专利名称：毕赤酵母壁蛋白Gcw49及其表面展示系统和构建方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw49及其构建的表面展示系统和构建方法。
背景技术：
微生物细胞表面展示技术是一种通过锚定蛋白将蛋白质或多肽固定在细胞表面的技术。微生物细胞表面展示系统包括宿主菌、锚定蛋白和靶蛋白，有时在锚定蛋白和靶蛋白之间也添加一段连接(linker)序列。微生物细胞表面展示在多肽分离、全细胞催化剂、 全细胞吸附剂、疫苗和抗体生产、蛋白文库筛选、生物传感器、生物修复等方面都有广阔的应用前景。目前在微生物表面展示系统中应用比较多的宿主菌主要有噬菌体、细菌(如大肠杆菌Esctwrichis. coli、奇异变形菌Proteus mirabilis 等)、酿酒酵母 QSaccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母QPichia pastor is)。表面展示使用的锚定蛋白一般具有以下特征(1)较牢固地锚定在细胞表面，不会轻易地从细胞表面脱落；(2)可以与靶蛋白序列有效融合而不影响靶蛋白的结构和功能；(3)对蛋白酶有一定的抗性。细菌表面展示系统的锚定蛋白主要有细菌菌毛蛋白、S层蛋白、冰核蛋白(INP)和一些外膜蛋白。酿酒酵母表面展示系统的锚定蛋白主要有凝集素系统、絮凝素系统和其它GPI锚定 (glycosylphosphatidylinositol anchored)蛋白系统和一些Pir蛋白系统。巴斯德毕赤酵母具有可以实现高密度发酵(细胞密度可高达140g/L)、蛋白适度糖基化和发酵培养基组成简单等优点，在微生物细胞表面展示方面的应用具有非常广阔的前景，目前已有许多种蛋白，如解脂耶氏酵母脂肪酶、乳酸克鲁维酵母黄酶、米根霉脂肪酶等已经成功地展示在巴斯德毕赤酵母表面。目前巴斯德毕赤酵母表面展示系统中使用的锚定蛋白主要来自酿酒酵母的凝集素系统、絮凝素系统和kdlp蛋白等。但是，这些锚定蛋白不是毕赤酵母的组成成分，而是通过人为手段外源引进的。因此用外源壁蛋白作为毕赤酵母表面展示系统的锚定蛋白，可能会与内源壁蛋白竞争壁蛋白结合位点，导致展示效率不高。Khasa YP (Khasa YP, et al. Isolation of Pichia pastoris PIR genes and their utilization for cell surface display and recombinant protein secretion. Yeast. 2010. (published online).)等报道了利用毕赤酵母Pir蛋白作为锚定蛋白进行外源蛋白的细胞表面展示。但发明人发现Pir蛋白本身的表达量较低，作为毕赤酵母表面展示系统的锚定蛋白效果一般。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提高用于巴斯德毕赤酵母表面展示系统的内源锚定蛋白的表达效率。本发明解决上述问题的技术方案是一种巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw49，该蛋白的氨基酸序列为SEQ NO :1。本发明所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白由310个氨基酸组成，大小约为32. SKDa0 本发明所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白以共价键的形式结合在巴斯德毕赤酵母细胞壁上，用十二烷基硫酸钠法不能提取，可以用β -1，3-葡聚糖酶法提取。本发明所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw49可用于构建毕赤酵母细胞表面展示系统，所述的巴斯德毕赤酵母细胞表面展示系统是以所述壁蛋白为锚定蛋白将靶蛋白固定在毕赤酵母细胞表面构成的。编码所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW49的基因，核苷酸序列如SEQ NO 4所示。一种巴斯德毕赤酵母细胞表面展示系统，是以所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白 Gcw49为锚定蛋白，将靶蛋白固定在巴斯德毕赤酵母细胞表面构成的。上述巴斯德毕赤酵母细胞表面展示系统可通过以下步骤构建
(1)将权利要求2所述的基因克隆到表达载体的表达盒中，得到以权利要求1所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白为锚定蛋白的表面展示表达载体；
(2)将靶蛋白的基因序列克隆到所述表面展示表达载体的巴斯德毕赤酵母壁蛋白基因序列的上游，与所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白基因形成融合基因；
(3)转化巴斯德毕赤酵母，根据所述表达载体上的筛选标记筛选阳性转化子，即得到表面展示系统。所述靶蛋白为碱性木聚糖酶、米黑根毛霉脂肪酶或南极假丝酵母脂肪酶B。所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GSl 15。上述方法中，所述的表达载体是常用的带有分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母表达载体，如 PPIC9K、pPICZ α A、pPICZ α B、pPICZ α C、pGAPZ α A、pGAPZ α B、pGAPZ α C 等；如果是无信号肽的表达载体，可在靶蛋白基因序列的上游添加分泌信号肽序列。表达载体为pPIC9K时，构建表面展示表达载体后，将靶蛋白的基因序列克隆连接到所述表面展示表达载体的巴斯德毕赤酵母壁蛋白基因序列上游的限制性内切酶酶切位存、EcoR 1与Mlu I之间。本发明相对于现有技术所具有的优点及有益效果。本发明所述的壁蛋白Gcw49是巴斯德毕赤酵母内源壁蛋白，且在毕赤酵母中表达量十分高，与现已用于巴斯德毕赤酵母表面展示系统的内源锚定蛋白Pirl蛋白和Pir2蛋白相比，分别高8倍和19倍。因此，本发明所述巴斯德毕赤酵母可用于构建高表达效率的巴斯德毕赤酵母表面展示系统。
图1.用SDS法和β-1，3-葡聚糖酶法提取巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw49的 Wfestern blot结果。a. SDS法提取壁蛋白Gcw49 ;b. β _1，3-葡聚糖酶法提取壁蛋白 Gcw49。图2 重组菌GS115/GCW49和对照菌GS115的流式细胞仪检测结果。虚线对照菌 GS115 ；实线重组菌 GS115/GCW49。图3 三丁酸甘油酯乳化平板水解圈法检测GS115/GCW49-CALB阳性转化子。a.对照菌 GS115 ；b.阳性转化子 GS115/GCW49-CALB。
图4 荧光显微镜验证融合蛋白GCW49-CALB在毕赤酵母细胞壁表面展示结果。a. GS115/GCW49-CALB的普通光学显微b.GS115/GCW49-CALB 的荧光显微c.对照菌GS115的普通光学显微d.对照菌GS115的荧光显微图。图5 菌体酶活曲线图。其中，令表示重组菌GS115/GCW49-CALB的菌体酶活曲线； ■ "表示对照菌GSl 15的菌体酶活曲线。图6 采用Gcw49、Pirl和Pir2作为锚定蛋白展示CALB的酶活比较。术语解释
MD平板13. 4g/L酵母氮源，4X 10_4 g/L生物素，20g/L葡萄糖和20g/L琼脂 BMGY培养基20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6. 0)，13. 4g/ L酵母氮源，4X10_4 g/L生物素，10g/L甘油。BMMY培养基20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6. 0)， 13.4g/L酵母氮源，4X10_4 g/L生物素，5g/L甲醇。三丁酸甘油酯乳化平板13. 4g/L酵母氮源，10g/L三丁酸甘油酯，5g/L聚乙烯醇，20g/L琼脂，IOOmM磷酸盐缓冲液(pH6. 0)。
具体实施例方式实施例1 巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW49基因的克隆、表达和鉴定 (1)巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW49基因的克隆
根据巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW49的基因序列SEQ NO. 4以及巴斯德毕赤酵母质粒 PPIC9K上的多克隆位点特征，设计合成引物
权利要求
1.一种巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW49，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ NO=I 所示。
2.编码权利要求1所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW49的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ NO :4所示。
3.—种巴斯德毕赤酵母细胞表面展示系统，其特征在于，是以权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw49为锚定蛋白，将靶蛋白固定在巴斯德毕赤酵母细胞表面构成的。
4.权利要求3所述的巴斯德毕赤酵母表面展示系统的构建方法，该方法由以下步骤组成(1)将权利要求2所述的基因克隆到表达载体的表达盒中，得到以权利要求1所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白为锚定蛋白的表面展示表达载体；(2)将靶蛋白的基因序列克隆到所述表面展示表达载体的巴斯德毕赤酵母壁蛋白基因序列的上游，与所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白基因形成融合基因；(3)转化巴斯德毕赤酵母，根据所述表达载体上的筛选标记筛选阳性转化子，即得到表面展示系统。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体包括带有分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母表达载体。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体为pPIC9K、pPICZα A、 pPICZ α B、pPICZ α C、pGAPZ α A、pGAPZ α B 或 pGAPZ α C。
7.根据权利要求4 6之一所述的构建方法，其特征在于，所述靶蛋白为碱性木聚糖酶、米黑根毛霉脂肪酶或南极假丝酵母脂肪酶B。
8.根据权利要求4 6之一所述的构建方法，其特征在于，所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GSl 15。
全文摘要
本发明公开了一种毕赤酵母壁蛋白及其构建的表面展示系统和构建方法。所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白的氨基酸序列为SEQNO1；所述巴斯德毕赤酵母细胞表面展示系统是以所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw49为锚定蛋白，将靶蛋白固定在巴斯德毕赤酵母细胞表面构成的。本发明的壁蛋白Gcw49在毕赤酵母中表达量十分高，与现已用于巴斯德毕赤酵母表面展示系统的内源锚定蛋白Pir1蛋白和Pir2蛋白相比，分别高8倍和19倍。
文档编号C07K14/39GK102260332SQ20111021581
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者叶燕锐, 周新莹, 张莉, 林影, 郑穗平, 韩双艳 申请人:华南理工大学