专利名称：猪圆环病毒2型Cap蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种猪圆环病毒2型Cap蛋白及其制备方法，特别是指一种使用基因工程手段在家蚕中生产制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白及其方法，属于基因工程领域。
背景技术：
猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)属圆环病毒属，是一种二十面对称、共价闭合、环状、单股DNA病毒。根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列的不同，可将PCV分为猪圆环病毒I型(PCVl)和猪圆环病毒2型(PCV2)。其中，PCVl对猪无致病性，PCV2对临床危害很大，它可引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemicwastingsyndrome,PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征及先天性震颤等多种疾病的爆发，给全世界养猪业带来了巨大的经济损失。研究发现，PCV2含有11个开放 阅读框(Open reading frame,ORF),ORFl和0RF2为最主要的两个阅读框。现已证实0RF2为编码病毒的主要结构蛋白和衣壳蛋白(Cap)，Cap蛋白上存在抗原表达位点，具有免疫原性，是PCV2特异性血清学检测方法和亚单位疫苗、核酸疫苗的基础。普莱柯生物工程股份有限公司的发明CN 101920012 A公开了一种家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法，以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)为载体，通过转移载体中的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因同源重组的方式将猪圆环病毒2型Cap蛋白基因整合至家蚕核型多角体启动子下进行目的蛋白表达，可以获得PCV2 Cap蛋白的大规I旲表达，制备成含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的亚单位疫苗。但该方法需要通过使用BmNPV与AcNPV共转染并通过噬斑筛选的方法，获得含PCV2 Cap蛋白的重组家蚕核型多角体病毒，而BmNPV与AcNPV同源重组的几率低，噬斑筛选存在工作量大、成功率低的缺点；此外，噬斑筛选需要培养家蚕细胞，需要含胎牛血清(FBS)的TC-100培养基，且培养周期较长(一般为7-8天)。因此，该噬斑筛选方法存在工作量大、试验成本高、试验周期长的缺点。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提一种利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法，包括以下步骤(I).克隆猪圆环病毒2型Cap蛋白的编码基因序列，转入转移载体，获得包含猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因的重组转移载体；(2).将上述重组转移载体转化入含有病毒穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中，获得含有猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因的重组穿梭载体，再将该穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得重组杆状病毒；(3).重组昆虫杆状病毒注射感染家蚕幼虫或蚕蛹；(4).回收获重组病毒感染的家蚕幼虫或蚕蛹的血淋巴；(5).分离纯化血淋巴中的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。
优选地，本发明的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤(I)中猪圆环病毒2型Cap蛋白的编码序列包含序列表中的SEQ ID NOl。优选地，本发明的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤(2)中所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码的基因的表达受多角体启动子的控制。优选地，本发明的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤(2)中所述的昆虫杆状病毒包括昆虫核型多角体病毒。优选地，本发明的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤(2)中所述的昆虫细胞包括Sf9细胞。优选地，本发明的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤(3)中所述的家蚕品种包括欧洲种Luobendihong、Baohuang、Hungary ;中 国种Dazao> Qiansanmian、Datuanyuan> Ankang> Lan 5 ；日本种RillO、Dongfei、Sul6、Sul4、YingHXZ、Haoyue 等。优选地，本发明的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中，步骤(3)中所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白序列包含序列表中的SEQ ID N02。优选地，本发明的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中，步骤(3)中所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白为如下三种多肽的任意一种I)含有序列表中的SEQ ID N02序列的多肽；2)与I)所述多肽至少80%同源的多肽；3) I)和2)所述多肽的免疫原性部分。本发明的另一目的在于提供上述方法生产的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。技术效果从本发明后续实施例中可以看出，本发明至少有以下优点I、操作简单、周期短。含PCV2 Cap蛋白的重组家蚕核型多角体病毒，传统的方法需要通过二种病毒(BmNPV与AcNPV)共转染并通过噬斑筛选的方法选择重组病毒，操作周期长，一个噬斑筛选周期为10天左右，顺利的情况下也要经过几轮噬斑筛选才能得到重组病毒，同时要求实验操作人员具有熟练的噬斑筛选技术。而本发明避免了病毒同源重组噬斑筛选这一难以操作并成功率低的步骤，极大地缩短了实验周期。2、利用家蚕幼虫和蚕蛹大规模进行Cap蛋白的分泌表达，成本低。重组病毒通过饲喂桑叶或注射的方式感染特定品种家蚕幼虫或蚕蛹，经一定时间饲养后取血淋巴，每条家香或香蛹平均可获得血淋巴500 μ I左右。该过程仅需对感染家香进行常规饲养，不需其他消耗，因此成本十分低廉；每条家蚕最后所取得的血淋巴量十分可观，若经后期纯化后制苗，每条家蚕的血淋巴可制疫苗10头份；感染病毒的血淋巴先后经高速离心和超速离心后，即可获得纯化后的PCV2 Cap蛋白，整个纯化过程没有化学物质等的参与，而仅仅依靠物理方法，不存在污染变性的可能，且操作简单，成本低；若工业化生产成熟后，每头份疫苗成本可控制在I元以内，而现存疫苗每头份市场价格均在12元左右，进口疫苗价格均在35元左右。3、由于家蚕可采用饲料饲养，因此受季节影响不大。且大规模饲养家蚕可采用饲喂桑叶等方式，家蚕感染率可达到99. 8%以上。整个家蚕饲养及感染周期为I个月左右，后期纯化也仅需几天即可。使用该方法进行PCV2 Cap蛋白的表达，只需进行1-2个周期的常规昆虫细胞培养，时间I周左右。在获得一定量的病毒量后，进行下一步家蚕幼虫或蚕蛹的感染。整个实验过程不存在难度，且在常规实验室即可进行。因此，本发明可以利用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)直接感染家蚕幼虫和蚕蛹，进行PCV2 Cap目的蛋白表达，可以大规模的生产PCV2 Cap蛋白。
图I为PCV2 0RF2基因扩增图；图2 为 PCV2 Cap 蛋白 SDS-PAGE 电泳图；图3 为 PCV2 Cap 蛋白 Western blot 图。
具体实施方式
本发明实施例中昆虫细胞使用了 Sf9细胞(Spodoptera frugiperda(草地夜蛾)卵巢细胞)，购自Invitrogen公司。其他类型的昆虫细胞,如家蚕胚胎细胞,家蚕卵巢细胞(BmN)等，只要可以感染本发明的转染病毒，即可使用本发明之方法生产猪圆环病毒2型Cap蛋白。本发明实施例中使用的家蚕品种为大造(Dazao)，其他的与之相一致的家蚕品种，如所述的家蚕品种包括欧洲种Luobendihong、Baohuang、Hungary ;中国种Qiansanmian、Datuanyuan、Ankang、Lan5 ；日本种Ri 110、Dongfei、Sul6、Sul4、YingHXZ、Haoyue 等，也可使用本发明之方法生产猪圆环病毒2型Cap蛋白。本发明的猪圆环病毒2型Cap蛋白，可以使用本领域常用的药用载体如ISA206佐剂等，或本领域其他类型的水性佐剂或油性佐剂，及本领域常用的其他乳化方法，制备猪圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗。本发明的猪圆环病毒2型Cap蛋白，可以使用本领域公知的方法制备试剂盒或直接作为检测试剂用于检测猪圆环病毒2型的感染。本实施例中构建的重组苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)，带有完整的PCV2Cap蛋白基因，位于家蚕核型多角体基因启动子控制下，多角体基因被PCV2 Cap蛋白基因取代，具有极晚期表达和表达量高的优点。在家蚕幼虫和蚕蛹中，表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定，结果表明构建的重组家蚕核型多角体病毒能够高效表达PCV2 Cap蛋白，大小约为28kDa。本实施例中构建的重组苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒，使用的是Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac Baculovirus Expression System, Invitrogen),任何其他类型的表达系统及转移载体、表达载体，只要可以实现将Cap蛋白基因克隆至重组病毒，并能够感染家蚕及蚕蛹并表达Cap蛋白，都可以使用本发明相同的方法生产猪圆环病毒2型Cap蛋白。本实施例中采用大肠杆菌DHlOBac (购于Invitrogen)进行转化,任何一种含有穿梭质粒的大肠杆菌，都可以使用本发明相同的方法生产猪圆环病毒2型Cap蛋白。本发明实施例中重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白为序列SEQ ID N02的多肽；使用本发明之方法还可生产如下重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白与所述选自序列SEQ ID N02的多肽至少80%同源的多肽及上述多肽的免疫原性部分，如截短型的Cap蛋白(S卩，虽然氨基酸序列被去除部分，依然保持免疫性的Cap蛋白)。制备上述多肽的实施例方法与过程与本发明实施例相同，下面不再累述。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，应按照常规实验方法进行。I、克隆猪圆环病毒2型0RF2基因，转入pFastBacI转移载体，获得包含猪圆环病毒2型0RF2基因的重组转移载体提取PCV2-SH株(保藏号为CGMCC No. 2389) DNA作为扩增Cap蛋白基因的模板，贮存于-20°C备用；根据GenBank的PCV2全基因序列，设计引物，分别在上下游引物5'端加上BamHI和XholI酶切位点。上游引物5'-CGCGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC-3'；
下游引物5'-CCGCTCGAGGGGTTTAAGTGGGGGGTCT-3' ；利用设计的引物扩增PCV2 0RF2基因片段，琼脂糖电泳回收并鉴定PCV2 0RF2基因条带。如图I为PCR电泳图，其中I为目的条带，M为DNA Marker2000。对回收的条带进行BamHI和XholI双酶切鉴定回收，同时将pBacPAK8质粒(购自Clontech公司)用BamHI和XholI同样进行双酶切并鉴定回收。对回收的目的片段和pBacPAK8质粒进行T4连接酶连接，转化至DH5a大肠杆菌中，筛选阳性克隆，提取质粒，并将阳性质粒命名为pBacPAK8-0RF2。用PCR扩增并测序，测序结果与GenBank登记的猪圆环病毒2型0RF2基因一致。因此，由测序结果可知，含有PCV2 Cap蛋白基因重组转移载体中含有0RF2基因序列。2、将含有PCV2 Cap蛋白基因重组转移载体转化入含有穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中，获得包含PCV2 0RF2基因的穿梭载体，再将其穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得重组杆状病毒vBac-0RF2 将pBacPAK8_0RF2转化含有病毒穿梭质粒Bacmid的大肠杆菌DHlOBac (购自Invitrogen公司)，获得重组质粒Bacmid_0RF2 ；PCR筛选,提取阳性质粒,制备阳性重组质粒 Bacmid_0RF2 DNA。米用 Cellfectin Reagent 转染 Sf9 细胞(购自 Invitrogen 公司),待细胞出现病变后，进行重组病毒噬斑纯化和病毒扩增，然后通过使用引物M13F和M13R进行PCR验证目的重组0RF2基因。纯化获得重组杆状病毒，命名为vBac-0RF2。扩增重组杆状病毒vBac-0RF2作为种毒,通过噬斑法进行效价测定后于4°C保存。3、重组杆状病毒vBac_0RF2感染家蚕幼虫，产生PCV2 Cap蛋白；重组杆状病毒vBac-0RF2以I. OX 105pfu(噬斑形成单位)/头的感染剂量，用微量注射器于家蚕幼虫腹部环节处射入蚕血淋巴腔中。分别于感染后72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h和156h后，收获感染重组杆状病毒的幼虫，利用组织捣碎机进行蚕体破碎，IOOOOrpm离心，回收上清，及蚕血淋巴液。然后加入100倍体积的PBS (pH7. 4,0. 01M)，利用超滤浓缩机进行超滤出去杂蛋白，利用SDS-PAGE电泳与Western blot进行PCV2 Cap蛋白的鉴定。鉴定结果见图2、3，由图可知，SDS-PAGE电泳与Western blot中均有明显的Cap蛋白条带，说明PCV2 Cap在家蚕体内进行了表达。图2为SDS-PAGE电泳图，其中I为PCV2 Cap蛋白诱导前样品；2为PCV2 Cap蛋白诱导后样品；M为蛋白Marker ;图3为Western blot鉴定图,其中I为PCV2 Cap蛋白诱导后样品；2为PCV2 Cap蛋白诱导前样品；M为双色预染蛋白Marker。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。·
权利要求
1.一种利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法,其特征在于,包括以下步骤 (1)·克隆猪圆环病毒2型Cap蛋白的编码基因序列，转入转移载体，获得包含猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因的重组转移载体； (2).将上述重组转移载体转化入含有病毒穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中，获得含有猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因的重组穿梭载体，再将该穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得重组杆状病毒； (3).重组昆虫杆状病毒注射感染家蚕幼虫或蚕蛹； (4).回收获重组病毒感染的家蚕幼虫或蚕蛹的血淋巴； (5).分离纯化血淋巴中的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的步骤(I)中猪圆环病毒2型Cap蛋白的编码序列包含序列表中的SEQ ID NOl。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码的基因的表达受多角体启动子的控制。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的昆虫杆状病毒包括昆虫核型多角体病毒。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的昆虫细胞包括Sf9细胞。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的家香品种包括 Dazao> Luobendihong、Baohuang、Hungary> Qiansanmian、Datuanyuan>Ankangλ Lan 5、Ri 110、Dongfei、Su 16、Su 14、YingHXZ、Haoyue。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白序列包含序列表中的SEQ ID Ν02。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白为如下三种多肽的任意一种 1)含有序列表中的SEQID Ν02序列的多肽； 2)与I)所述多肽至少80%同源的多肽； 3)1)和2)所述多肽的免疫原性部分。
9.根据权利要求I 8任意一项的方法生产的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。
全文摘要
本发明提供了一种利用家蚕生物反应器生产PCV2 Cap蛋白的方法及Cap蛋白制品，包括克隆PCV2 Cap蛋白的编码基因序列，至重组杆状病毒，使用重组昆虫杆状病毒直接注射感染家蚕幼虫或蚕蛹，回收并分离纯化PCV2 Cap蛋白。本发明具有操作简单、周期短的特点，避免了病毒同源重组噬斑筛选这一难以操作并成功率低的步骤，极大地缩短了实验周期；操作简单，成本低，后提取方法简单，适合工业化的生产。
文档编号C07K14/01GK102911947SQ201110218780
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月1日 优先权日2011年8月1日
发明者张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司