专利名称：含有天冬酰胺糖链的糖肽制造方法以及该糖肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及到含有天冬酰胺糖链的糖肽制造方法以及利用该制造方法可获得的糖肽。
背景技术：
近年来，作为继核酸(DNA)、蛋白质之后的第三个链状生命分子，糖链分子引人注目。人体是由约60兆个细胞构成的一大细胞社会，所有的细胞表面都被糖链分子覆盖。例如，ABO式血型就是由细胞表面糖链的不同决定的。糖链具有参与细胞间识别和相互作用的功能，成为构成细胞社会的要素。细胞社会的紊乱与癌、慢性疾病、感染病、老化等有关。例如，已知细胞如果癌化，就会引起糖链的结构变化。另外也知道霍乱弧菌或流感病毒等通过识别、结合某一特定糖链，侵入、感染细胞。糖链功能的阐明，预期会带动依据新的原理的医药品和食品的开发等，对疾病的予防、治疗有贡献等广泛的应用。糖链由于单糖的序列、结合样式以及部位、链长度以及分支样式、整体的高级结构等的多样性，所以与核酸或蛋白质的结构相比，是非常复杂的结构。因此，来自其结构的生物学信息与核酸和蛋白质相比，多种多样。现状是虽然人们认识到糖链研究的重要性，但由于其结构复杂和多样性，与核酸和蛋白质相比，研究进展缓慢。象上述那样存在于细胞膜表面或血清等的很多蛋白质都结合着糖链。糖链与蛋白质共价结合的分子称为糖蛋白质，由于糖和蛋白质的结合样式不同，可以分为2类。一类是天冬酰胺(Asn)侧链的氨基与糖链结合的天冬酰胺结合型糖链(N-糖苷键型)。另一类是在丝氨酸Ger)或苏氨酸(Thr)的羟基处结合了糖链的粘蛋白结合型糖链(0-糖苷键型)。 所有的天冬酰胺结合型糖链带有由5个糖残基构成的基本骨架，由于结合的糖链的非还原末端的糖残基种类不同分为高甘露糖型、复合型、杂合型亚类。另外粘蛋白结合型糖链根据基本骨架(core)的不同又分为4类。作为肽合成法现在广泛使用的方法是1963年由R. B. Merrifield开发的固相合成法。固相合成法是在称为树脂(resin)的固相上连接氨基酸，使肽链延伸下去。肽链延伸一结束，就将肽链从固相上切下，得到目的物。作为应用，在肽链延伸时通过搀入结合了糖链的氨基酸，可以进行糖肽链的合成。其中，在肽合成中应用在Asn或kr (Thr)处结合了糖链的带糖链氨基酸，就可以不断地进行糖肽链的合成。然而，尽管化学合成技术进步，但化学合成带有大的糖链的肽链的例子还很少。
其中的一个问题就是与天冬酰胺残基结合的糖链的绝对量不足。作为获得糖链的手段，有只将糖链从存在于生物体内的糖蛋白质分离的方法。然而将糖链从糖蛋白质切出时使用的胼危险，要大量合成糖链有困难。另外生物体内存在很多结构酷似的糖链，要只获得单一糖链很难。另外由于通过胼分解使糖链与天冬酰胺残基解离，游离的糖链一定要与天冬酰胺残基再结合，结果分离步骤数增加。而通过化学合成合成糖链时，虽然有合成连接了 10个左右糖残基的糖链的例子， 但其中很多例子是，花费1年时间只能合成目的物糖链数毫克左右。因此通过化学合成获得糖链很困难。第二个问题是用于在肽固相合成后将肽链从固相切下的TFA (三氟乙酸)处理。例如，由于糖链非还原末端存在的唾液酸在酸性条件下容易水解，所以通过TFA处理，唾液酸有可能从合成的糖肽被切下。由于这个原因，在固相合成中使用含有唾液酸的糖链的例子几乎没有。作为该问题的解决方法，在肽合成后通过唾液酸转移酶将唾液酸转移到糖链的方法已有报道。然而，该方法作为导入唾液酸的方法虽然有用，但由于糖转移酶价格高，仍然存在着糖肽大量合成困难的问题。然而，象如下所述那样，在本发明由于可通过人工方式容易、大量地合成糖肽，上述利用唾液酸转移酶导入唾液酸或其衍生物也可以应用于工业上。另外虽然天然存在着结合着唾液酸的糖链，但天然中不存在结合着唾液酸衍生物的糖链，为了将唾液酸衍生物导入糖链，不管怎样只有使用唾液酸转移酶的方法。本发明的课题在于提供通过人工方式容易地、大量地合成在肽链的任意位置至少含有1个以上天冬酰胺糖链或粘蛋白结合型糖链的糖肽制造方法。本发明课题还提供容易地获得唾液酸糖肽的方法，其中即使是含有唾液酸的天冬酰胺糖链，经酸处理，唾液酸也不会从糖肽被切下。另外，本发明课题还提供糖肽制造方法，其中，通过人工方式可以容易地、大量地合成在肽链的任意位置至少含有1个以上的任意除去糖残基的各种新的天冬酰胺糖链。另外本发明的课题提供导入了唾液酸或其衍生物的糖肽制造方法，通过使用唾液酸转移酶将唾液酸或其衍生物导入糖肽。本发明的课题提供通过上述各种糖肽制造方法获得的糖肽。
发明内容
本发明涉及到在肽链的任意位置至少含有1个以上天冬酰胺糖链的糖肽制造方法，其特征是(1)使带有羟基的树脂(resin)的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护了的氨基酸的羧基进行酯化反应，(2)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(3)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，(4)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(5)将上述(3)和(4)步骤重复1次以上，(6)与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，(7)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(8)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，(9)将上述(7)和⑶步骤重复1次以上，(10)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(11)用酸将树脂(resin)切去。本发明涉及到适当追加(6)与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，(7)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基步骤的在肽链任意位置至少含有2个以上天冬酰胺糖链的糖肽制造方法。本发明涉及到在最后步骤进行(6)与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，(7)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基步骤的在肽链上至少含有1个以上天冬酰胺糖链的糖肽制造方法。本发明涉及到取代(6)的步骤或除了(6)的步骤之外，再使(1)带有羟基的树脂 (resin)的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酯化反应的糖肽制造方法。本发明涉及到(6)的天冬酰胺糖链含有6个以上糖残基的糖肽制造方法。本发明涉及到(6)的天冬酰胺糖链含有9-11个糖残基的糖肽制造方法。本发明涉及到(6)的天冬酰胺糖链含有6个以上糖残基，并且结合2分叉糖链的糖肽制造方法。本发明涉及到(6)的天冬酰胺糖链是天冬酰胺二唾液酸糖链或天冬酰胺单唾液酸糖链，该唾液酸的羧基被保护基保护的糖肽制造方法。本发明涉及到(6)的天冬酰胺糖链是天冬酰胺脱唾液酸糖链的糖肽制造方法。本发明涉及用粘蛋白结合型糖链取代天冬酰胺糖链的一部或全部的糖肽制造方法。本发明涉及到一种在肽链的任意位置至少含有1个以上通过上述制造方法可获得的天冬酰胺糖链或粘蛋白结合型糖链的糖肽。本发明涉及到天冬酰胺糖链或粘蛋白结合型糖链含有6个以上糖残基，并且结合 2分叉糖链的糖肽。本发明涉及到是结合了从天冬酰胺二唾液酸糖链和天冬酰胺单唾液酸糖链选择的至少1种以上糖链作为天冬酰胺糖链的糖肽。本发明涉及到一种在肽链任意位置至少含有1个以上天冬酰胺糖链，而且在末端带有唾液酸或其衍生物残基的糖肽制造方法，其特征是(1)使带有羟基的树脂(resin)的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酯化反应，(2)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(3)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，(4)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(5)将上述(3)和(4)步骤重复1次以上，(6)与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，(7)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(8)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，(9)将上述(7)和⑶步骤重复1次以上，(10)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(11)用酸将树脂(resin)切去，(12)利用唾液酸转移酶使唾液酸或其衍生物转移到得到的糖肽上。本发明涉及到在上述步骤(11)的用酸切去树脂(resin)前，使标记试剂反应的糖肽制造方法。本发明涉及到标记试剂是丹酰卤化物的糖肽制造方法。本发明涉及到一种5-乙酰胺-3，5，7-三脱氧-7-氟-D-甘油基-β -D-乳糖_2_吡喃壬酮糖酸(nonulopyranosidonic acid)的制造方法，其特征是使N-乙酰基-4-脱氧-4-氟-D-甘露糖胺、丙酮酸钠、牛血清白蛋白、唾液酸醛缩酶进行反应。本发明涉及到一种5-乙酰胺-3，5，7_三脱氧-7-氟-D-甘油基-β-D-乳糖-2-吡喃壬酮糖酸的制造方法，其特征是在乙酸酐存在下，对苄基2-叠氮-2，4-双脱氧-4-氟-β -D-甘露吡喃糖苷加氢，得到N-乙酰基-4-脱氧-4-氟-D-甘露糖胺，然后使其与丙酮酸钠、牛血清白蛋白、唾液酸醛缩酶进行反应。本发明人在先前申请的专利2001-185685号(以下、称为先前申请专利)中开发了与以往相比可以非常容易而且大量地获得各种分离的天冬酰胺糖链衍生物的天冬酰胺糖链衍生物、天冬酰胺糖链、糖链的制造方法，以及结合了任意缺失糖残基的糖链的新的天冬酰胺糖链衍生物、天冬酰胺糖链、糖链。该先前申请的方法，例如包括(1)包括以下工序的来自天冬酰胺糖链的天冬酰胺糖链衍生物的制造方法(a) 将脂溶性保护基导入到在含有1种或2种以上天冬酰胺糖链的混合物中所含有的该天冬酰胺糖链中，获得天冬酰胺糖链衍生物混合物的工序，以及(b)将该天冬酰胺糖链衍生物混合物或该天冬酰胺糖链衍生物混合物含有的天冬酰胺糖链衍生物水解后得到的混合物进行层析，对各天冬酰胺糖链衍生物进行分离的工序。(2)上述(1)所述的天冬酰胺糖链衍生物制造方法，其中还包括(b’)用糖水解酶对工序(b)中分离的天冬酰胺糖链衍生物进行水解的工序。(3)上述(1)或( 所述天冬酰胺糖链衍生物制造方法，其中含有1种或2种以上天冬酰胺糖链的混合物是含有下述式(A)化合物和/或在该化合物中缺失1个以上糖残基的化合物的混合物。(4)上述(1)-03)任一项所述天冬酰胺糖链衍生物制造方法，其中脂溶性保护基是芴甲氧羰基(Fmoc)基。
(5)上述(1)-03)任一项所述天冬酰胺糖链衍生物制造方法，其中工序(a)是向含有在非还原末端带有唾液酸残基的1种或2种以上天冬酰胺糖链的混合物中所含的该天冬酰胺糖链导入Fmoc基，而且向唾液酸残基导入苄基后得到天冬酰胺糖链衍生物混合物的工序。(6)包括以下工序的天冬酰胺糖链制造方法(a)将脂溶性保护基导入到在含有1种或2种以上的天冬酰胺糖链的混合物所含的该天冬酰胺糖链中，获得天冬酰胺糖链衍生物混合物的工序，以及(b)将该天冬酰胺糖链衍生物混合物或该天冬酰胺糖链衍生物混合物含有的天冬酰胺糖链衍生物水解后得到的混合物进行层析，对各天冬酰胺糖链衍生物进行分离的工序，以及(c)除去工序(b)中分离的天冬酰胺糖链衍生物的保护基后，得到天冬酰胺糖链的工序。(7)上述(6)所述天冬酰胺糖链制造方法，还包括(b’ )用糖水解酶对在工序(b)中分离的天冬酰胺糖链衍生物进行水解的工序和 /或(c’ )用糖水解酶对在工序(C)中得到的天冬酰胺糖链进行水解的工序。(8)上述(6)或(7)所述天冬酰胺糖链制造方法，其中含有1种或2种以上天冬酰胺糖链的混合物是含有下述式(A)化合物和/或在该化合物中缺失1个以上糖残基的化合物的混合物。(9)上述(6)-(8)任一项所述天冬酰胺糖链制造方法，其中脂溶性保护基是Fmoc基。(10)上述(6)-(8)任一项所述天冬酰胺糖链制造方法，其中工序(a)是向在含有在非还原末端带有唾液酸残基的1种或2种以上天冬酰胺糖链的混合物中所含该天冬酰胺糖链中导入Fmoc基，而且向唾液酸残基导入苄基后，得到天冬酰胺糖链衍生物混合物的工序。
权利要求
1.一种在肽链的任意位置至少含有1个以上天冬酰胺糖链的糖肽的制造方法，其特征是(1)使带有羟基的树脂(resin)的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酯化反应，(2)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(3)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，(4)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(5)将上述(3)和⑷工序重复1次以上，(6)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护、但全部的羟基没有保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，(7)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(8)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，(9)将上述(7)和⑶工序重复1次以上，(10)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(11)用酸将树脂(resin)切去。
2.在肽链的任意位置至少含有2个以上天冬酰胺糖链的糖肽的制造方法，该方法包括权利要求1所述的方法，其中，适当追加(6)的使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护、但全部的羟基没有保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，及(7) 的脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基的工序。
3.权利要求1所述的在肽链上至少含有1个以上天冬酰胺糖链的糖肽的制造方法，其中，在最后工序进行(6)的使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护、但全部的羟基没有保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，及(7)的脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基的工序。
4.权利要求1所述的糖肽制造方法，其中，取代(6)的工序或除了(6)的工序之外，进行(1)的工序，使带有羟基的树脂(resin)的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护、但全部的羟基没有保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酯化反应。
5.权利要求1所述的糖肽制造方法，其中，权利要求1(6)的天冬酰胺糖链至少含有6 个以上糖残基。
6.权利要求1所述的糖肽制造方法，其中，权利要求1(6)的天冬酰胺糖链含有9-11个糖残基。
7.权利要求1所述的糖肽制造方法，其中，权利要求1(6)的天冬酰胺糖链至少含有6 个糖残基，并且结合2分叉型糖链。
8.权利要求1所述的糖肽制造方法，其中，权利要求1(6)的天冬酰胺糖链是天冬酰胺二唾液酸糖链或天冬酰胺单唾液酸糖链，该唾液酸的羧基被保护基保护。
9.权利要求1所述的糖肽制造方法，其中，权利要求1(6)的天冬酰胺糖链是天冬酰胺连脱唾液酸糖链。
10.权利要求8所述的糖肽制造方法，其中，该唾液酸的羧基的保护基是苄基。
11.权利要求1所述的糖肽制造方法，其中，该脂溶性保护基是9-芴甲氧羰基(Fmoc)
12.权利要求1所述的糖肽制造方法，其中，用粘蛋白结合型糖链代替天冬酰胺糖链的一部分或全部。
13.—种可通过权利要求1所述的方法获得的、在肽链的任意位置至少含有1个以上的天冬酰胺糖链或粘蛋白结合型糖链的糖肽，该天冬酰胺糖链是从天冬酰胺二唾液酸糖链和天冬酰胺单唾液酸糖链中选择的至少1种以上，该唾液酸的羧基被保护基保护。
14.一种在肽链的任意位置至少含有1个以上天冬酰胺糖链，而且在末端带有唾液酸或其衍生物残基的糖肽的制造方法，所述方法包括(1)使带有羟基的树脂的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酯化反应，(2)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(3)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，(4)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(5)将上述(3)和⑷工序重复1次以上，(6)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护、但全部的羟基没有保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，(7)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(8)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，(9)将上述(7)和⑶工序重复1次以上，(10)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(11)用酸将树脂切去，及(12)利用唾液酸转移酶使唾液酸或其衍生物转移到得到的糖肽上。
15.权利要求14所述的糖肽制造方法，其中，在上述工序(11)的用酸切去树脂之前使标记试剂与树脂反应。
16.权利要求15所述的糖肽制造方法，其中，标记试剂是丹酰卤化物。
17.—种5-乙酰胺-3,5,7-三脱氧-7-氟-D-甘油基-β -D-半乳糖-2-吡喃壬酮糖酸的制造方法，其特征是，使N-乙酰基-4-脱氧-4-氟-D-甘露糖胺、丙酮酸钠、牛血清白蛋白和唾液酸醛缩酶反应。
18.—种5-乙酰胺-3,5,7-三脱氧-7-氟-D-甘油基-β -D-半乳糖-2-吡喃壬酮糖酸的制造方法，其特征是，在乙酸酐存在下，对苄基2-叠氮-2，4- 二脱氧-4-氟-β -D-吡喃甘露糖苷加氢，得到N-乙酰基-4-脱氧-4-氟-D-甘露糖胺，然后使其与丙酮酸钠、牛血清白蛋白和唾液酸醛缩酶反应。
全文摘要
至少含有1个以上天冬酰胺糖链的糖肽、其制造方法以及用上述方法可以得到的糖肽，其特征在于，(1)使带有羟基的树脂(resin)的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酯化反应，(2)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(3)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸或天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，(4)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(5)将上述(3)和(4)工序重复1次以上，(6)用酸将树脂(resin)切去。
文档编号C07K5/103GK102241743SQ20111011531
公开日2011年11月16日 申请日期2003年7月4日 优先权日2002年7月5日
发明者梶原康宏 申请人:大塚化学株式会社, 梶原康宏