专利名称：针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的制备方法
技术领域：
本发明属于免疫球蛋白技术领域，具体涉及一种针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的制备方法。
背景技术：
敏感高效的荧光标记抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体诊断试剂是检测狂犬病病毒的荧光抗体试验(fluorescent antibody test, FAT)成功的关键因素(WHO Technical Report Series 931,WH0 Expert Consultation On Rabies)。一般采用狂犬病病毒全病毒或表达的狂犬病病毒核蛋白作为免疫原制备抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体，单抗的筛选和鉴定工作量较大，但是相对选择空间较大。狂犬病主要危及亚非发展中和不发达国家农村地区民众，因此这些国家对狂犬病实验室诊断技术和产品的需求也最迫切。但目前WHO推荐的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体诊断试剂由FFujirebio Diagnostics Inc.和Millipore公司提供，价格较昂贵，并且来源有限，适合发展中国家普遍实验室条件的狂犬病诊断技术和来源方便的诊断试剂产品是在这些国家提高狂犬病实验室诊断率的重要因素之一，狂犬病流行较严重的国家有必要依据其普遍的实验室水平开发可以方便获取的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体，以确保在既有条件下可以正常开展必需的狂犬病实验室诊断。
发明内容
Lv XJ等已经证实狂犬病病毒核蛋白152到164位氨基酸区段KISGQNTGNYKTN是各血清型狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽(吕新军，马学军.新型抗狂犬病病毒核蛋白抗体进行RFFIT检测效果评估.国际检验医学杂志，2011，32 :721-722.)，在此基础上采用经典杂交瘤细胞技术制备针对该线性表位肽的单克隆抗体株，有可能获得与多个血清型狂犬病病毒反应的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体作为诊断试剂。采用合成肽制备抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体，由于免疫原所含抗原决定簇较少，单抗筛选和鉴定工作相对简单， 理论上获得的单抗株数量也较有限。本发明尝试采用多血清型狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽作为免疫原制备特异性单克隆抗体，并初步用于狂犬病实验室诊断，是开发抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体诊断试剂的一种新尝试。为了解决目前诊断试剂价格昂贵，不适合发展中国家普遍实验条件的问题，同时为了在合成肽制备抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体(单抗)时能够获得大量的单抗，本发明提供了一种针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的制备方法。本发明的技术方案如下—种针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的制备方法，包括下述步骤(1)、多肽的制备在狂犬病病毒核蛋白第152到164位氨基酸区段的N端加C，得到多肽 CKISGQNTGNYKTN ；(2)、免疫原的制备将多肽与已活化的KLH进行耦联，得到免疫原；
(3)、初次免疫取免疫原与弗氏完全佐剂充分乳化，对Balb/c小鼠腹部多点皮下注射免疫；G)、第一次强化免疫初次免疫3周后，取免疫原与弗氏不完全佐剂充分乳化，对 Balb/c小鼠腹部多点皮下注射免疫；(5)、第二次强化免疫初次免疫5周后，取免疫原与弗氏不完全佐剂充分乳化，对 Balb/c小鼠腹部多点皮下注射免疫；(6)、杂交瘤细胞株的筛选取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合，对融合后细胞采用间接ELISA和IFA双重筛选，选择阳性的克隆进行亚克隆，得到产生所述针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的杂交瘤细胞株。上述技术方案中所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的纯化和标记步骤，具体所述纯化和标记步骤为将获得的杂交瘤细胞株腹腔接种Balb/c小鼠，对腹水用DEAE-S^hadex A-50进行柱层析，然后采用 FITC(fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)进行标记。上述技术方案中所述的制备方法，其中，所述步骤O)中的KLH活化过程为将 KLH与交联剂SMCC混合，室温旋转反应30min，使KLH充分活化，用多肽偶联缓冲液平衡的 SephadexG-25柱层析除去游离成分，得到活化的KLH。上述技术方案中所述的制备方法，其中，所述免疫原是将多肽加入已活化的KLH 中室温下旋转反应2小时，耦联好的产物即为免疫原。本发明具有以下有益效果本发明首次采用多血清型狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽作为免疫原制备特异性单克隆抗体，所得的单抗不仅可以经过FITC标记用于FAT，也可以经过HRP标记应用于直接快速免疫组化法(direct rapid immunohistochemical test, dRIT)以及双抗夹心 ELISA法(sandwich ELISAnamed WELYSSA)检测组织标本内的狂犬病病毒；同时本发明的方法不需要特殊的设备，在现有狂犬病流行较严重的国家的现有条件下的普通实验室水平均可进行操作。
1、图1为杂交瘤细胞培养上清IFA检测结果QOO X)；2、图2为阳性克隆接种Balb/c小鼠所得腹水1 200稀释度IFA检测结果 (200X)； 3、图3为SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度；4、图4为FITC标记抗多肽单克隆抗体进行狂犬病病毒感染犬脑组织FAT检测
(200X)ο
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1 一、多肽合成及KLH耦联
多肽合成由上海楚肽生物科技有限公司在ABI 433p印tide synthesizer上合成， 序列CKISGQNTGNYKTN(N端加C)合成总量10mg，5mg/管分装保存；多 Jft 耦联采用 PIERCE 公司 Imject Maleimide Activated Immunogen Conjugation Kit with mcKLH and BSA Kit。具体方法为首先,将 KLH 与交联剂 SMCC 混合，室温旋转反应30min，使KLH充分活化，用多肽偶联缓冲液平衡的kphadexG-25柱层析除去游离成分；然后，将多肽加入已活化的KLH中室温旋转反应池，偶联好的产物作为免疫原免疫动物。二、动物免疫采用上述免疫原以腹部多点皮下免疫方式免疫2只清洁级6w龄成年Balb/c小鼠，实验动物从市场购买或由中国医学科学院实验动物中心提供。开始免疫前经尾缘静脉采血0. anl，分离血清，按照5 μ g/ml采用合成肽包被96孔板，以HRP标记羊抗鼠IgG 二抗进行间接ELISA检测血清抗多肽抗体背景。初次免疫采用完全弗氏佐剂混合免疫原，注射剂量600 μ g/只；初免后3w、5w分别进行第1次、第2次强化免疫，采用不完全弗氏佐剂混合免疫原，注射剂量400 μ g/只。初免后6w再次间接ELISA检测血清抗多肽抗体效价，要求效价高于1 10000方可使用。合成肽对Balb/c小鼠的免疫效果如表1所示，2只Balb/c小鼠免疫前血清检测显示血清背景低，适合进行目的抗原的免疫；3次免疫后血清的间接ELISA检测显示2只小鼠血清内抗多肽抗体效价分别为1 27，000和1 8，1000，选择血清内抗多肽抗体效价较高的小鼠进行后续的单克隆抗体制备。表1间接ELISA检测免疫前后血清OD值结果
权利要求
1.一种针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的制备方法，包括下述步骤 (1)、多肽的制备在狂犬病病毒核蛋白第152到164位氨基酸区段的N端加C，得到多肽 CKISGQNTGNYKTN ；O)、免疫原的制备将多肽与已活化的KLH进行耦联，得到免疫原； (3)、初次免疫取免疫原与弗氏完全佐剂充分乳化，对Balb/c小鼠腹部多点皮下注射免疫；G)、第一次强化免疫初次免疫3周后，取免疫原与弗氏不完全佐剂充分乳化，对 Balb/c小鼠腹部多点皮下注射免疫；(5)、第二次强化免疫初次免疫5周后，取免疫原与弗氏不完全佐剂充分乳化，对 Balb/c小鼠腹部多点皮下注射免疫；(6)、杂交瘤细胞株的筛选取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合，对融合后细胞采用间接 ELISA和IFA双重筛选，选择阳性的克隆进行亚克隆，得到产生所述针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的杂交瘤细胞株。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的纯化和标记步骤，所述纯化和标记步骤为将步骤(6) 获得的杂交瘤细胞株腹腔接种Balb/c小鼠，对腹水用DEAE-Sephadex A-50进行柱层析，然后采用FITC进行标记。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤O)中的KLH活化过程为 将KLH与交联剂SMCC混合，室温旋转反应30min，使KLH充分活化，用多肽偶联缓冲液平衡的kphadexG-25柱层析除去游离成分，得到活化的KLH。
4.根据权利要求1 3中任一权利要求所述的制备方法，其特征在于，所述免疫原是将多肽加入已活化的KLH中室温下旋转反应2小时，耦联好的产物即为免疫原。
全文摘要
本发明一种针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的制备方法，属于免疫球蛋白技术领域。所述方法包括制备免疫原、用免疫原对Balb/c小鼠进行注射免疫和杂交瘤细胞株的筛选步骤。本发明具有首次采用多血清型狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽作为免疫原制备特异性单克隆抗体，所得的单抗不仅可以经过FITC标记用于FAT，也可以经过HRP标记应用于直接快速免疫组化法以及双抗夹心ELISA法检测组织标本内的狂犬病病毒；同时本发明的方法不需要特殊的设备，在现有狂犬病流行较严重的国家的现有条件下的普通实验室水平均可进行操作的优点。
文档编号C07K16/10GK102268087SQ20111017687
公开日2011年12月7日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者吕新军, 唐青, 马学军 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所