专利名称：：一种大黄鱼生长激素基因的优化序列及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种合成大黄鱼生长激素基因及其应用。
背景技术：
：毕赤酵母、Pichiei/^astorid表达系统作为一种真核表达系统，不仅具备可高效、严格地调控外源蛋白表达的乙醇氧化酶(AOXl)启动子，而且可以对外源蛋白进行翻译后的加工，有利于表达出高产量的活性蛋白，便于工业化生产。此外分泌型蛋白简化了纯化步骤且糖基化程度低，对人体无明显的抗原性，同时也适合于临床治疗的用途。iPseudoscraenacroceagrowthhormone,pcGH)具有±曾强食欲、提高饲料转化率和促进鱼体生长等作用，且不会对人体产生激素副作用，可望用于解决大黄鱼养殖中存在的生长周期长、饲料利用率低、养殖成本高等问题。因此在鱼类的水产养殖领域有重大的应用价值，日益引起人们的关注。目前已有多种鱼类的生长激素被分离、纯化和表达，且等同于天然GH的生物活性，通过投喂鱼类显示较强的促生长作用。较之天然的鱼类生长激素，基因工程制备的GH具有操作简单、成本低且产量高等优点，易于实现产业化，在水产养殖中具有广阔的应用前景。
发明内容本发明的目的在于提供一种能在毕赤酵母中高效表达的合成大黄鱼生长激素基因，该基因能在毕赤酵母中高效表达重组大黄鱼生长激素，为高效率的工业化生产重组大黄鱼生长激素提供了可行性，并有助于拓宽重组大黄鱼生长激素的应用范围。由于制约外源蛋白表达的主要因素是密码子的使用频率和外源基因序列的A+T组成，因此本发明通过对全基因序列进行优化，使得PcGH序列中相对使用度(relativesynonymouscodeusage,RSCU)大于1.0的密码子达到95%以上，并将AT含量控制在30%-55%之间，使A+T的含量控制在酵母表达的最佳范围内。通过化学方法合成pcGH基因，构建毕赤酵母的表达载体，利用化学转化技术，将该基因整合到毕赤酵母X-33菌株的染色体上并得以成功表达，表达量达到340mg/L。该表达量是目前pcGH表达的报道中表达水平最高的。本发明的特点如下(1)毕赤酵母表达系统较之原核表达系统不仅具有易操作、繁殖快等生产特点，还具备基因表达调控和蛋白修饰功能，大大提高产物的活性。同时，其高效分泌表达质粒在表达外源蛋白过程中可将目的蛋白分泌到胞外，既保持目的蛋白的活性，又简化了基因工程下游繁琐而昂贵的分离纯化等步骤。(2)利用毕赤酵母表达鱼类的生长激素具备应用上的优势，酵母本身营养价值高可作为优质的饲料营养源，有望大规模应用于水产养殖业。(3)考虑到外源基因的密码子主要在翻译水平上影响表达，而毕赤酵母具有自身特殊的密码子偏好。PcGH的密码子不仅经过全面优化，而且控制A+T的含量在毕赤酵母表达的最佳范围内。保证更高的表达量满足生产需要。本发明的显著特点是提供优化的pcGH序列及其在毕赤酵母中的高效表达重组大黄鱼生长激素，有利于大规模的推广应用，具有较好的经济效益。图1为质粒图谱；图2为构建的质粒电泳图3为优化的pcGH序列(a考染结果)和未经优化的序列(b银染结果)在酵母中的表达SDS电泳图4为不同试验组大黄鱼体重(a)、体长(b)变化的比较。具体实施例方式菌种、载体以及试剂为毕赤酵母菌株(P.pastorisx_33)、大肠杆菌(E.coliDH5a)和质粒pPICZaA由福州大学生物工程研究所保存；大黄鱼购自福州市水产技术推广站连江大官坂基地育苗车间；配合饲料为海马饲料公司生产的大黄鱼幼鱼粉状饲料；TaqDNApolymerase,XbaI,XhoI，HindIII,SacI，RNase，T4-DNALigase,1DNA,PlasmidDNAExtractionKit等购自上海Sangon生物工程公司或宝生物工程公司；Tryptone，YeastExtract等购自英国0X0ID公司Jeocin抗生素，购自美国^witrogen公司；琼脂糖胶回收试剂盒购于Qigen公司；其它均为国产分析纯试剂。具体步骤为1.全基因优化合成利用DNAMAN5.22软件分析pcGH基因密码子组成及分布(NucleicAcidsResearch,1986,volume14,page5134,table2)，按照毕赤酵母密码子偏好性，选择毕赤酵母更容易翻译的同义密码子相对使用度(relativesynonymouscodeusage，RS⑶)大于1.O的密码子基因，并将A+T的含量控制在毕赤酵母最佳表达的30%_55%之间，设计出优化的全基因序列。甲醇酵母密码子使用频率表中U等价于T，在RNA中使用U,在DNA中使用T。优化的基因序列为CTCGAGAAAAGACAACAAATCACTGACTCCCAAAGACTTTTCTCTATCGCCGTTTCCAGAGTTCAACACTTGCACTTGTTGGCTCAAAGATTGTTCTCTGACTTCGAATCTTACTTGCAAACTGAAGAACAAAGACAATTGAACAAGATTTTCTTGCAAGACTTCTGTAACTCTGACTACATCATCTCCCCAATCGACAAGCACGAAACCCAAAGATCTTCTGTTTTGAAGTTGTTGTCTATCTCTTACAGATTGGTCGAATCTTGGGAGTTCCCATCCAGATCCTTGTCCGGTGGTTCTGCCCCAAGAAACCAAATCTCCCCAAAGTTGTCTGAATTGAAGATGGGTATCTTGTTGTTGATCAGAGCTAACCAAGACGCTGTTGAAATTTTCCCAGACAACTCTGCTTTGCAATTGGCTCCATACGGTAACTACTACCAATCTTTGTCTGGTGAAGAATCTTTGAGAAGAACTTACGAATTGTTGGCCTGTTTCAAGAAGGACATGCACAAGGTTGAAACCTACTTGACCGTTGCCAAGTGTAGATTGTCTCCAAAGGCTAACTGTACTTTGTGATCTAGAo2.合成基因包括561bp的pcGH成熟肽核酸序列，上下游炀ol/^al酶切位点，Arg、Lys两个碱性氨基酸的密码子，一个终止密码子TGA。全基因序列插入pBluescriptIISK(+)(pBS)穿梭质粒中，设计的基因序列如下:CTCGAGAAAAGACAACA......CTTTGTGATCTAGA(划线部分是pcGH的全基因序列)。3.表达质粒pPICZaA-GH的构建目的基因以及质粒的酶切、回收、连接、感受态的制备、转化大肠杆菌以及克隆子的PCR鉴定，方法参见萨姆布普克J，拉塞尔DW.分子克隆实验指南[M].黄培堂，译.北京科学出版社，2002。根据pcGHcDNA编码序列及克隆和检测的需要，设计相应的上、下游引物。上游引物P15，CTCGAGTGCAGCAAATCACAGAC3’(下划线为IAoI酶切)下游引物P2^yTCTAGACAGGGTGCAGTTAGCTT3’(下划线为IAaI酶切位点，为了使蛋白融合表达下游的6XHis标签，在添加一个损al酶切位点后未添加终止密码子)。引物合成以及阳性克隆子的测序委托上海sangon生物工程技术服务有限公司。4.毕赤酵母的转化、鉴定用内切酶feci单酶切线性化处理阳性克隆子的质粒，PEG1000的方法转入感受态的p.Pastorisx-^0转化子通过抗生素^OCIN抗性筛选的方法获得阳性克隆。以抽提的阳性克隆菌体基因组为模板进行PCR分析进一步确定筛选的p.pastoris中含有pcGH的基因。本发明选用pPICZaA作为表达载体，该载体的核心部分是醇氧化酶基因1(AOXl)的序列，该序列中含有很强的增强子和启动子，有很强的启动作用，其编码的醇氧化酶占分泌蛋白的30%左右，以该基因构建表达载体可以获得外源基因的高效表达。在起始密码子的下游，紧挨着来源于酿酒酵母的a-Factor信号肽序列，该序列能够很好地引导外源蛋白在酵母细胞中分泌和正确修饰，从而表达出有功能的蛋白质，并且载体中Wkocin抗性基因作为选择标记，更易于筛选阳性克隆子。构建的质粒图谱以及电泳结果分别见图1和2。5.大黄鱼生长激素的诱导表达将步骤4筛选的阳性克隆子接种在3mL含IOmg/mlZeocin的YPD培养基中摇培过夜(30°C,200r/min),按照10%接种量扩培，待0D_达到1.O时，加入甲醇至终浓度为1.0%，以后每隔24h补加甲醇至终浓度为1.O%,连续诱导5d。按时间点分别取300ul菌液样品，离心收集上清和菌体，SDS-PAGE分析目的蛋白的表达。经过初步的诱导表达，筛选出较高表达效率的阳性克隆子，于YP培养基(PH=6.0)中培养至对数生长期，1%的甲醇诱导6d，取培养液上清SDS-PAGE检测。结果显示，在22.OkD处出现明显的特异表达带，这与pcGH理论分子量22.0kD结果一致，说明pPICZaA-pcGH在阳性克隆子中得到了成功表达。随着诱导时间的递增，融合蛋白pcGH的表达水平逐渐增高，通过sensiansys凝胶图象分析系统定量分析，诱导5d的重组蛋白达到最高的表达量。组蛋白表达量可达上清总蛋白的80%左右。经考马斯亮蓝法测定重组蛋白含量为340mg/L，该表达量是目前pcGH表达的报道中表达水平最高的。对未进行密码子优化的重组酵母在同等表达条件下pcGH的克隆和表达，银染结果显示最高表达量只有25ug/L，证实了酵母优先利用其偏好密码子，从而在一定程度上提高了翻译效率，大大提高了表达量，证明了该发明方法的优势所在。结果见图3。6.大黄鱼生长激素的投喂实验试验鱼类为大黄鱼，平均体长10.0士0.5cm，平均体重20.0士5.0g，试验前驯养10d。实验将大黄鱼分为6组，50尾/组，用表达的大黄鱼生长激素与配合饲料混合投喂，喂养周期为45天。研究结果表明，利用基因工程技术生产的重组大黄鱼生长激素，具有促生长作用。在0.l%pcGH的剂量下，经过45天的喂养实验后，身长10.0士0.5cm、体重20.0士0.5g的幼年大黄鱼比对照组平均增重提高27.8%。在这种情况下，缩短了养殖周期并降低了成本。权利要求1.一种大黄鱼生长激素基因的优化序列，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种大黄鱼生长激素的表达载体，其特征在于该载体含有权利要求1所述的优化序列。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于将含有权利要求1所述的优化序列的大黄鱼生长激素基因克隆到pPICZaA载体中。4.一种如权利要求2或3所述的表达载体的应用，其特征在于所述表达载体转化到毕赤酵母中，高效表达重组大黄鱼生长激素。5.根据权利要求4所述的表达载体的应用，其特征在于重组大黄鱼生长激素在毕赤酵母细胞的胞内表达或者分泌表达。6.一种如权利要求5所述的重组大黄鱼生长激素在水产养殖中的应用，其特征在于所述重组大黄鱼生长激素的给用方式为注射或口服。全文摘要本发明提供了一种大黄鱼生长激素基因的优化序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明还提供了一种含有该优化序列的表达载体以及将表达载体转化到毕赤酵母中，高效表达重组大黄鱼生长激素的应用。本发明的优化序列及其在毕赤酵母中的高效表达重组大黄鱼生长激素，有利于大规模的推广应用，具有较好的经济效益。文档编号C07K14/61GK102242129SQ20111013528公开日2011年11月16日申请日期2011年5月24日优先权日2011年5月24日发明者刘树滔,陈菁,饶平凡,黄晓南申请人:福州大学