13000rpm 离心 lmin，收集滤液。将纯化回收获得的scFv基因片段，在微量紫外分光光度计上测定片段的量。C. scFv 基因连接 pCANTAB5e
5xPCR缓冲液 IOmM dNTP (每种)
10 μL 2 pL 4 μ 2 pL 32 pL
RS引物Mix Long amp Taq
双蒸水
使用商品化T4DNA连接酶(Promega)，将经sfil和NotI酶切处理的scFv片段与 pCANTAB5e载体连接。操作方法参照说明书进行。取适量pCANTAB5e。载体和scFv基因片段，在低温环境下构建连接反应体系
IOx连接酶缓冲液
T4 DNA连接酶IpL
scFv 片段MpL
pCANTAB5eN μ
双蒸水补足20 pL酶切体系将连接体系置4°C连接过夜。scFv片段与pCANTAB5e使用量，按照如下公式进行
载体质量(ng) χ插入片段大小(kb) -χ插入载体摩尔比=插入片段量ngD.电转化TGl感受态细胞制备a.从_70°C低温冰箱中取出TG1菌种，划线于2XYT平板上，37°C培养16-20小时；b.挑取单个菌落接种于5ml 2 X YT培养基中，37°C，180rpm震荡培养过夜；c.取过夜培养菌液250 μ L接种于50ml 2 X YT培养液中，37°C，300rpm震荡培养至OD6tltlnm = 0. 72-0. 76，将细菌培养物置于冰水混合物中骤冷；d.将细菌培养物转移至预冷的离心管中，4°C，2000 Xg离心lOmin，收集菌体；e.用预冷的双蒸水轻轻重悬菌体沉淀，先加入少量双蒸水重悬菌体，再加满双蒸水，4°C，2000Xg，离心 lOmin，弃上清；f.用10%甘油重复以上e步骤两次，2400 X g，离心lOmin，最后一次倒尽上清后， 用残存管底的甘油悬浮细胞，分装离心管，100 μ L/管；g.将离心管放入液氮中速冻，-70°C低温冰箱保存。E.电转化a.将电击杯(0. 2cm间隙)置于冰上预冷，取出-70°C冻存的感受态细胞，于冰水混合物上融解；b.取30 μ L感受态细胞，向其中加入2 μ L连接产物，轻轻混勻后，置于冰上90秒；c.将混合液加入预冷电击杯的间隙中，擦干杯体，将电击杯置于电转化仪中；d.设置电转参数15kv/cm，5ms，电转；e.取出电击杯，立即轻柔加入Iml预热的SOC培养基，轻轻混勻后，吸出转化液， 37°C，150rpm，培养 1. 5 小时。2. 6 建库A.取上步转化后培养的菌液100 μ L，用2XYT培养液做梯度倍比稀释，涂布 SOB-AG平板，30°C培养过夜。计数平板上的单菌落，推算库容。剩余的转化后培养的菌液，加入80%终浓度灭菌甘油，-70°C冻存，此即为初级抗体库。
B.随机挑取SOB-AG平板上，长出的单克隆10个，提取质粒DNA，用sfil和NotI 双酶切，初步鉴定阳性克隆。质粒提取及酶切反应操作和以上步骤相同。对酶切阳性的重组质粒DNA，进行序列测定和分析。3、结果以环丙沙星免疫组小鼠脾细胞cDNA文库为模板，通过初步扩增，获得了各免疫小鼠抗体重链、轻链可变区基因VH、VL片段，电泳显示条带大小为340和325bp，符合预期大将VH、VL片段切胶纯化回收，与linker进行拼接，获得全长750bp的scFv电泳片段。切胶纯化回收scFv片段，与pMD18-T simple载体做T-A克隆，插入载体构建 scFv-pMD18-T重组质粒，转化DH5 α感受态细胞。随机挑取10个单菌落，过夜培养后，提取重组菌质粒，用sfil和NotI双酶切初步鉴定阳性克隆，电泳显示正确连接率达到100%。将亚克隆板上所有菌落洗下，培养后，提取质粒DNA，sfil和NotI双酶切获得scFv 片段，与用同样双酶切处理的pCANTAB5e噬菌粒载体进行连接，转化后，涂布SOBAG平板。随机挑取20个单菌落，过夜培养后，提取质粒DNA，sfiI和NotI双酶切鉴定scFv与pCANTAB5e 连接情况，结果有18个酶切阳性，分别切出约4. 5kb大小的噬粒和约750bp的scFv插入片段，说明scFv片段成功插入pCANTAB5e噬粒载体。计算库容均达到1. 3X 107。20个单菌落中有18个均能切出目的条带和载体片段(图1)，重组率达到90%。通过以上操作，共制备了环丙沙星免疫组小鼠各3个初级抗体库，各抗体库库容如表1所示表1构建鼠源抗环丙沙星单链抗体初级抗体库情况
权利要求
1.一种检测环丙沙星的SCFv抗体，其包括重链和轻链，其特征在于，重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。
2.权利要求1所述scFv抗体的氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的scFv抗体。
3.编码权利要求1或2所述scFv抗体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，编码scFv抗体重链的基因具有SEQID No. 3 所示的核苷酸序列。
5.如权利要求3所述的基因，其特征在于，编码scFv抗体轻链的基因具有SEQID No. 4 所示的核苷酸序列。
6.含有权利要求3-5任一项所述基因的载体。
7.含有6所述载体的宿主细胞。
8.权利要求1或2所述的scFv抗体、权利要求3-5任一项所述的基因、权利要求6所述的载体或权利要求7所述的宿主细胞在检测环丙沙星中的应用。
9.权利要求1或2所述scFv抗体的制备方法，其特征在于，将权利要求3-5任一项所述的基因构建至表达载体中并转化宿主细胞，然后进行蛋白的表达及分离纯化。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pCANTABk。
全文摘要
本发明提供了一种检测环丙沙星的scFv抗体，其包括重链和轻链，重链和轻链的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和2所示。本发明还提供编码上述scFv抗体的基因。本发明进一步提供上述scFv抗体及其编码基因在检测环丙沙星中的应用。本发明检测环丙沙星的scFv抗体，主要采用竞争性ELISA方法定性和定量检测样品中环丙沙星的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；采用高特异性的环丙沙星scFv抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。
文档编号C07K16/44GK102199213SQ20111008688
公开日2011年9月28日 申请日期2011年4月7日 优先权日2011年4月7日
发明者侯晓林, 孙英健, 郑志明 申请人:北京农学院