专利名称：一种蛇毒灭活方法及由此制得的灭活蛇毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及毒性灭活技术领域，特别涉及蛇毒灭活技术领域，具体是指一种蛇毒灭活方法及由此制得的灭活蛇毒。
背景技术：
抗蛇毒血清的研究已有100多年的历史。首先应用于临床的是在印度制备的抗眼镜蛇毒血清。以后，世界上就有许多科学工作者从事这一研究工作。目前，世界上有20多个国家30多个机构利用60多种毒蛇的蛇毒生产抗蛇毒血清，现有近百种单价和多价抗蛇毒血清在临床上使用。但是到目前为止，均存在免疫效价低，有效抗体少，需要使用的剂量大的缺陷，从而导致在临床应用中副反应大这一重大问题。我国早在1923年，台湾地区研制抗蛇毒血清。1969年，上海生物制品研究所开展抗蛇毒血清的研制工作。第一个对象是对分布广、危害大、占蛇伤大多数的蝮蛇进行研究， 将抗原(蛇毒)用化学方法进行减毒处理，然后对马匹进行免疫，获得满意的抗毒素效价。 在1970年，由浙江医科大学和浙江省中医研究所承担了临床验证，结果证明精制抗蝮蛇毒血清疗效显著，深受病者和医务工作者的欢迎。以后又相继研制成抗五步蛇、抗银环蛇、抗眼镜蛇等抗血清。抗蛇毒血清的研制成功，为我国填补了空白，克服了中草药治疗蛇伤的疗效不佳的缺点，挽救了大量蛇伤病人的生命，取得了巨大的社会效益。园斑蝰蛇(Vipera russelli Venom)主要分布于我国广东、广西、福建。台湾等华南地区，是我国的主要毒蛇品种，国外东南亚分布较广，常见于马来西亚、越南、泰国、缅甸、 柬埔寨等国。园斑蝰蛇蛇毒属于血液毒，蝰蛇咬伤后患者发病迅速，死亡率高，可造成人体残疾。对野外从事林业、农业生产的工作者危害极大。近年来随着养蛇业的扩大，在饲养过程中发生蝰蛇咬伤的意外事故日益增多。蝰蛇的排毒量多、毒性强，一旦被咬伤，发病迅猛，病情凶险，死亡率高。所以对研制相应特效治疗血清显得极为迫切。国外已有抗蝰蛇毒血清产品上市，主要针对分布于欧洲的蝰蛇种类制备，已生产使用的蝰蛇毒血清有河蝰、毒蝰、极北蝰、草原蝰抗血清等。英国药典1993年版第二卷记载的河蝰、毒蝰、极北蝰、草原蝰抗血清的效价分别为抗河蝰(Vipera ammodytes Venom)抗血清每毫升中和效价不低于IOOLD5tl，抗毒蝰(Vipera aspis Venom)抗血清每毫升中和效价不低于IOOLD5tl，抗北极蝰 (Vipera berus Venom)抗血清每毫升中和效价不低于50LD5(1，抗草原蝰(Vipera ursinsi Venom)抗血清每毫升中和效价不低于150LD5。。国外现有的产品主要是基于欧洲分布的蝰蛇种类制备的，由于不同种类、不同地区的蝰蛇蛇毒抗原特异性具有种属差异和地域差异，国外蝰蛇抗血清用于治疗我国蝰蛇咬伤患者，针对性差，疗效不明显；另外蝰蛇排毒量多，毒性强，咬伤后发病迅速，死亡率高，需要高效价的抗血清才能中和。因此，本领域迫切需要高效价、针对国内分布的蝰蛇蛇毒的抗血清。甲醛常用来灭活病毒制造疫苗，或者用于毒素灭活生产类毒素，是一种经典的灭活方法。目前国内蛇毒灭活方法是甲醛灭活法，此法系将毒素和甲醛混合或对甲醛透析3-7天或更长时间进行脱毒，导致高度交联的蛇毒(Wright, G. G.，Duff, J. Τ.，Fiock，Μ. Α.， Devlin, H. B. , Soderstrom, R. L.,1960.Studies on immunity to toxins of Clostridium botulinum. V. Detoxification of purified type A and type B toxins, and the antigenicity of univalent and bivalent aluminium phosphate adsorbed toxoids. J. Immunol. 84，384)。这个脱毒反应比较复杂，涉及赖氨酸与吲哚、苯环、胍、ε -ΝΗ2、酰胺等基团交联形成亚甲基桥。这种交联桥的生成使得蛋白相互链接形成很大的复合物，同时， 这种反应是很难调控和重复，抗原的构象因此而发生改变，部分抗原表位被屏蔽(Visser J，Chapman DS. Snakes and snakebite. Cape Town, Struik，1978)。灭活毒素不像天然毒素，失去了部分能产生中和作用抗体的表位。表现为免疫后抗体的滴度很高，但是仅有很小一部分抗体具有中和蛇毒活性(WHO Guidelines for the Production, Control and Regulation of Snake Antivenom Immunoglobulins. 2008)。甲酸处理过的灭活蛇毒禾口抗蛇毒血清混合培育后，这些血清仍能中和蛇毒毒性，这从另外一个方面说明甲醛灭活抗原的构象发生了重大的变构。蛇毒有血液毒和神经毒等，神经毒素分子量小，毒性大，免疫原性差，既不容易脱毒又很难免疫获得高中和活性的抗体。同时，甲醛灭活是不完全的，有部分抗原的毒性位点未被消除，毒性没有完全被去除。甲醛灭活蛇毒免疫动物时反应很大，注射后常出现颤抖，发热，甚至出现神经和血液系统的症状，而导致死亡。用甲醛灭活的蛇毒免疫马等大型动物，需要大剂量抗原才能产生可用于治疗的抗毒素效价。这种方法使得动物不能耐受，也成为我们抗毒素生产中一个瓶颈。总之，甲醛灭活蛇毒仍保管蛇毒的部分毒性、蛇毒抗原构象改变、抗原性下降，导致动物免疫时不能耐受，获得的中和抗体效价低。需要研究一种温和的方法来灭活蛇毒，这种方法灭活的蛇毒蛋白其构象不发生明显变化，保留着天然蛇毒的关键性抗原表位，免疫后可以产生高效价中和抗体。同时高保真的蛇毒的应用，得以降低动物免疫用的抗原用量， 动物的副反应明显降低，体质获得提高，免疫系统的功能可以正常发挥，比较迅速地产生高滴度的中和抗体。因此，需要提供一种蛇毒灭活方法，使得蛇毒蛋白构象不发生明显变化，保留天然蛇毒的关键性抗原表位，从而灭活后的蛇毒免疫后可以产生高效价中和抗体，且降低免疫用的抗原用量，减少副反应，高滴度中和抗体产生迅速。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明的目的是提供一种蛇毒灭活方法及由此制得的灭活蛇毒，该蛇毒灭活方法设计新颖，可以使得蛇毒蛋白构象不发生明显变化，保留天然蛇毒的关键性抗原表位，从而灭活后的蛇毒免疫后可以产生高效价中和抗体，且降低免疫用的抗原用量，减少副反应，高滴度中和抗体产生迅速，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种蛇毒灭活方法，其特点是， 采用蛋白烷基化试剂烷基化蛇毒，从而灭活所述蛇毒。所述烷基化可以在任何合适的条件下进行，较佳地，所述烷基化在可逆变性条件下进行。所谓“可逆变性条件”是指在烷基化时使蛇毒蛋白变性，在烷基化反应结束后使蛇毒蛋白复性的条件。更佳地，所述可逆变性条件通过蛋白变性剂和蛋白还原剂实现。所述蛋白变性剂可以是尿酸，所述蛋白还原剂可以是巯基乙醇。
为了保证反应的充分进行，较佳地，所述烷基化是在20-40°C避光培育1-10小时完成。所述蛋白烷基化试剂是碘乙酰胺。通常蛋白烷基化试剂、蛋白变性剂和蛋白还原剂配制在一起形成溶液，例如配制碘乙酰胺溶液，溶液内含碘乙酰胺在100-200mM范围；溶液内含EDTA在0. 8-1. 5mM范围；含氯化钠在2000_2700mM范围；含尿素在1700_2700mM范围；含TRIS在40-70mM范围；溶液用盐酸调pH至7. 5-8. 5范围内。为了保证反应的顺利进行，所述烷基化在蛇毒用缓冲液中进行。所述蛇毒用缓冲液的缓冲离子的浓度为20-50mM范围，pH在7. 8-8. 2之间。所述蛇毒用缓冲液是磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或Hepes缓冲液。为了使获得高效价的抗毒素，需要优质的蛇毒，蛇毒的采取和保存对免疫的成功率起很重要的作用。蛇毒通常选择健康的毒蛇，雌雄毒蛇各占50%，蛇毒采取后立即置冰浴，新鲜毒液低温2000-2500rpm离心15分钟左右去除杂质，接着用0. 22微米的除菌过滤膜进行除菌过滤，过滤后的上清冻干成干粉状备用。使用时加注射用水稀释到需要的浓度进行蛇毒灭活实验。也可以小瓶分装，_80°C保存。为了取得较好的灭活效果，一般采用蛇毒用缓冲液进行稀释。调节到每毫升0. 5 毫克-20毫克蛇毒蛋白浓度范围。所述蛇毒可以是任何蛇毒，较佳地，所述蛇毒是蝰蛇或蝮蛇、眼睛蛇、五步蛇、银环蛇蛇毒。例如园斑蝰蛇蛇毒。采用上述浓度的蛇毒溶液和碘乙酰胺溶液混合进行灭活时，一般1毫升蛇毒溶液加2-4毫升碘乙酰胺溶液。使这两种溶液充分搅拌混勻，置20-40°C避光培育，较佳地选用 30-37°C避光培育。培育时间选择在1-10小时之间，较佳地在2-7小时之间，更佳地在3_4 小时之间。反应完成后，溶液须除去残留的碘乙酰胺、尿素等化学物质同时更换缓冲液。为达到上述目的，可选择透析、超过滤或柱层析等方法。由于蛇毒含有小分子多肽，需选用截留值为I的透析膜或I的超滤膜以防止小分子多肽(主要是神经毒素)穿透流失。如选用柱层析，可选用kphadex G50凝胶。所用的缓冲液可选磷酸缓冲液、TRIS缓冲液或HEPES 缓冲液等，缓冲液的PH可选择在6. 8-7. 2之间；缓冲对的浓度在在SO-IOOmM之间；缓冲液内可含有氯化钠，其浓度在在100-200mM之间。灭活脱毒后的蛇毒样品需低温保存，较佳地保存在_20°C。在本发明的第二方面，提供了一种灭活蛇毒，其特点是，采用上述的蛇毒灭活方法制得。常规甲醛灭活蛇毒时，所用的处理方法是将待灭活的蛇毒冻干粉用注射用水稀释 5 10倍(w/v)，加入0. 3 1. 0% (ν/ν)福尔马林，充分混勻后密闭，室温放置3 10天进行灭活。在制备马抗蛇毒抗毒素的生产中，均应用此法获得的灭活蛇毒作为免疫抗原来免疫马匹。为了检查上述灭活蛇毒的方法是否有效灭活蛇毒的毒性，选用LD5tl来检测。LD5tl 方法按照中国药典2010版用Blliss简化几率单位法进行，未处理的蛇毒和用上述方法处理的蛇毒均用硼酸缓冲盐稀释，每个稀释度之间的比值衡定，首先进行预试验调节蛇毒的用量，使得所用的蛇毒的最高剂量组小鼠的死亡率接近100%，最小剂量试验组的死亡率为 0%。试验用小鼠的体重为18-20克之间，每剂量试验组小鼠6只，每只腹腔注射0.細1，应注意勿使注射液流出。试验小鼠每日观察一次，并记录发病及死亡情况，共观察72小时。
灭活蛇毒的免疫效果为了比较两种灭活方法的效果，采用家兔进行免疫实验，取10只家兔，随机分成2 组，每组5只。第一组免疫甲醛灭活蝰蛇蛇毒。取甲醛灭活蝰蛇蛇毒(0.5毫克/毫升)，与等体积羊毛脂石蜡油佐剂充分混勻，每只家兔皮下注射2毫升；每隔10天重复注射同剂量用等量福氏非完全佐剂混勻的蝰蛇蛇毒，共注射4次。最后一次免疫10天后采血分离血清进行效价实验。抗血清的保护作用ED5tl本发明用小鼠中和试验方法来标定抗血清的效价。受试小鼠为昆明小鼠，体重 18-20克范围内，每组6只，小鼠随机分配。免疫血清效价的测定采用固定蛇毒量、改变血清剂量的方法，即取1毫升蛇毒(5LD50)加入1毫升含不同稀释浓度的抗蛇毒血清溶液，混合后置37°C1小时，注射小白鼠体内作中和反应测定之，注射后观测72小时，以含抗血清最高稀释度剂量动物不死亡为中和终点，计算1毫升血清中和蛇毒数量。本发明的有益效果在于本发明的蛇毒灭活方法采用蛋白烷基化试剂烷基化蛇毒，从而灭活所述蛇毒，可以降低蛇毒的毒性10，000倍，几乎达到测不到毒性的程度，但仍然保留着天然毒素的表位，这些表位对产生中和抗体是必需的，本法获得的灭活毒素免疫动物获得的中和抗体效价比甲醛灭活的要高一倍以上，从而克服了甲醛常规灭活蛇毒引起的抗原偶联、抗原表位的变构、屏蔽以及毒素灭活不彻底导致的动物对甲醛灭活毒素的耐受性差，免疫效果不显著，中和抗体产生的滴度低，治疗所需的抗血清量大等问题，本发明提供了一种快速、有效的、可用于产生高中和效价抗体的蛇毒灭活方法，设计新颖，可以使得蛇毒蛋白构象不发生明显变化，保留天然蛇毒的关键性抗原表位，从而灭活后的蛇毒免疫后可以产生高效价中和抗体，且降低免疫用的抗原用量，减少副反应，高滴度中和抗体产生迅速，适于大规模推广应用。
图1是天然蛇毒与采用本发明的蛇毒灭活方法利用碘乙酰胺灭活的蛇毒的 SDS-PAGE电泳结果。从左到右1.天然蛇毒50微克；2.天然蛇毒25微克；3.碘乙酰胺灭活蛇毒50微克；4.碘乙酰胺灭活蛇毒25微克；5.蛋白分子量标准，从上到下依次为116、 94、67、45、30、20、14kd。图2是采用甲醛灭活的蛇毒的SDS-PAGE电泳结果。从左到右，1.蛋白分子量标准，从上到下依次为116、94、67、45、30、20、14kd ;2.甲醛灭活蛇毒6. 25微克；3.甲醛灭活蛇毒12. 5微克；4.甲醛灭活蛇毒25微克；5.甲醛灭活蛇毒50微克。
具体实施例方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特列举以下具体实施例详细说明。然而，具体实施例仅仅是用于举例说明，而不是对本发明的限制。实施例1.碘乙酰胺方法灭活园斑蝰蛇蛇毒园斑蝰蛇蛇毒购自广州蛇毒研究所，系冻干毒素。精确称取100毫克冻干毒素， 溶于1000毫升50mM pH7. 8Tris缓冲液，待蛇毒溶解后离心4000rpm 30分钟，除去沉淀颗粒物质，上清缓缓倒入3000毫升含碘乙酰胺溶液(50mM Tris, 1. 33mM EDTA, 2. 67M NaCl,2. 67M尿素，266. 7mM碘乙酰胺pH 8. 0)，充分混勻后置37度水浴箱避光反应3小时。反应结束后用分子量截留值3000d的Millipore板式超滤器超过滤，同时更换缓冲为pH7. 0，50mM Tris,0. 15M氯化钠缓冲液，最终蛋白浓度浓缩到1毫克/毫升，低温保存备用。实施例2.甲醛法灭活园斑蝰蛇蛇毒取上述冻干蛇毒100毫克加入5毫升磷酸缓冲液，配制成每毫升含20毫克蛇毒的溶液，在此蛇毒溶液中加入50微升福尔马林，摇勻后置室温处理7天进行灭活；得到的灭活减毒蛇毒作为免疫抗原。实施例3. SDS-PAGE比较两种不同方法灭活蛇毒的电泳特性灭活蛇毒和甲醛灭活的SDS-PAGE比较蛇毒经碘乙酰胺处理并透析后用还原(添加beta-巯基乙醇)的方法在SDS-PAGE上用150V电压进行分离(12. 5%分离胶，4%成层胶)(图1)，甲醛灭活的蛇毒用还原的方法在SDS-PAGE上用150V电压进行分离(12. 5%分离胶，4%成层胶)(图2)，电泳分离后凝胶用考马氏亮蓝R-250染色。从SDS-PAGE上可见甲醛灭活的蛇毒形成高分子聚合物，与图1的碘乙酰胺处理前后的蛇毒相比，其分子量明显增大，而且弥散，表明蛋白相互间发生交联，即使在SDS和还原剂存在下加热100度都不能使之解聚，而用本发明所述方法处理的蛇毒保持了基本的分子量，比未处理的蛇毒分子量稍许增大，但是蛋白分布于未处理的蛇毒相似，未见相互间的交联。实施例4.灭活蛇毒的LD5tl比较LD50初步确定实验选择体重18-20克小鼠进行蛇毒毒力初步确定试验。用生理盐水稀释蛇毒至不同的浓度，每个浓度取0. 5毫升腹腔注射一只小鼠，注射48小时观测小鼠的成活状况。根据预初试验的结果，初步推断出蛇毒致死的剂量。LD50 试验选择体重18-20克小鼠进行蛇毒毒力试验，每6只分成一组，所需组数则根据试验需要而定。采用Blliss简化几率单位法测定蛇毒毒力，以半数致死量LD5tl表示。未经灭活蛇毒、甲醛灭活蛇毒、碘乙酰胺灭活蛇毒根据预初试验的结果把剂量调节至使用最高剂量时小鼠的死亡率接近100 %，最小剂量时小鼠的死亡率接近0 %，在最高剂量和最低剂量之间添加3-5个剂量组，各剂量组之间的比值衡定。注射蛇毒后观察48小时，记录小鼠的成活状况，结果见表1。未经处理的蝰蛇蛇毒的LD5tl为0. 69mg蛇毒/kg小鼠体重；甲醛灭活蝰蛇蛇毒的LD5tl为71mg蛇毒/kg小鼠体重；碘乙酰胺灭活蛇毒的LD5tl为8000mg蛇毒/kg 小鼠体重。表1 蛇毒LD50结果
权利要求
1. 一种蛇毒灭活方法，其特征在于，采用蛋白烷基化试剂烷基化蛇毒，从而灭活所述蛇
2.根据权利要求1所述的蛇毒灭活方法，其特征在于，所述烷基化在可逆变性条件下进行。
3.根据权利要求2所述的蛇毒灭活方法，其特征在于，所述可逆变性条件通过蛋白变性剂和蛋白还原剂实现。
4.根据权利要求1所述的蛇毒灭活方法，其特征在于，所述烷基化是在20-40°C避光培育1-10小时完成。
5.根据权利要求1所述的蛇毒灭活方法，其特征在于，所述蛋白烷基化试剂是碘乙酰胺、碘乙酸或碘乙酸盐。
6.根据权利要求1所述的蛇毒灭活方法，其特征在于，所述烷基化在蛇毒用缓冲液中进行。
7.根据权利要求6所述的蛇毒灭活方法，其特征在于，所述蛇毒用缓冲液的缓冲离子的浓度为1-lOOmM，pH在7-10。
8.根据权利要求6所述的蛇毒灭活方法，其特征在于，所述蛇毒用缓冲液是磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或Hepes缓冲液。
9.根据权利要求1所述的蛇毒灭活方法，其特征在于，所述蛇毒的浓度为每毫升0.01 毫克-100毫克。
10.根据权利要求1所述的蛇毒灭活方法，其特征在于，所述蛇毒是蝰蛇或蝮蛇、眼睛蛇、五步蛇、银环蛇蛇毒。
11.一种灭活蛇毒，其特征在于，采用根据权利要求1-10任一所述的蛇毒灭活方法制得。
全文摘要
本发明涉及一种蛇毒灭活方法，其采用蛋白烷基化试剂烷基化蛇毒，从而灭活蛇毒。较佳地，烷基化在可逆变性条件下进行，烷基化是在20-40℃避光培育1-10小时完成，蛋白烷基化试剂是碘乙酰胺、碘乙酸或碘乙酸盐，烷基化在蛇毒用缓冲液中进行，蛇毒的浓度为每毫升0.01毫克-100毫克，蛇毒是蝰蛇或蝮蛇、眼睛蛇、五步蛇、银环蛇蛇毒。还涉及由此制得的灭活蛇毒，本发明的蛇毒灭活方法设计新颖，可以使得蛇毒蛋白构象不发生明显变化，保留天然蛇毒的关键性抗原表位，从而灭活后的蛇毒免疫后可以产生高效价中和抗体，且降低免疫用的抗原用量，减少副反应，高滴度中和抗体产生迅速，适于大规模推广应用。
文档编号C07K1/107GK102241760SQ201110133500
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月20日 优先权日2011年5月20日
发明者孙九如, 李晓, 杨涛, 柏伟, 王静, 范志和, 马祖严 申请人:上海赛伦生物技术有限公司