专利名称：一种利用线粒体内膜表达变形紫色红质筛选淬灭自由基的活性物质和抗衰老产品的方法
一种利用线粒体内膜表达变形紫色红质筛选淬灭自由基的活性物质和抗衰老产品的方法技术领域建立筛选抗衰老保健品和药物的细胞学方法背景技术动物细胞衰老的机理很复杂，其中由于有氧呼吸带来的自由基的过量产生被认为是主要原因之一，特别是线粒体内自由基的过量产生，常常导致神经细胞和其他不能再分化而补偿细胞的死亡，从而引发神经性退行疾病的发生和恶化。研究抵抗自由基引起的细胞凋亡从而成为抗衰老研究的重要方法。目前诱发自由基过量引起的细胞凋亡方法单一，主要是外源性加入过氧化氢等氧化剂。这类方法不能准确体现动物细胞自由基过量的自然发生情况，所以限制了抗衰老药物的研发。在2000年等科学家报导从变形细菌基因组中克隆出一种新型的紫色红质(变形紫色红质，proteorhodospin, PR)的基因。随后的实验证明，该蛋白在大肠杆菌内可以表达到细胞膜上，在结合视黄醒后，可以接 受一定波长范围的光能，逆浓度转运质子，并且能够在细胞膜两侧产生质子浓度差，从而驱动鞭毛的运动。在天然表达变形紫色红质的细菌中，光能的利用对于碳源贫乏的生存环境被认为具有保护作用。2011年Slamovits等在天然真核细胞中也发现该类蛋白的表达,但蛋白主要分布在线粒体以外的细胞器内，其功能尚有待进一步研究确认。参考文献I.刘树森，线粒体呼吸与活性氧。生命科学2008，20 (4) =519-527.2. Beja, O et al Bacterial rhodopsin evidence for a new type ofphototrophy in the sea. Science2000,289(5486) :1902-1906.3. Steindler L, et al Energy starved Candidatus Pelagibacter ubiquesubstitutes light-mediated ATP production for endogenous carbon respiration.PLoS One. 2011,6(5) el9725.4. DeLong EF, BejaO, The Iight-driven proton pump proteorhodopsinenhances bacterial survival during tough times. PLoS Biol.2010,8 (4) el000359.5.Gomez-Consarnau L, et al Proteorhodopsin phototrophy promotessurvival of marine bacteria during starvation. PLoS Biol.2010,8(4) el000358.6. Martinez A,et al Proteorhodopsin photosystem gene expression enablesphotophosphorylation in a heterologous host. Proc Natl Acad Sci USA. 2007,104(13) :5590-5.7. Walter JM, et a I Light-powering Escherichia coli withproteorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007Feb 13 ；104 (7) :2408-12.8. Slamovits,CH,et al A bacterial proteorhodopsin proton pump in marineeukaryotes. Nature Comminications 2011,2 :183 (D0I 10. 1038/ncommsll88).9. Walter, JM et al Potential of light-harvesting proton pumps forbioenergy applications. Current Opinion in Biotechnology 2010, 21 :265-270.发明内容我们根据变形紫色红质蛋白质的氨基酸序列，使用人体遗传密码的偏爱性，合成出在哺乳动物中可以高量表达的紫色红质，并且使用细胞色素C氧化酶第四亚基的线粒体内膜信号肽置换原变形紫色红质的细胞膜信号肽，从而实现在哺乳动物线粒体内膜上安置变形紫色红质蛋白。该蛋白在一定波长范围的光能驱动下，使线粒体内膜两侧产生质子浓度差。由于动物细胞的线粒体内膜上腺嘌呤三磷酸(ATP)合成酶是利用膜两侧的质子浓度差来驱动ATP的合成，所以光照条件下，线粒体电子传递链在满足ATP合成的同时,产生了过量自由基。由此我们建立了一个产生线粒体内源性过量自由基的细胞模型。该模型中自由基的产生可以通过外设光源的波长，强度和辐射时间来进行定量控制，为筛选抗自由基药物提供一种新的细胞筛选方法。
附图I。人造线粒体内膜变形紫色红质基因的核苷酸序列。附图2。细胞流式仪检测碳源缺失培养条件下微光照射可以增加绿色荧光蛋白表达量。· NB :无光照射；WA :微光照射(lOOlux)。Ml :平均绿色荧光蛋白量。
具体实施例方式举例一合成人造线粒体内膜变形紫色红质基因并克隆入表达载体质粒pSG5。按附图I的核苷酸序列进行全基因的合成由北京三博远志生物技术有限责任公司受委托完成。该基因片段经EcoRI和BamHI内切酶位点连入哺乳动物细胞表达载体pSG5 (Strategene公司，美国)。举例二转染人胚肾细胞株HEK293，短期表达人造线粒体内膜变形紫色红质基因。用DMEM培养基(Hyclone公司，美国)和10%胎牛血清(杭州四季青公司)在48孔细胞培养板培养人胚肾细胞株HEK293(中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所细胞库)，每孔细胞转染O. 5微克绿色荧光蛋白表达质粒(GreenLatern)和O. I微克pSG5/proteorhodopsin,使用GeneTranII转染试剂O. 25微升(Biomiga公司，美国)。细胞培养液添加维生素A至30微摩尔/升。举例三光照表达人造线粒体内膜变形紫色红质基因的细胞。在二氧化碳细胞培养箱内使用8瓦白色荧光灯照明，使用XYI-III全数字照度仪(杭州新叶光电工程技术有限公司)对光强进行测量，并使用纸张进行遮光，以达到指定均匀光强。举例四筛选抗自由基过量表达的保健品和药物。配制不同浓度的样品稀释液，与转入绿色荧光蛋白和变形紫色红质表达载体的HEK293细胞共浴，使用100-12001uX光强的光照射48小时和8天。实验结果显示，未加药品的细胞在光照条件下陆续凋亡，而加入维生素C和叔丁基对苯二酚(TBHQ)的细胞凋亡数目很少；加入牛磺酸，辅酶Q，褪黑素的细胞凋亡数目与空白对照结果接近，而加入维生素E或白藜芦醇则促进细胞凋亡。以上药品工作浓度各自为维生素C =1-10000微摩尔/升，TBHQ :0. 1-10微摩尔/升，牛磺酸5毫摩尔/升，辅酶Q 30微摩尔/升，褪黑素0. I毫摩尔/升，维生素E :0. I毫摩尔/升，白藜芦醇0. 5毫摩尔/升。举例五微光条件下绿色荧光蛋白表达量增加。使用无糖DMEM培养基(Mediatech，美国)(缺丙酮酸和谷氨酰胺)和10%胎牛血清，添加4毫摩尔/升L-谷氨酰胺和30微摩尔/升维生素A，培养HEK293细胞，并按举例一比例转染绿色荧光蛋白和变形紫色红质表达质粒后，在无光或微光(lOOlux)条件下培养24小时，收集细胞，使用FACSCalibur型号细胞流式仪(BD Bioscience公司，美国)进行绿色荧光蛋白表达量的检测，实验结果见附图二。在碳源(葡萄糖和丙酮酸)缺失培养条件下，微光(lOOlux)照射可以增加绿色荧光蛋白表达量。举例六克隆人造线粒体内膜变形紫色红质基因并连入反转录稳定表达载体BABE0 使用寡核苷酸 5’ -aaa gaa ttc tea cta tta ggc gtt gct_3’ 和 5’ -ggg gaa ttctaa acc acc atg cttgcc-3’为引物，pSG5/proteorhodopsin 为模板，高保真热稳定 DNA 聚合酶Pfu为合成酶，进行PCR，扩增产物电泳纯化，限制性内切酶EcoRI酶切后克隆入BABE反转录表达载体。权利要求I.在体外培养的动物细胞内表达变形紫色红质，使其定位在线粒体内膜上。在光照条件下培养上述细胞，并且在培养基中加入待测物质，检测该物质抑制细胞凋亡的效果和活性。
2.权限I中的动物细胞是原代细胞或细胞株，包括人胚肾细胞株HEK293。3.权限I中变形紫色红质的人造基因是5 ‘-GGGG MT TOG OGG OOG CTT CTA GAG TM AOC AOC ATG CTT GCC ACT AGG GTG TTC AGT CTG GTCGGG AM OGG GCA Απ TCT AOC AGC GTC TGT GTG AGA GCC GGC GGA GGC GAT TTG GAC GCT TCTGAT TAT ACA GGA GTG AGT TTT TGG TTG GTC AOC GCA GCT CTT TTG GOG TOG ACA GTG TTT TTCΤΓΤ GTG GAG AGG GAC OGC GTA TCA GCA AM TGG MG AOC TOC TTG ACT GU AGT GGC CTC GTCACA GGA ATA GCT ΤΓΤ TGG CAC TAT ATG TAC ATG AGG GGC GTT TGG ATC GM AOG GGA GAT TOCOOC ACA GTT ΤΓΤ AGG TAT ATC GAC TGG CTC CTT ACT GTC OOC TTG CTG ATT TGT GAG TTC TATTTG ATC πΑ GCC GCT GCA AOC MT GTG GCT GGA TCA CTG TTC MG AM TTG TTG GTG GGG TOC Α GTG ATG TTG GTG TTC GGT TAC ATG GGC GM GCT GGA ATC ATG GCA GCC TGG OCA GCC ΤΓΤΑπ ATC GGC TGC CTC GCC TGG GTA TAT ATG ΑΤΑ TAC GAG CTC TGG GCA GGC GM GGA MG AGTGCT TGC MC ACA GCT AGC OCT GCG GTC CAG TOG GCC TAC MC ACA ATG ATG TAT Απ ATC ATCTTC GGC TGG GCG ΑΤΑ TAT OCT GTG GGC TAC TTC AOC GGT TAC TTG ATG GGC GAC GGG GGA AGTGCG CTT MT πΑ MC CTT Απ TAT MC CTC GCC GAT TTC GTG MC AM Απ m ΤΓΤ GGC CTGΑπ ATC TGG MC GTC GCT GTC AM GM TCA AGC MC GCC TM TAG TGA GGA TOC ACT AGT Μ_3 ‘4.权限I中表达变形紫色红质基因的方式是将该基因克隆入表达载体质粒，比如PSG5质粒，或BABE反转录表达质粒，然后使用转染方法，比如脂质体介导的方法导入细胞。如使用反转录载体，可以筛选整合该基因和带抗性基因的细胞克隆。该基因可以在细胞内短时间或长时间表达。5.权限I中光照条件为可见光，光强范围l-50001ux。最适光强范围25-10001ux。6.权限I中光照时间为12小时至14天。最适光照时间为24小时至7天。7.权限I中待测化合物是天然产物或合成化合物。使用权限I筛出的阳性物质包括维生素C，叔丁基对苯二酚(TBHQ)。8.使用权限I筛选出的阳性物质，可以用于抗衰老和治疗衰老引起的疾病，包括神经退行性疾病。
权利要求
1.在体外培养的动物细胞内表达变形紫色红质，使其定位在线粒体内膜上。在光照条件下培养上述细胞，并且在培养基中加入待测物质，检测该物质抑制细胞凋亡的效果和活性。
2.权限I中的动物细胞是原代细胞或细胞株，包括人胚肾细胞株HEK293。
3.权限I中变形紫色红质的人造基因是 5 ‘-GGGG MT TOG OGG COG CTT CTA GAG TM ACC ACC ATG CTT GCC ACT AGG GTG TTC AGT CTG GTCGGG AM OGG GCA ATT TCT ACC AGC GTC TGT GTG AGA GCC GGC GGA GGC GAT TTG GAC GCT TCTGAT TAT ACA GGA GTG AGT TTT TGG TTG GTC ACC GCA GCT CTT TTG GCG TOG ACA GTG TTT TTCTTT GTG GAG AGG GAC OGC GTA TCA GCA AM TGG MG ACC TCC TTG ACT GTT AGT GGC CTC GTCACA GGA ATA GCT TTT TGG CAC TAT ATG TAC ATG AGG GGC GTT TGG ATC GAA AOG GGA GAT TCCCCC ACA GTT TTT AGG TAT ATC GAC TGG CTC CTT ACT GTC CCC TTG CTG ATT TGT GAG TTC TAT TTG ATC TTA GCC GCT GCA ACC MT GTG GCT GGA TCA CTG TTC MG AM TTG TTG GTG GGG TCCTTA GTG ATG TTG GTG TTC GGT TAC ATG GGC GAA GCT GGA ATC ATG GCA GCC TGG CCA GCC TTTATT ATC GGC TGC CTC GCC TGG GTA TAT ATG ATA TAC GAG CTC TGG GCA GGC GAA GGA MG AGTGCT TGC AAC ACA GCT AGC CCT GCG GTC CAG TOG GCC TAC AAC ACA ATG ATG TAT ATT ATC ATCTTC GGC TGG GCG ATA TAT CCT GTG GGC TAC TTC ACC GGT TAC TTG ATG GGC GAC GGG GGA AGTGCG CTT MT TTA AAC CTT ATT TAT AAC CTC GCC GAT TTC GTG AAC AM ATT TTA TTT GGC CTGATT ATC TGG MC GTC GCT GTC AM GAA TCA AGC MC GCC TM TAG TGA GGA TOC ACT AGT M-3‘。
4.权限I中表达变形紫色红质基因的方式是将该基因克隆入表达载体质粒，比如pSG5质粒，或BABE反转录表达质粒，然后使用转染方法，比如脂质体介导的方法导入细胞。如使用反转录载体，可以筛选整合该基因和带抗性基因的细胞克隆。该基因可以在细胞内短时间或长时间表达。
5.权限I中光照条件为可见光，光强范围1-50001UX。最适光强范围25-lOOOlux。
6.权限I中光照时间为12小时至14天。最适光照时间为24小时至7天。
7.权限I中待测化合物是天然产物或合成化合物。使用权限I筛出的阳性物质包括维生素C，叔丁基对苯二酚(TBHQ)。
8.使用权限I筛选出的阳性物质，可以用于抗衰老和治疗衰老引起的疾病，包括神经退行性疾病。
全文摘要
本发明建立了一种利用线粒体内膜表达变形紫色红质筛选淬灭自由基的活性物质和抗衰老保健品和药物的方法。该方法使用人造变形紫色红质基因，在动物细胞内表达后进入线粒体内膜，在光照条件下使线粒体内膜产生跨膜质子浓度差。利用该基因可以制造出受外源光照定量控制的促使线粒体内源产生自由基的细胞模型。该模型可以用于抗衰老产品的开发。
文档编号C07K14/00GK102952796SQ201110242410
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月23日 优先权日2011年8月23日
发明者宋青, 姚文清, 李芳 , 张雯景, 王丹阳, 周陆军, 柯翰中, 张怀 申请人:北京科技大学