专利名称：一种人肿瘤标志物tbrg4多肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术和医学领域，涉及一种新的人肿瘤标志物TBRG4多肽(transforming growth factor beta regulator),编码 TBRG4 的多核苷酸序列和经重组技术产生该蛋白的方法。本发明还涉及TBRG4蛋白及其编码序列的用途。
背景技术：
目前肿瘤研究的最关键的问题之一即寻找早期检测，诊断分型，治疗监测和预后，以及作为药物靶标的生物标志物。生物标志物(biomarker)是指能被客观测量的，指示正常生理或病理过程，或是机体对于药物反应的物理、化学、生物指标。研究显示，细胞从正常状态转变为肿瘤的过程中，细胞内蛋白表达谱会发生一系列变化。肿瘤标志物就是在肿瘤发生和发展过程中，由肿瘤细胞合成释放或宿主对肿瘤反应性释放的一类物质。它们具有
一定的特异性与灵敏度，可以用作诊断与治疗中的监测指标。目前，已被用于临床的肿瘤标志物还相当缺乏。各国的标志物审核标准略有不同。我国在肿瘤标志物应用方面主要还是参照美国等西方发达国家的标准。以美国为例，每年ASCO(American Society of Clinical Oncology)都会对肿瘤临床所用的生物标志物提出指导性建议。如2007年能用于乳腺癌的标志物包括ER/PR，HER2，uPA/PAIl，和多参数基因表达分析方法(Oncotype DM, MammaPrint等)，并提供了详细的建议使用条件和范围。其余的如Ki67, Cyclin D, Cyclin E, p27, p21,蛋白质组分析等因证据不充分,不被建议使用(参见ASCO网页)。可以看到，在承认这些标志物在改善病人诊断，治疗中的作用同时，目前肿瘤病人的发病率和致死率仍总体上呈上升趋势。这一现象要求更多更好的肿瘤标志物的发现和临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的人肿瘤标志物，具体涉及人肿瘤标志物TBRG4的多肽，该多肽包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性多肽、或其活性衍生物；其编码核酸(RNA)具有SEQ ID NO 5的序列。本发明的另一个目的是提供编码上述RNA，多肽的脱氧核酸序列(DNA) SEQ IDNO 6。本发明的另一个目的是提供上述RNA和多肽的制备方法，以及该RNA，多肽和其编码序列的用途。本发明中，所述的RNA可通过PCR的方式产生；具体的说,可采用SEQ ID NO 3中的引物对，通过聚合酶链式反应，获得序列为SEQ ID NO 5的RNA产物；所述多肽可通过化学合成的方式生产；该RNA和多肽均可用于帮助检测肿瘤的存在。本发明经试验表明，获得了新的可作为肿瘤标志物的基因；该基因的表达产物包括RNA SEQ ID NO :4和蛋白SEQ ID NO :2，所述的多核苷酸SEQ ID NO :4编码具有SEQIDN02的氨基酸序列的蛋白；所述的表达产物在正常细胞和组织中几乎检测不到，在肿瘤细胞和组织中却有很高的表达；且所述的表达量与肿瘤的级别，分化程度，及病人的预后都呈明显正相关；研究结果表明，所述的TBRG4是一特异的肿瘤标志物，在此基础上完成了本发明。具体的说，本发明通过系统地比较来自同一个患者的、不同恶性程度的乳腺癌细胞系，获得了一系列的差异表达蛋白质；所述TBRG4为其中一个新的在肿瘤中特异表达的蛋白质；通过定量PCR和免疫印迹方法，结果显示，恶性程度高的肿瘤细胞系中TBRG4的mRNA及蛋白表达水平均明显高于正常细胞系；同时，通过抗体验证发现TBRG4蛋白在肿瘤病人组织中高表达，正常组织中则表达水平很低(如图I所示)；更进一步，通过免疫组化的方法，本发明对62例正常及乳腺癌肿瘤患者的组织进行实验，结果表明，正常乳腺组织中未见有TBRG4蛋白的表达，而早期乳腺疾病(Hyperplasia，乳腺增生)中则显示有TBRG4的低水平表达；而其在恶性乳腺癌如浸润型导管癌及小叶癌中有着普遍的高表达；上述实验证据表明，所述的TBRG4具有作为早期检测乳腺癌标志物的潜在作用。本发明通过下述方法检测样品中的TBRG4，它包括抽提组织中的RNA，反转录成cDNA，用SEQ ID NO 3的引物序列定量PCR扩增；或，抽提组织中的蛋白质，用特异抗体进
行免疫印记反应，检测蛋白质水平；或，对石蜡包埋的组织，用特异抗体进行免疫组化试验。所述的特异抗体是与TBRG4蛋白特异性结合的抗体。本发明根据TBRG4在肿瘤中的过表达，进行抑制它的表达是否能抑制肿瘤的生长检验设计合成了针对TBRG4的shRNA,并将它克隆到可诱导表达的慢病毒(lenti-viral)载体中；结果显示，抑制TBRG4的表达可显著抑制肿瘤的生长；所述结果进一步证实TBRG4能作为肿瘤治疗的靶标。在本发明的中，提供了模拟、促进、拈抗人TBRG4活性的化合物，以及抑制人TBRG4的表达的化合物。较佳地，该化合物是人TBRG4编码序列或其片断的小分子干扰RNA。将所述的小分子shRNA克隆到pLKO. I.载体中成pLKO. l_shTBRG4.将该载体同包装质粒共转入包装细胞293T以产生病毒。用病毒感染待测肿瘤细胞，结果显示待测肿瘤细胞的生长明显减慢。本发明涉及的TBRG4蛋白及其编码序列，可用于肿瘤的预防、早期检测、预后的判断，以及制备含有安全有效量的上述TBRG4蛋白拈抗剂(如抗体和反义核酸，RNAi等)及药学上可接受的载体的药物组合物。
图I显示了本发明的TBRG4在乳腺癌细胞系和组织中的表达，其中，A :用TBRG4的特异引物进行的定量逆转录PCR，结果以对照基因GAPDH进行标准化表示，图中16N，HME为正常乳腺上皮细胞，其余为乳腺癌细胞；B :乳腺细胞中用免疫印记法检测TBRG4蛋白，细胞标识如A ；C :在正常及癌变乳腺组织样本中用免疫印迹法检测TBRG4蛋白；D :在组织芯片中用免疫组化检测TBRG4蛋白，图为正常，原位癌，和侵袭性癌的示例；上正常；中原位导管癌；下侵袭性癌。图2表明抑制TBRG4表达可显著降低乳腺癌细胞的生长速度及克隆形成能力，其中，A :使用三个TBRG4稳定抑制株细胞及相应对照进行克隆形成实验，所形成的克隆经结晶紫染色并计数；B :使用三个TBRG4稳定抑制株细胞及相应对照进行MTT实验，各细胞株每日生长趋势如左侧图所示，右侧侧免疫印迹图表示各稳定抑制细胞株中TBRG4的表达水平。图3表明抑制TBRG4表达可显著降低乳腺癌细胞的迁移速度，其中，使用三个TBRG4稳定抑制株细胞及相应对照进行细胞迁移实验，穿膜的细胞经结晶染色。
具体实施例方式在本发明的第一方面，提供了新的分离出的差异表达的TBRG4多肽，它包含具有SEQ ID NO : I氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性多肽、或其活性衍生物。实施例I :获得差异表达的TBRG4多肽将从一个患者分离得到的乳腺癌细胞系16N(正常)，NT (原位肿瘤)和MT2(转移肿瘤)中的蛋白质用裂解液(8M urea, 2. 5M thiourea, 65mM DTT,4% (w/v) CHAPS, 0. 5%
(v/v)Biolytes pH 3-10, protease inhibitor cocktail)抽提，定量(RC DC ProteinAssay Kit, Bio_rad公司)后上样先进行一维等电聚焦,完成后接着进行二维SDS-PAGE,结束后银染以显示各蛋白点。经TOQuest软件比对所得差异蛋白点经脱色，干胶，胶内酶切，提肽等步骤，再用液相色谱分离多肽。分离的多肽由LTQ-Orbitrap (Thermo Electron公司)质谱仪进行鉴定。TBRG4为鉴定出的差异蛋白之一，其在16N中低表达，于肿瘤细胞系NT及MT2中高表达，生物信息学分析表明其为一线粒体定位的激酶蛋白。在本发明的第二方面，提供了编码分离的所述多肽的多核苷酸；SEQ ID NO :4。实施例2 :从乳腺癌细胞系中获得编码TBRG4的全长基因用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取MT2乳腺癌细胞系中的总RNA,用PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa 公司)将总 RNA 反转录成 cDNA ;以合成的cDNA为模板，设计含酶切位点的TBRG4克隆基因正向引物5’-CAGGGATCCATGGCAGCTCACCTGGTAAA-3’ 和反向引物 5’ -GACTCTAGATCACTTGGCCAGCTCCTC-3’，用热启动 Taq DNA 聚合酶(TaKaRa公司)进行PCR反应，反应条件为98度预变性2分钟，然后95度10秒，55度退火2分钟，72度40秒进行延伸反应，反应30个循环；将PCR产物和pcDNA3. O-HA-FLAG空载体分别进行BamHI和Xba I分步单酶切、连接以及DH5 α细菌的转化实验，得到TBRG4基因转化的阳性克隆，待DNA测序确定基因序列无误后得到pcDNA3. 0-HA-FLAG-TBRG4载体。在本发明的第三方面，提供了模拟、促进、拈抗人TBRG4活性的化合物，以及抑制人TBRG4的表达的化合物。较佳地，该化合物是人TBRG4编码序列或其片断的小分子干扰RNA。将所述的小分子shRNA克隆到pLKO. I.载体中成pLKO. l_shTBRG4.将该载体同包装质粒共转入包装细胞293T以产生病毒。用病毒感染待测肿瘤细胞，结果显示待测肿瘤细胞的生长明显减慢。实施例3 TBRG4小分子干扰RNA抑制肿瘤的生长及迁移同时使用 Broad Institute 网站的 Public TRC Portal 及 Invitrogen 公司BL0CK-iT RNAi Designer在线设计TBRG4 shRNA ;综合两者搜索结果得到针对TBRG4基因不同位置的六对shRNA序列；将合成的oligo退火后连接入经Age I与EcoR I双酶切的pLKO. I载体，挑取阳性克隆即为pLKO. l-shTBRG4载体。基于此慢病毒载体，本发明将其与包装质粒PSPAX2和pMD2. G共转染HEK-293T细胞以包装病毒；转染48小时后收取培养基，除去残留细胞后即为慢病毒原液；将病毒液与polybrene混合后加入对数期生长的细胞，孵育12小时后弃病毒液，24小时后加入puiOmycin筛选即得TBRG4稳定抑制细胞株细胞。取经免疫印迹验证抑制效果较好的三个TBRG4稳定抑制细胞株细胞(sh3，sh4,sh5)及相应pLKO. I对照细胞，以每孔2000个细胞的密度接种于96孔板中，之后每隔24小时使用MTT法或直接进行细胞计数测量细胞生长状况；结果表明，TBRG4表达的抑制显著降低了细胞的生长速度。以500或250每孔的细胞量接种上述三种TBRG4稳定抑制细胞及对照细胞至六孔板中，三至四周后使用结晶紫染色衡量其克隆形成能力。结果表明下调TBRG4的表达显著降低了乳腺癌细胞的克隆形成能力(如图2所示)。同样应用上述三种TBRG4稳定抑制细胞及对照细胞，接种每孔50000细胞至Transwell装置(Corning)的上层小室中，同时在下层加入含10% FBS的培养基以吸引细胞穿膜。8小时后切下膜，并进行结晶紫染色，显微镜下观察到的结果表明TBRG4的抑制显著降低了细胞的迁移能力(如图3所示)。在本发明的第四方面，提供了含有上述小分子干扰RNA的载体和病毒。载体和病毒的产生过程已在实施例3中详述。在本发明的第五方面，提供了检测样品中是否存在TBRG4的方法，它包括抽提组织中的RNA，反转录成cDNA，用设计合成的引物序列(SEQ ID NO 3)进行定量PCR扩增。另一检测蛋白质水平的方法是抽提组织中的蛋白质，用特异抗体进行免疫印记反应，检测蛋白质水平；或，对石蜡包埋的组织，用特异抗体进行免疫组化试验。还提供了检测肿瘤的方法，包括对样品进行上述的定量PCR试验,免疫印记试验或免疫组化试验,结果高于本底水平的个体患有肿瘤或肿瘤易感性高于正常人群。实施例4 :定量PCR检测TBRG4的mRNA水平按照质谱鉴别出的蛋白相应序列和NCBI网站上的基因序列信息(accessionnumber NM_004749. 2),用 primer3 软件(http://frodo.wi.mit. edu/primer3/input, htm)设计TBRG4引物。获得的上游引物序列，为5’-TCCGGCTCTCTCACTTGCTGT-3’，下游引物序列为5’-GGTACCATGCCAGACCGAGGC-3’。引物设计时针对TBRG4的三种isoform以保证qPCR结果完全反映细胞内TBRG4的mRNA水平。定量PCR的内参为GAPDH基因。所用的GAPDH基因的上游引物为 5’ -cgagatccctccaaaatcaa-3’，下游引物为 5’ _ttcacacccatgacgaacat_3’。用Trizol提取总RNA，经分光光度计(260nm/280nm)测RNA的浓度和纯度。用3 μ g总RNA和 oligo dT 引物经PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit 进行反转录(TaKaRa)。在 25 μ I 定量 PCR 反应体系中，加入 75ng cDNA 模板，I X SYBR Premix Ex Taq (PerfectReal Time ；TaKaRa)和各200nM的引物。用iQ5定量PCR仪(Bio-rad公司)进行扩增反应。反应程序为95°C初始变性10秒，两步法进行40个循环，95°C，5秒变性，60°C退火，延伸20秒。用iQ5 (Bio-Rad) v2. O版本软件在相对定量模式下进行数据定量分析。图IA为定量PCR实验的一个结果，用细胞系RNA，发现正常细胞16N，HMEC及MCF10A中TBRG4 mRNA的表达水平很低，而肿瘤细胞，如NT，MT2，MCF7和MDA231中其表达量显著高于正常细胞。实施例5 :免疫印迹和免疫组化检测TBRG4蛋白应用TBRG4的抗体(兔抗人TBRG4抗体，PTGLAB公司)，在细胞和组织中进行免疫印迹和免疫组化实验。在免疫印迹中，用10%浓度的SDS-PAGE凝胶分离大约30yg总蛋白，然后转移到PVDF膜(Amersham Bioscience公司)上。用含5% BSA的TBST缓冲液(137mM NaCl, 20mM Tris-HCl pH7. 6,0. 1% Tween 20)封闭 PVDF 膜，与 TBRG4 抗体室温孵育一小时或者4度孵育过夜，洗涤，HRP偶联的二抗孵育。洗好的膜加上超敏化学发光液(Amersham Bioscience)显影，经LAS-3000成像系统成像(Fuji, Japan)。使用Multi GaugeV3. O (Fuji公司，Japan)软件对免疫印迹的条带定量。图IB为免疫印迹实验在细胞系中的结果。β-actin抗体(鼠抗人β-actin抗体,PTGLAB公司)作为上样的对照。实验表明，在正常乳腺上皮细胞，16N, HMEC和MCFlOA中，TBRG4处于很低的表达水平，而在乳腺癌细胞MCF7, MDA231, NT和MT2中，TBRG4的表达水平显著增高。在免疫组化实验中，经福尔马林固定和石蜡包埋的组织芯片购自US Biomax公司(CA，U. S. A. Catalog TMA-BR480)。切片经脱蜡和水化后，经O. OlM柠檬酸盐缓冲液(pH6. O)水煮修复抗原。与I : 100稀释的TBRG4—抗4度过夜孵育。再由抗兔的HRP聚合体检测系统检测，Olympus BX51显微镜系统成像。图IC示例了正常，原位导管癌，和侵袭性癌的免疫组化染色。由两个研究人员对染色的组织芯片进行评分，每个样本按染色强度分为无，低，中，高四档，分别对应0-3分；再根据着色面积打分，0-5%为O分，5-25%为I分，25-50%为2分，50-75%为3分，75%以上为4分。强度分与面积分相加即为最后得分。所得数据用Student’ s paired t-test及Spearman rank sum test方法进行统计学显著性检验。结果显示，正常组织中不表达TBRG4蛋白，其最早在早期乳腺疾病，乳腺增生中有部
分表达。而在浸润型导管癌和小叶癌中，TBRG4存在着普遍的高表达，且其表达水平随乳腺癌等级升高而递增。结果表明，TBRG4能作为乳腺癌预防和早期检测的标志物。在本发明的第六方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途；用途包括用多肽免疫动物获得针对多肽的抗体，再通过抗体检测蛋白的表达；可通过血液，组织，及其他体液(如乳腺吸液，nipple aspirate)进行检测。编码序列的作用包括通过其设计引物，探针，及siRNA，shRNA等用于检测DNA，RNA的表达，突变，和由于抑制基因表达达到抑制肿瘤生长的治疗效果。所述用途在实施例3、4、5中有所描述。在本发明的第七方面，提供了一种药物组合，它含有安全有效量的本发明的人TBRG4拈抗剂以及药学上可接受的载体；优选的拈抗剂是小分子干扰RNA序列；这些药物组合物可治疗肿瘤。具体的是，用pLKO. I载体构建成的pLKO. l-shTBRG4,以及用其产生的缺陷病毒。这些结果在实施例3中有所描述。在本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
权利要求
1.一种人肿瘤标志物TBRG4多肽，其特征在于，该多肽包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性多肽、或其活性衍生物；其编码核酸具有SEQ IDNO 5的序列。
2.—种TBRG4蛋白，其特征在于，该蛋白具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO :4的序列，其编码权利要求2的蛋白。
4.一种DNA，其特征在于，具有SEQ ID NO 6的结构，其编码权利要求I的RNA及多肽。
5.一种化合物，其特征在于，该化合物为拈抗人TBRG4活性拈抗剂，它含有权利要求I的人TBRG4编码序列或其片断的小分子干扰RNA。
6.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求5的化合物及药学上可接受的载体。
7.一种能与权利要求I或权利要求2所述的TBRG4蛋白特异性结合的抗体。
8.一种检测样品中TBRG4的方法，其特征在于，它包括抽提组织中的RNA，反转录成cDNA，用SEQ ID NO :3的引物序列定量PCR扩增；或，抽提组织中的蛋白质，用特异抗体进行免疫印记反应，检测蛋白质水平；或，对石蜡包埋的组织，用特异抗体进行免疫组化试验。
9.权利要求I的TBRG4多肽及其编码序列在制备检测肿瘤标志物或肿瘤治疗靶标中的用途。
10.权利要求2的蛋白及其编码序列在制备检测肿瘤标志物或肿瘤治疗靶标中的用途。
11.按权利要求9或10的用途，其中所述的肿瘤是乳腺癌。
全文摘要
本发明属生物技术和医学领域，涉及新的人肿瘤标志物TBRG4多肽，编码TBRG4的多核苷酸序列和经重组技术产生该蛋白的方法。本发明还涉及TBRG4蛋白及其编码序列的用途，以及含TBRG4蛋白拈抗剂的药物组合物。经实验显示，所述的TBRG4多肽及其编码序列及该基因的表达产物，在正常细胞和组织中几乎检测不到，在肿瘤细胞和组织中却有很高的表达，且表达量与肿瘤的级别，分化程度以及预后均呈明显正相关。结果表明TBRG4为一特异的肿瘤标志物，能作为乳腺癌的预防和早期检测的标志物或肿瘤治疗的靶标。
文档编号C07K7/06GK102838657SQ20111017475
公开日2012年12月26日 申请日期2011年6月25日 优先权日2011年6月25日
发明者施前, 张伟, 徐晓恩 申请人:复旦大学