专利名称：一种以鱼皮为原料制备高纯度胶原蛋白的方法
一种以鱼皮为原料制备高纯度胶原蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种胶原蛋白提取的方法，尤其是一种以鱼皮为原料制备高纯度胶原蛋白的方法。
背景技术：
胶原蛋白是一种是由3条多肽链以右手螺旋形式组成的纤维状蛋白质，作为细胞外基质的重要成份几乎存在于所有组织，是动物体内含量最丰富的蛋白质。胶原蛋白因具有低免疫原性、良好的生物相容性和可生物降解性等特点使其在功能食品、保健品、生物材料、组织工程和生物医用材料等领域应用十分广泛。常用的胶原蛋白主要是哺乳动物的皮肤和骨组织以及鱼皮或鱼磷等。胶原蛋白在许多领域中的应用与其分子量范围和纯度密切相关，生物和医学等领域中应用的胶原蛋白主要是高分子量和高纯度的胶原蛋白，在食品领域用于食品定型等方面的胶原蛋白主要是高分子量胶原蛋白，因此制备高分子量和高纯胶原蛋白是拓展其应用范围的关键。由于胶原蛋白在常温下难于溶于水溶液且难于被体内的生物酶降解，因此制备胶原蛋白常使用酸法、碱法、浓盐法、酶法、热降解法或这些方法的组合将其降解后溶出。曾少葵等报道了利用酸溶液从罗非鱼鱼鳞中提取胶原蛋白并使用酶法制备胶原蛋白多肽的方法(上海海洋大学学报，2009，18 (5) =599-603);刘艳等研究了使用酶法从4种淡水鱼鱼鳞中提取胶原蛋白的方法(水产科学，2010，29 (4) =221-224)；曾嵘报道了盐酸脱钙、酶与柠檬酸结合提取胶原蛋白的方法(生物加工过程，2008，6 (5)27-30);陈胜军等研究了碱法制备胶原蛋白的工艺(水产科学，2004，23 (6) :45-46);此夕卜，单独使用热降解法也可以使得胶原蛋白溶出(内蒙古民族大学学报，2010，25(5)525-529)。专利(申请号201010513190. 9)公布了一种属于酸提取-酸性蛋白酶酶解的复合工艺，专利(申请号201010192216. 4)公布了一种使用柱层析技术并结合膜分离工艺制备胶原蛋白方法；尽管提取胶原蛋白的研究已有许多，但传统的胶原蛋白提取方法存在许多缺陷，主要包括(I)胶原蛋白分子量范围宽，由于这些传统方法主要是将胶原蛋白降解后提高其水溶性导致制备出的胶原蛋白分子量范围过宽，常常是几百到二十几万道尔顿。(2)蛋白质纯度不高，传统方法制备胶原蛋白过程中非胶原类的蛋白溶出后混入到胶原蛋白溶液，导致制备出的胶原蛋白纯度较低。(3)胶原蛋白序列发生变化，胶原蛋白的氨基酸序列中存在一定量的天冬酰胺和谷氨酰胺残基，传统方法制备胶原蛋白过程中这些含酰胺的氨基酸残基发生脱酰胺现象。胶原蛋白性质与其动物来源密切，哺乳动物来源的胶原蛋白具有较好的热稳定性，而鱼类的胶原蛋白热稳定性低于哺乳动物来源的胶原蛋白，使用传统的提取方法从鱼皮中提取的胶原蛋白由于降解严重而导致其平均分子量不高，因此，以鱼皮为原料提取高分子量和高纯度胶原蛋白更加困难。
发明内容
本发明目的在于提供一种以鱼皮为原料制备高分子量和高纯度胶原蛋白的方法。因此，本发明提供一种以鱼皮为原料制备高纯度胶原蛋白的方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤⑴鱼皮粉碎；⑵脱脂；(3)非胶原类蛋白质溶出；⑷清洗；(5)胶原蛋白溶出；(6)胶原蛋白溶液浓缩；(7)胶原蛋白干燥。鱼皮中非胶原类蛋白质的热稳定性低于胶原蛋白的热稳定性，在低于胶原蛋白变性温度条件下，加入酸性溶液可使鱼皮中非胶原类的蛋白质首先溶出；将提取过程中溶液的温度控制在胶原蛋白发生可变性的温度，可使鱼皮中胶原蛋白溶出，从而可以制备出具有较高分子量范围的胶原蛋白，同时，在提取胶原蛋白之前将非胶原类的蛋白质溶出，提供了最终制备出的胶原蛋白的纯度。
图I是以鱼皮为原料提取高纯胶原蛋白的工艺流程图。
具体实施方式
本发明提供一种以鱼皮为原料制备高纯度胶原蛋白的方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤(I)鱼皮粉碎；(2)脱脂；(3)非胶原类蛋白质溶出；(4)清洗；(5)胶原蛋白溶出；(6)胶原蛋白溶液浓缩；(7)胶原蛋白干燥。在本发明中，所述鱼皮可以为未经过处理的干鱼皮或者湿鱼皮，或者粉碎后的干鱼皮或者湿鱼皮；也可以为经过脱脂和/或脱灰处理的鱼皮。在本发明中，所述步骤(3)、(4)和(5)可以在任何可以连续分离固液的容器中进行，但在一种优选的实施方式中，所述步骤(3)、(4)和(5)均在提取罐中进行，所述提取罐具有截留鱼皮的过滤装置。步骤(I)鱼皮粉碎和(2)脱脂均可按照现有技术进行。在一种优选的实施方式中，所述脱脂是向提取罐内连续注入脱脂剂，脱脂剂与鱼皮接触后从提取罐内流出，脱脂剂加入量为湿态鱼皮重量的10-20倍，注入时间控制在18-32小时，温度控制在18°C以下。脱脂剂可以是5 30体积％的异丙醇水溶液或5 30体积％的正丁醇水溶液。在所述步骤(3)中，非胶原类蛋白的溶出主要是通过控制该步骤的温度，通常控制该步骤进行的温度低于鱼皮胶原蛋白发生变性的临界温度，使非胶原类蛋白从鱼皮中溶出，而胶原蛋白仍然保留在鱼皮中，借此将胶原蛋白与非胶原类蛋白进行分离从而除去非胶原类蛋白，用于溶解非胶原类蛋白的介质可以为水或酸的水溶液。在一种优选的实施方式中，在所述步骤(3)中将鱼皮与酸性水溶液接触，并控制所述接触温度低于所述鱼皮胶原蛋白发生变性的临界温度，使非胶原蛋白溶出到所述酸性水溶液中。在另一种优选的实施方式中，在所述步骤(3)中，所述非胶原蛋白溶出步骤为连续的方式，所述酸性水溶液的注入可以连续注入，溶有非胶原蛋白的水溶液连续流出。在一种优选的实施方式中，所述非胶原类蛋白质溶出步骤为连续的，所采用的条件包括向提取罐内连续注入酸性水溶液，所述酸性水溶液与湿态鱼皮接触后从提取罐流出，流出速率与所述酸性水溶液的注入速率相等，提取罐内温度控制在15 40°C，所述酸性水溶液的酸浓度为O. 01 O. 05mol/L，所述酸性水溶液与所述湿态鱼皮的重量之比为10 : I 20 : 1，连续注入酸性水溶液的时间控制在6 12小时范围内。在另一种优选的实施方式中，所述酸性水溶液为醋酸、柠檬酸或盐酸的水溶液。
在所述步骤(3)中，当在连续注入所述酸性水溶液时，连续注入所述酸性水溶液的速度与溶有非胶原蛋白的水溶液连续流出的速度可以相同或不同，但为了使溶有非胶原蛋白的水溶液能够连续流出，连续注入所述酸性水溶液的速度应当大于或等于溶有非胶原蛋白的水溶液连续流出的速度。但在一种优选的实施方式中，连续注入所述酸性水溶液的速度与溶有非胶原蛋白的水溶液连续流出的速度相等，以使非胶原蛋白一溶出，就立刻流出而与含有胶原蛋白的鱼皮分离。 在本发明中所述清洗步骤(4)为连续方式，所采用的条件包括连续注入水，使所述水与经过步骤(3)处理后的鱼皮接触后流出，流出速率与连续注入所述水的速率可以相同或不同，但为了使清洗液能够连续流出，连续注入所述水的速度应当大于或等于流出速率。在一种优选的实施方式中，所述清洗步骤为连续的，所述方法采用的条件包括向所述提取罐内连续注入清水，所述清水与湿态鱼皮接触后从所述提取罐流出，流出速率与所述清水的注入速率相等，所述提取罐内温度控制在10 30°C，所述清水与所述湿态鱼皮的重量之比为6 : I 8 : 1，连续注入所述清水的时间控制在I小时以内。在本发明所述的步骤(5)中，胶原蛋白的提取主要是通过控制该步骤的温度以及清水的加入速率和流出速率。通常该步骤的温度控制在鱼皮胶原蛋白发生热变性的临界温度，使胶原蛋白在热变性条件下从鱼皮中溶出，溶出的胶原蛋白溶液流出后温度降低，变性的胶原蛋白逐渐恢复其天然状态。在一种优选的实施方式中，所述胶原蛋白质溶出步骤为连续的，所采用的条件包括向所述提取罐内连续注入温度为55 95°C的清水，所述清水与所述湿态鱼皮接触后，胶原蛋白从所述湿态鱼皮中溶出至清水并从所述提取罐内流出，流出速率与所述清水的注入速率相等，收集流出液，所述提取罐内温度控制在55 95°C，所述清水与所述湿态的所述鱼皮的重量之比为10 I 30 1，连续注入所述55 95°C清水的时间控制在3 10小时。在本发明所述的步骤(5)中，连续注入清水的速度与溶有胶原蛋白的水溶液连续流出的速度可以相同或不同，但为了使溶有胶原蛋白的水溶液能够连续流出，连续注入所述清水的速度应当大于或等于溶有胶原蛋白的水溶液连续流出的速度。在一种优选的实施方式中，连续注入所述清水的速度与溶有胶原蛋白的水溶液连续流出的速度相等，以使胶原蛋白溶出后立刻流出而避免溶出的胶原蛋白进一步热变性。在一种最优选的实施方式中，本发明的方法包括(I)鱼皮粉碎将鱼皮经水浸泡，滤去水溶液，采用粉碎机将鱼皮粉碎成块状，装填到提取罐内，提取罐具有截留鱼皮的过滤装置。(2)脱脂向提取罐内连续注入脱脂剂，脱脂剂与鱼皮接触后从提取罐内流出，脱脂剂加入量为湿态鱼皮重量的10-20倍，注入时间控制在18-32小时，温度控制在18°C以下。脱脂剂可以是5 30体积％的异丙醇水溶液或5 30体积％的正丁醇水溶液。(3)非胶原类蛋白质溶出向提取罐内连续注入酸性水溶液，酸性水溶液与湿态鱼皮接触后从提取罐流出，控制流出速率和酸性水溶液的注入速率相等。提取罐内温度控制在15 40°C。所述酸性水溶液的酸浓度为O. 01 O. 05mol/L，所述酸性水溶液与湿态的所述鱼皮的重量之比为10 : I 20 : 1，连续注入酸性水溶液的时间控制在6 12小时范围内。(4)清洗向提取罐内连续注入清水，清水与鱼皮接触后从提取罐流出，控制流出速率和清水的注入速率相等；提取罐内温度控制在15 30°C，清水与湿态所述鱼皮的重量之比为6 : I 8 : 1，连续注入清水的时间控制在I小时以内。(5)胶原蛋白连续溶出向提取罐内连续注入温度为55 95°C的清水，清水与鱼皮接触后胶原蛋白从湿态鱼皮中溶出至清水并从提取罐内流出，流出控制和清水的注入速率相等；流出液为含有胶原蛋白的溶液。提取罐内温度控制在55 95°C，所述清水与湿态所述鱼皮的重量之比为10 I 30 1，连续注入55 95°C清水的时间控制在3 10小时。(6)浓缩将步骤(5)获得的胶原蛋白溶液使用三效法进行浓缩或超滤法进行浓缩，将胶原蛋白溶液的固含量提高至30%以上。(7)干燥将步骤(6)获得的胶原蛋白浓缩液使用冷冻干燥或喷雾干燥法制备成胶原蛋白粉末。本发明由于将非胶原类的蛋白质与胶原蛋白分步溶出，只收集含胶原蛋白的蛋白浸出液，因此提高了胶原蛋白的纯度；由于控制提取温度在胶原蛋白发生不可逆的热变性临界温度，且提取时间低于鱼皮胶原蛋白在变性临界温度发生不可逆变性所需的时间，因此提取出的胶原蛋白发生的随机降解率低或不发生随机降解，因此，利用本发明目所述的方法制备出的胶原蛋白具有纯度高和分子量高等特点。实施例I(I)鱼皮粉碎称取鱼皮10kg，使用5kg清水在30°C条件下浸泡4小时，过滤去除水溶液，采用粉碎机将鱼皮粉碎成约IcmX Icm块状，装填到体积为200升的提取罐内，提取罐出口装有孔径为Imm的过滤网。(2)脱脂向提取罐内连续注入5体积％的异丙醇水溶液，异丙醇水溶液与鱼皮接触后从提取罐内流出，异丙醇水溶液加入量为200L，注入时间控制在32小时，温度控制在18°C以下。(3)非胶原类蛋白质溶出向提取罐内连续注入O.Olmol/L的醋酸水溶液，醋酸水溶液与鱼皮接触后从提取罐流出，提取罐内温度控制在15°C，醋酸水溶液注入量为200kg，连续注入时间12小时。(4)清洗向提取罐内连续注入清水60kg的清水，清水与鱼皮接触后从提取罐流出，提取罐内温度控制在15°C，连续注入清水的时间控制在I小时以内。(5)胶原蛋白连续溶出向提取罐内连续注入温度为55°C的清水，清水与鱼皮接触后胶原蛋白从鱼皮中溶出至清水并从提取罐内流出，清水注入量为100L，注入时间为3小时，提取罐内温度控制在55°C。(6)浓缩将步骤(5)获得的胶原蛋白溶液使用三效法进行浓缩和超滤法进行浓缩，将胶原蛋白溶液的固含量提高至20%以上。(7)干燥将步骤(6)获得的胶原蛋白浓缩液使用冷冻干燥法制成干态胶原蛋白。实施例2(I)鱼皮粉碎称取鱼皮10kg，使用5kg清水在30°C条件下浸泡4小时，过滤去除水溶液，采用粉碎机将鱼皮粉碎成约IcmX Icm块状，装填到体积为200升的提取罐内，提取罐出口装有孔径为Imm的过滤网。(2)脱脂向提取罐内连续注入18体积％的异丙醇水溶液，异丙醇水溶液与鱼皮接触后从提取罐内流出，异丙醇水溶液加入量为150L，注入时间控制在24小时，温度控制在18°C以下。(3)非胶原类蛋白质溶出向提取罐内连续注入O. 03mol/L的盐酸水溶液，盐酸水溶液与鱼皮接触后从提取罐流出，提取罐内温度控制在28°C，盐酸水溶液注入量为150kg，连续注入时间8小时。(4)清洗向提取罐内连续注入清水70kg的清水，清水与鱼皮接触后从提取罐流出，提取罐内温度控制在20°C，连续注入清水的时间控制在I小时以内。(5)胶原蛋白连续溶出向提取罐内连续注入温度为80°C的清水，清水与鱼皮接触后胶原蛋白从鱼皮中溶出至清水并从提取罐内流出，清水注入量为200L，注入时间为7小时，提取罐内温度控制在80°C。(6)浓缩将步骤(5)获得的胶原蛋白溶液使用三效法进行浓缩和超滤法进行浓缩，将胶原蛋白溶液的固含量提高至20%以上。(7)干燥将步骤(6)获得的胶原蛋白浓缩液使用冷冻干燥制成干态胶原蛋白。实施例3(I)鱼皮粉碎称取鱼皮10kg，使用5kg清水在30°C条件下浸泡4小时，过滤去除水溶液，采用粉碎机将鱼皮粉碎成约IcmX Icm块状，装填到体积为200升的提取罐内，提取罐出口装有孔径为Imm的过滤网。(2)脱脂向提取罐内连续注入30%体积的正丁醇水溶液，正丁醇水溶液与鱼皮接触后从提取罐内流出，异丙醇水溶液加入量为100L，注入时间控制在18小时，温度控制在18°C以下。(3)非胶原类蛋白质溶出向提取罐内连续注入O. 05mol/L的柠檬酸水溶液，柠檬酸水溶液与鱼皮接触后从提取罐流出，提取罐内温度控制在40°C，柠檬酸水溶液注入量为100kg，连续注入时间6小时。(4)清洗向提取罐内连续注入清水80kg的清水，清水与鱼皮接触后从提取罐流出，提取罐内温度控制在30°C，连续注入清水的时间控制在I小时以内。(5)胶原蛋白连续溶出向提取罐内连续注入温度为95°C的清水，清水与鱼皮接触后胶原蛋白从鱼皮中溶出至清水并从提取罐内流出，清水注入量为300L，注入时间为10小时，提取罐内温度控制在95°C。(6)浓缩将步骤(5)获得的胶原蛋白溶液使用三效法进行浓缩和超滤法进行浓缩，将胶原蛋白溶液的固含量提高至20%以上。(7)干燥将步骤(6)获得的胶原蛋白浓缩液使用冷冻干燥制成干态胶原蛋白。检测检测实施例1-3所制备的产品胶原蛋白的纯度以及分子量分布，采用的方法分别为氨基酸组成分析法和凝胶过滤法，检测的结果如表I所示表I施例1-3所制备的胶原蛋白的纯度、分子量范围及平均分子量
胶原蛋白纯度分子量分布平均分子量
实施例 I96%5000-260000200000
权利要求
1.一种以鱼皮为原料制备高纯度胶原蛋白的方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤⑴鱼皮粉碎；⑵脱脂；⑶非胶原类蛋白质溶出；⑷清洗；(5)胶原蛋白溶出；(6)胶原蛋白溶液浓缩；(7)胶原蛋白干燥。
2.根据权利要求I所述的方法，其中，所述步骤(3)、(4)和(5)均在提取罐中进行，所述提取罐具有截留鱼皮的过滤装置。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述非胶原类蛋白质溶出步骤为连续的，所采用的条件包括向所述提取罐内连续注入酸性水溶液，所述酸性水溶液与湿态鱼皮接触后从所述提取罐流出，流出速率与所述酸性水溶液的注入速率相等，所述提取罐内温度控制在15 40°C，所述酸性水溶液的酸浓度为O. Ol O. 05mol/L，所述酸性水溶液与所述湿态鱼皮的重量之比为10 : I 20 : 1，连续注入所述酸性水溶液的时间控制在6 12小时范围内。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述酸性水溶液为醋酸、柠檬酸或盐酸的水溶液。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述清洗步骤为连续的，所采用的条件包括向所述提取罐内连续注入清水，所述清水与湿态鱼皮接触后从所述提取罐流出，流出速率与所述清水的注入速率相等，所述提取罐内温度控制在10 30°C，所述清水与所述湿态鱼皮的重量之比为6 : I 8 : 1，连续注入所述清水的时间控制在I小时以内。
6.根据权利要求2所述的方法，其中，所述胶原蛋白质溶出步骤为连续的，所采用的条件包括向所述提取罐内连续注入温度为55 95°C的清水，所述清水与所述湿态鱼皮接触后，胶原蛋白从所述湿态鱼皮中溶出至所述清水中并从所述提取罐内流出，流出速率与所述清水的注入速率相等，收集流出液，所述提取罐内温度控制在55 95°C，所述清水与所述湿态的鱼皮的重量之比为10 I 30 1，连续注入所述55 95°C清水的时间控制在3 10小时。
全文摘要
本发明提供了一种以鱼皮为原料制备高纯度胶原蛋白的方法，该方法依次包括以下步骤(1)鱼皮粉碎；(2)脱脂；(3)非胶原类蛋白质溶出；(4)清洗；(5)胶原蛋白溶出；(6)胶原蛋白溶液浓缩；(7)胶原蛋白干燥。在低于胶原蛋白变性温度条件下使鱼皮中非胶原类蛋白首先溶出，将温度控制在胶原蛋白发生变性温度范围内且控制溶解时间短于胶原蛋白变性所需的时间，可以获得水解程度很低或没有水解的胶原蛋白，该胶原蛋白具有天然结构，获得的胶原蛋白具有分子量高和纯度高等优点。
文档编号C07K14/78GK102952188SQ201110240719
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年8月22日
发明者刘晶琦, 张贵锋, 王海燕, 刘爱青, 孔英俊, 苏志国 申请人:北京盛美诺生物技术有限公司, 中国科学院过程工程研究所, 海南盛美诺生物技术有限公司